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문제 정의
- 본 연구에서 저자 등은 gas chromatography(GC)를 이용하여 상추 중에 함유되어 있는 phytol의 정량분석법을 확립하였고, 이를 적용하여 각 5품종 상추의 phytol 함량을 분석함으로써, phytol 함량이 많은 품종을 선별하고자 하였다.
제안 방법
- 분석용 시료액의 여과에는 Supel이ean LC-Si SPE Tubes 3 m/(SUPELCO; Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. GC는 GC-14B(Shimadzu, Japan)로, GC- MS는 HP 6890(Hewlett-Packed, USA)이 부착된 mass spectornieter (HP 5973, Hewlett-Packed Alto, CA, USA)로 측정하였다.
-
GC를 이용한 상추 품종별 phytol 함량 분석.
- 위의 조건으로 GC 를 측정했을 때, phytol의 TMS 유도체의 retention time은 7분 42초였다. Phytol의 동정을 위하여 GC/MS로 분석하였는데, column(HP-5, 30mX0.53 mm IDX1.5 pm, USA) 이외의 모든 분석 조건은 GC 조건과 동일하였다. 이온화는 electron ionization(EI)법을 사용하였으며, 70 eV에서 수행하였다.
- 각 분획으로부터 각각 25 mg씩을취하여, 〃-hexane-EtOAc = 3 : l(6m/)의 용매로 녹인 후 SPE (Supelclean LC-Si SPE 3 m/ tube)로 여과하고 농축하였다.、각 농축액에 {NO-Bis(tirmethylsilyl) acetamide, 95%) 100 叫를 가한 후, 60P의 oven에서 50분 동안 반응시켰다.
- GC에서 분리된 각 peak 성분은 GCCMS의 Hbraiy(Wiley/NBS)f- 사용하여 최종적으로 확인하였다. 각 실험은 3반복으로 수행하였다.
- 1개를 가지고 있다. 따라서 상추의 MeOH 추출물에 대하여 물과 EtOAc로 분배추출하였을 때 100% EtOAc 층으로 이행하였다. Phytol 함유 분획인 EtOAc 분획의 양을 품종에 따라 비교한 결과 Table 1에서 처럼 최저 202mg에서 최고 531 mg 까지 매우 다르게 나타났다.
- Phytol 은 저자 등의 방법"으로 분리하여 사용하였다. 위에서 채집한 5개 품종의 생체시료 각 100g을 80% MeOH 용액(500mM3)로 24시간, 3 번 추출하였다. 얻어진 각 추출물을 감압농축하고, 얻어진 농축액을 EtOAc(100m/X2)와 H20(100m/)S.
- 분배 추출하였다. 이중 phytol을 함유하는 EtOAc 분획을 감압 농축하였다.
- 보아도 일정한 경향을 발견할 수 없었다. 추대시기에 따른 phytol 함량의 차이를 비교하였다. 적치마와 적축면 품종에 대하여 각각 추대시기가 이른 품종과 추대시기가 늦은 품종의 함량을 비교해 보면 적치마의 경우에는 추대가 늦은 품종인 적토마(RS-2)가 추대가 이른 품종인 여름적치마(RS-1) 에 비해 5 배 이상의 높은 함량을 나타냈다.
대상 데이터
- Fhyto冒 TMS화에는 N, O-Bis(triinelhylsilyl)acetarnide 95%(ACROSS, USA> 사용하였다. 분석용 시료액의 여과에는 Supel이ean LC-Si SPE Tubes 3 m/(SUPELCO; Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 상추(Lacft/ca sativa L, )은 2003년 8월 경기도 평택시의 세미니스 코리아 평택 농장에서 재배한 것으로, 채집 당시 판매가 가능할 정도의 성숙 단계였으며, 초장(뿌리 포함)은 약 20-30 cm 정도였다. 색과 주름의 정도에 따라, 청치마(청치마, blue smooth, BS), 적치마(여름적치마, red smooth-1, RS-1), (적토마, red smooth-2, RS-2, 만주대), 적축면(삼선적축면, red rough-1, RR-1), (신불꽃축면, red rough-2, RR-2, 만추대)과 같이 3가지로 분류된 5종의 품종을 실험에 사용하였다.
- Fhyto冒 TMS화에는 N, O-Bis(triinelhylsilyl)acetarnide 95%(ACROSS, USA> 사용하였다. 분석용 시료액의 여과에는 Supel이ean LC-Si SPE Tubes 3 m/(SUPELCO; Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. GC는 GC-14B(Shimadzu, Japan)로, GC- MS는 HP 6890(Hewlett-Packed, USA)이 부착된 mass spectornieter (HP 5973, Hewlett-Packed Alto, CA, USA)로 측정하였다.
- 초장(뿌리 포함)은 약 20-30 cm 정도였다. 색과 주름의 정도에 따라, 청치마(청치마, blue smooth, BS), 적치마(여름적치마, red smooth-1, RS-1), (적토마, red smooth-2, RS-2, 만주대), 적축면(삼선적축면, red rough-1, RR-1), (신불꽃축면, red rough-2, RR-2, 만추대)과 같이 3가지로 분류된 5종의 품종을 실험에 사용하였다.
- 、각 농축액에 {NO-Bis(tirmethylsilyl) acetamide, 95%) 100 叫를 가한 후, 60P의 oven에서 50분 동안 반응시켰다. 여기에 CHC13 100|iZ(HPLC gradeX 첨가하여 분석용 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 이온화는 electron ionization(EI)법을 사용하였으며, 70 eV에서 수행하였다. GC에서 분리된 각 peak 성분은 GCCMS의 Hbraiy(Wiley/NBS)f- 사용하여 최종적으로 확인하였다. 각 실험은 3반복으로 수행하였다.
- 5 pm, USA) 이외의 모든 분석 조건은 GC 조건과 동일하였다. 이온화는 electron ionization(EI)법을 사용하였으며, 70 eV에서 수행하였다. GC에서 분리된 각 peak 성분은 GCCMS의 Hbraiy(Wiley/NBS)f- 사용하여 최종적으로 확인하였다.
성능/효과
- 1), 위에서 확립한 전처리 과정은 매우 유용한 것으로 판단되었다. GC를 이용하여 분석한 phytol의 함량도 품종에 따라 차이가 매우 커서 Table 1과 Fig. 1에서처럼 생체 100 g중에 최저 10.4土0.7 mg에서 최고 99.7土3.1 mg까지로 나타났다.
- Phyt이을 TMS화 시킨 후위에서 기술한 조건으로 GC 분석했을 때, 7분 42초에서 peak가 나타났다. Phytol의 양(x)과 GC에서의 peak 면적 (y) 과의사이에서의 회귀식은 y = 23, 055x+33, 502로 나타났고 회귀계수 (F)은 0.
- 극성 화합물들을 제거하기 위하여 순상 흡착제인 silica gel로 이루어진 여과 tube(SPE, Supelclean LC-Si SPE 3 ml tube)로 여과하였다. n- Hexane과 EtOAc 혼합용매의 비율을 달리해 가며 (兀-hexane- EtOAc =1:0, 10: 1, 7:1, 5: 1, 3:1, 1: 1, 0: 1) 여과액을 검토한 결과 3:1 혼합용매를 silica gel의 양(3 m/)의 2배량인 6 m/를 사용하여 여과했을 때, phytol이 전량 회수되며 극성혼합물의 대부분이 제거되는 것으로 나타났다. 시료에 따라 다소 다르게 나타났으나, EtOAc 분획물의 75-84%가 제거되었다 (Data 미제시).
- 상추의 색에 따른 phytol 함량을 비교해 보면 녹색을 나타내는 청치마(BS)가 생체 100 g당 46.2+2.1 mg 함유하고 있는데 비해, 자주색을 나타내는 다른 4종의 상추에서는 신불꽃축면 (RR-2)에서 최저값인 10.4±0.7mg을, 적토마(RS-2)에서 최고값인 99.7土 3.1 mg을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 따라서 상추의 색에 따른 phytol 함량에 있어서의 일정한 경향은 보이지 않았다.
- 시료에 따라 다소 다르게 나타났으나, EtOAc 분획물의 75-84%가 제거되었다 (Data 미제시). 이렇게 얻어진 phytol 함유분획을 GC로 분석했을 때, phytol이 주위의 다른 peak들과 전혀 겹치지 않는 것으로 나타나(Fig. 1), 위에서 확립한 전처리 과정은 매우 유용한 것으로 판단되었다. GC를 이용하여 분석한 phytol의 함량도 품종에 따라 차이가 매우 커서 Table 1과 Fig.
- 적치마 만추대 품종인 적토마가 생체 100g당 99.7 mg의 함량으로 가장 높은 값을 보였으나, 상추의 색과 모양, 또는 추대 시기에 따른 품종 간의 일정한 상관관계는 보이지 않았다.
- 추대시기에 따른 phytol 함량의 차이를 비교하였다. 적치마와 적축면 품종에 대하여 각각 추대시기가 이른 품종과 추대시기가 늦은 품종의 함량을 비교해 보면 적치마의 경우에는 추대가 늦은 품종인 적토마(RS-2)가 추대가 이른 품종인 여름적치마(RS-1) 에 비해 5 배 이상의 높은 함량을 나타냈다. 하지만 적축면의 경우에는 이와는 반대로 추대가 빠른 품종인 삼선적축면(RR-1)이 만추 대품종인 신불꽃축면 (RR-2)보다 7배 이상의 높은 함량을 갖는 것으로 나타냈다.
- 한편 얻어진 EtOAc 분획을 TLC로 검토한 결과 phytol보다극성이 높은 화합물들이 다량 함유되어 있었다. 극성 화합물들을 제거하기 위하여 순상 흡착제인 silica gel로 이루어진 여과 tube(SPE, Supelclean LC-Si SPE 3 ml tube)로 여과하였다.
후속연구
- 令 우리나라에서 고기를 먹을 때 함께 먹게 되는 상추가 ACAT 활성을 억제하는 phytol을 함유하고 있다는 것은 매우 의미가 있다고 할 수 있다. 따라서, 다양한 품종의 상추에 대하여, 각 품종별 phytol의 함량을 알아봄으로써, phytol 함량이 높은 품종을 선별 섭취하여 동맥경화나 고지혈증의 예방효과를 기대할 수 있을 것이다.
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