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문제 정의
- 본 실험은 가시오갈피에 있어서 체세포배를 이용한 대량증식체계 확립을 위한 연구의 일환으로 현탁배양 체세포 배의 저온저장에 영향을 주는 체세포배의 발달단계와 접종 밀도 등의 적정 조건과 저장 시기를 구명하고 유전자원의 장기적인 보존 및 효과적인 식물체의 재분화를 위해 수행되 었다.
제안 방법
- 4℃에서 15개월 간 저온저장된 배발생세포와 발아단계의 체세포배를 대상으로 10 g/C 의 설탕을 첨가한 1/3 MS 액체배지와 10 g/C 의 설탕과 2.5 g/C 의 gelrite를 첨가한 1/3 MS 고체배지에 옮겨 21 ±1 ℃의 배양실에서 배양하여 배의 발달 및 성장이 회복되는 정도를 조사하였다. 4℃에서 36개월간 저온저장 한 구형배로부터 배발생세포의 유도를 위하여 저온 저장한 150개에서 200개 사이의 구형배를 생장조절물질을 첨가하지 않거나 0.
- 5 g/C 의 gelrite를 첨가한 1/3 MS 고체배지에 옮겨 21 ±1 ℃의 배양실에서 배양하여 배의 발달 및 성장이 회복되는 정도를 조사하였다. 4℃에서 36개월간 저온저장 한 구형배로부터 배발생세포의 유도를 위하여 저온 저장한 150개에서 200개 사이의 구형배를 생장조절물질을 첨가하지 않거나 0.2 mg/e 의 2.4-D (2,4_dichlorophenoxy acetic acid)를 첨가한 MS 액체배지에 접종하여 21±1℃와 32±1℃로 배양온도를 달리하여 암상태에서 100 rpm의 회전속도로 현탁배양하였다. 배양은 50 就의 액체배지가 들어있는 250 m2 삼각플라스크에서 진행하였으며, 계대배양 없이 6주 동안 배양한 후 구형배로부터 배발생 캘러스 형성율과 증식속도를 비교하였다.
- 배양용기는 70 M의 고체배지가 들어있는 350 ㎖ 플라스틱 배양 용기를 사용하였고 용기당 10개의 유식물체를 치상하였다. 배양용기에서 형성된 완전식물체를 상토 (Klasmann, Germany) 7} 담긴 플라스틱상자 (35 x 55 x 15 cm) 에 정식하여 투명비닐로 밀폐시켜 순화하였다. 순화는 광 (50% 차광막), 온도 (10℃)와 습도조절 (60%)로 조절된 시설에서 실시하였다.
- 4-D (2,4_dichlorophenoxy acetic acid)를 첨가한 MS 액체배지에 접종하여 21±1℃와 32±1℃로 배양온도를 달리하여 암상태에서 100 rpm의 회전속도로 현탁배양하였다. 배양은 50 就의 액체배지가 들어있는 250 m2 삼각플라스크에서 진행하였으며, 계대배양 없이 6주 동안 배양한 후 구형배로부터 배발생 캘러스 형성율과 증식속도를 비교하였다.
- 저온저장 된 구형 체세포배로부터 배발생캘러스의 유도에 있어서 온도 및 2, 4-1)의 영향을 조사하였다. 50 ㎖의 액체배지가 들어있는 250 ㎖ 삼각플라스크에 구형배 150~200개를 접종하여 온도(22, 32℃) 및 2, 4-D의 첨가 유무 (0.
- 저온저장을 위한 배양조직은 각 생장단계에 따라 배발생 세포, 구형배와 발아초기의 체세포배로 구분하여 새로운 배지로 계대배양하여 10 g/2의 설탕을 첨가한 50 ㎖의 1/3 MS 액체배지가 들어있는 250 ㎖의 삼각플라스크에서 배양 3일 후에 삼각플라스크를 4 ℃ (LG MIC0M 제어시스템, CA-B17AYZ), 암상태에서 저장하였다. 체세포배 접종밀도가 저온저장에 주는 영향을 조사하기 위하여 각각의 삼각플라스크에 배발생세포와 구형배는 100 mg과 500 mg, 발아초기단계의 체세포배는 500 mg과 5 g을 각각 접종하였다.
- 체세포배 접종밀도가 저온저장에 주는 영향을 조사하기 위하여 각각의 삼각플라스크에 배발생세포와 구형배는 100 mg과 500 mg, 발아초기단계의 체세포배는 500 mg과 5 g을 각각 접종하였다.
- 체세포배발생을 이용한 가시오갈피 대량증식체계 확립을 위하여 저온처리에 의한 체세포배의 장기저장 실험을 수행하였다. 현탁배양 체세포배의 4℃에서의 저온저장에는 구형배 이전의 조기단계의 체세포배가 적합하였고 2 g/ ℓ이하의 낮은 접종밀도에서는 36개월 이상 저장이 가능하였다.
- 체세포배의 저온처리 이후에 형성된 가시오갈피 배발생 세포와 2차배를 통하여 액체배양 내에서 유식물체를 직접 유기하였으며 배양된 유식물체는 10g/ℓ의 설탕과 0.25% 의 gelrite를 첨가한 1/3 MS 고체배지가 들어있는 500 ㎖ 플라스틱 배양용기에 용기당 50~100개씩 담아 4℃의 저온 생장상에 저장하면서 재분화를 수행하였다. 배양용기는 70 M의 고체배지가 들어있는 350 ㎖ 플라스틱 배양 용기를 사용하였고 용기당 10개의 유식물체를 치상하였다.
대상 데이터
- 25% 의 gelrite를 첨가한 1/3 MS 고체배지가 들어있는 500 ㎖ 플라스틱 배양용기에 용기당 50~100개씩 담아 4℃의 저온 생장상에 저장하면서 재분화를 수행하였다. 배양용기는 70 M의 고체배지가 들어있는 350 ㎖ 플라스틱 배양 용기를 사용하였고 용기당 10개의 유식물체를 치상하였다. 배양용기에서 형성된 완전식물체를 상토 (Klasmann, Germany) 7} 담긴 플라스틱상자 (35 x 55 x 15 cm) 에 정식하여 투명비닐로 밀폐시켜 순화하였다.
성능/효과
- 가시오갈피 체세포배의 저온저장 조건을 찾기 위하여 상온에서 현탁배양 중인 배발생세포, 구형배, 발아초기의 체세포배를 4℃에 저온 저장한 결과 저온상태에서의 생존력은 체세포배의 발달단계와 접종밀도에 따라 큰 차이를 나타냈다. 구형 체세포배는 접종밀도의 영향을 크게 받지 않고 2 g/ℓ과 10 g/ℓ의 접종밀도에서 모두 1년 이상 저온저장이 가능하였다.
- 배발생 세포와 발아초기의 체세포 배는 접종밀도에 따라 큰 차이를 보여 10 g/C 의 높은 접종 밀도에서는 저온저장 1~2주 후부터 심하게 갈변되기 시작하여 (Figure 1 A, B) 저온 저장 시 체세포배의 접종량이 저온저장에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 또한 체세포배를 저온에서 안정하게 장기보존할 수 있는 적정 접종밀도는 배 발생 세포와 발아초기 의 체세포배 는 2 g/ℓ, 구형배는 10g/C 이하가적합한것으로 나타났다.
- 구형 체세포배는 접종밀도의 영향을 크게 받지 않고 2 g/ℓ과 10 g/ℓ의 접종밀도에서 모두 1년 이상 저온저장이 가능하였다. 배발생 세포와 발아초기의 체세포 배는 접종밀도에 따라 큰 차이를 보여 10 g/C 의 높은 접종 밀도에서는 저온저장 1~2주 후부터 심하게 갈변되기 시작하여 (Figure 1 A, B) 저온 저장 시 체세포배의 접종량이 저온저장에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 또한 체세포배를 저온에서 안정하게 장기보존할 수 있는 적정 접종밀도는 배 발생 세포와 발아초기 의 체세포배 는 2 g/ℓ, 구형배는 10g/C 이하가적합한것으로 나타났다.
- 배발생세포의 경우, 저장가능기간은 15개월까지 안정하게 저온저장이 가능한 것으로 나타났으며, 식물체 전환율도 일정한 상태로 유지되었다. 저온저장 후에도 배발생 세포는 증식을 계속하였으나 그 속도에 있어서 상온에서의 배발생 세포의 증식보다 현저하게 낮아 배발생 세포의 증식 속도를 저온에 의해 조절할 수 있을 것으로 사료되어진다.
- 현탁배양 체세포배의 4℃에서의 저온저장에는 구형배 이전의 조기단계의 체세포배가 적합하였고 2 g/ ℓ이하의 낮은 접종밀도에서는 36개월 이상 저장이 가능하였다. 장기간 저온 저장한 체세포배는 상온에 옮긴 후 2D , 4- 를 첨가한 배지에서만 성장을 회복하여 배발생 캘러스를 형 성 하였으며 배 발생 캘러 스의 증식 속도는 배양온도를 32℃ 로 높였을 때에 가장 효율적 이 였다.
- 저온저장 상태에서 기간에 따른 체세포배의 발달 및 생장을 조사한 결과 발아초기의 체세포배 저장 시 4℃에서 2개월까지 연속적으로 배축이 4~5 cm까지 신장하였으며 배축이 일정 부분 신장된 상태로 12개월까지 안정하게 저장이 가능하였고 각 기간에 따라 식물체 전환율도 일정하게 유지되었다 (자료미제시). 저온저장 후 12개월 이후에는 급격히 안정성을 잃고 12개월 이상 저온 저장된 발아 초기의 체세포배를 다시 22 ℃ 의 배양실에 옮겨 배양하면 대부분이 생장을 회복하지 못하고 고사하여 발아초기의 체세포배는 12개월 이상의 저온저장에 적합하지 않은 것으로 판단되었다.
- 유지되었다 (자료미제시). 저온저장 후 12개월 이후에는 급격히 안정성을 잃고 12개월 이상 저온 저장된 발아 초기의 체세포배를 다시 22 ℃ 의 배양실에 옮겨 배양하면 대부분이 생장을 회복하지 못하고 고사하여 발아초기의 체세포배는 12개월 이상의 저온저장에 적합하지 않은 것으로 판단되었다.
- 한편 저온저 장한 구형 배로부터 배발생캘러스의 유도에 2, 4-D의 첨가가 필수적으로 요구되어지고 있어 생장조절물질에 의존하지 않고 배발생 캘러스를 유도해낼 수 있는 배양조건을 찾아보기 위한 연구를 지속적으로 수행하여야 할 것으로 생각된다. 저온저장된 체세포배를 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS배지에 치상하였을시 저온저장된 체세포배로부터 식물체가 성공적으로 분화되었다.
- 증식한 배발생세포 (Fig. 4A)를 생장조절물질을 첨가하지 않은 1/3 MS 고체배지에 옮겨 배양하여 각각 구형, 심장형, 어뢰형의 단계를 거쳐 배양 3개월 후 전부 완전한 식물체로 전환하였으며 (Fig. 4B.C) 재분화 식물체는 안전하게 순화할 수 있었다 (Fig. 4D).
- 현탁배양 체세포배의 4℃에서의 저온저장에는 구형배 이전의 조기단계의 체세포배가 적합하였고 2 g/ ℓ이하의 낮은 접종밀도에서는 36개월 이상 저장이 가능하였다. 장기간 저온 저장한 체세포배는 상온에 옮긴 후 2D , 4- 를 첨가한 배지에서만 성장을 회복하여 배발생 캘러스를 형 성 하였으며 배 발생 캘러 스의 증식 속도는 배양온도를 32℃ 로 높였을 때에 가장 효율적 이 였다.
후속연구
- 생장을 회복하지 못하였다. 각 단계의 최대저온저장 기간을 나타낸 것은 구형배로 나타났으며, 장기저장된 구형배로부터 배발생 캘러스의 유기를 통하여 유전자원으로서의 보존이 가능할 것으로 사료된다.
- 이러한 구형의 체세포배의 저온저장법을 통하여 전처리 및 설비가 요구되어지는 동결보존법에 기인하지 않고 체세포배를 유전자원 및 cell line으로서 안전하게 보존할 수 있을 것으로 사료되어진다. 한편 저온저 장한 구형 배로부터 배발생캘러스의 유도에 2, 4-D의 첨가가 필수적으로 요구되어지고 있어 생장조절물질에 의존하지 않고 배발생 캘러스를 유도해낼 수 있는 배양조건을 찾아보기 위한 연구를 지속적으로 수행하여야 할 것으로 생각된다. 저온저장된 체세포배를 생장조절물질이 첨가되지 않은 MS배지에 치상하였을시 저온저장된 체세포배로부터 식물체가 성공적으로 분화되었다.
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