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문제 정의
- 알려졌다. 07)본 연구는 식물의 염류조절 현상을 이해하기 위하여 수행되었으며, 주로 뿌리조직의 이온채널을 동정하고 특성을 구명하는데 중점을 두었다. 식물의 뿌리는 토양과 직접 접하고 있으므로 토양중의 염류는 NSCC나 이온 transporterf- 통하여 세포내로 유입된다.
제안 방법
- 그간에 NSCC를 포함한 많은 이온채널의 특성이 연구되었음에도 불구하고 아직까지 토마토에서 NSCC에 대한 활성 특성 및 세포 내에서의 역할에 대해서는 자세히 밝혀져 있지 않다.'© 따라서 본 연구에서는 염류장애와 관련한 토마토의 뿌리조직 활성 변화를 이온채널을 중심으로 조사하면서 5가지의 이온 채널을 동정하였고, 그 중 가장 빈번하게 발견되며 NSCC의한 종류로 파악되는 450 pS 채널의 전기생리학적 특성을 중금속을 이용하여 조사하였다.
- TNSC의 이온 선택성은 지질막을 경계로 이온의 농도를 달리한 비대칭 이온조건에서 측정하였다. 먼저 지질막 양쪽의 이온 농도가 같은 대칭 조건하에서 채널의 활성을 확인한 후, 마이크로 솜을 가한 쪽인 cis chamber에만 50mM의 KC1 또는NaCl를 추가로 첨가하였다.
- 이들 중 450 pS의 전기전도도를 갖는 것이 가장 빈번하게 관측되었으며, 이것은 이 채널의 밀도나 활성이 다른 종류에 비하여 높음을 의미한다. 따라서, 450 pS 채널단백질은 뿌리조직의 생리활성에 중요한 역할을 수행할 것으로 추정되며, 이를 밝히기 위하여 먼저 채널의 특성 및 중금속에 의한 활성 변화를 조사하였다. 이 채널단백질은 음이온보다는 양이온을 선택적으로 통과시키지만 양이온 종류에 대한 선택성은 낮은 것으로 판명되어, 전기전도도가 450 pS인 비선택성 양이온채널(TNSC, tomato nonselective cation channele로 확인하였다.
- 비대칭 이온조건에서 측정하였다. 먼저 지질막 양쪽의 이온 농도가 같은 대칭 조건하에서 채널의 활성을 확인한 후, 마이크로 솜을 가한 쪽인 cis chamber에만 50mM의 KC1 또는NaCl를 추가로 첨가하였다. 막전위를 -40 mV에서 +40 mV까지변화시키며 채널전류를 측정하였을 때, 대칭조건에서와 비교하여 전류-전위 그래프는 음의 방향으로 이동하였다.
- 중금속 이온이 비선택성 양이 온 채널의 활성을 저해한다고 알려진 것项과 같이 2가, 3가의 중금속 이온들은 450 pS TNSC의 활성을 저해하였다. 중금속에 의한 저해효과는 각각의 중금속을 100pM이 되도록 cis chambere] 첨가하였을 때 나타나는 열림확률(open probability, 尸。)의 감소정도로써 측정하였다. TNSC의 정상적인 Po는 음의 막 전위에서 0.
- 1 ng/fil 가 되도록 ds chamber인 컵의 안쪽에 첨가하였다. 채널의 활성은 컵의 안쪽과 바깥쪽인 cis와 trans chamber에 100 mM KC1 와 10 mM HEPES(pH 7.4)를 포함하는 동일한 완충액을 첨가흐} 여 대칭조건을 만들거나, cis chambei에 염류를 추가로 첨가호]는 비대칭 조건에서 측정하였다. Chamber의 cis 쪽은 Ag/ AgCl 전극과 agar/KCl bridge에 의하여 AXOPATCH ID 증폭기 (Axon Instruments, Foster City, CA, USA)의 head-stage와연결하였、다.
- 토마토 뿌리의 이온채널. 토마토 뿌리조직의 생체막에서 분리 한 마이크로솜을 지질이중막에 유입시켜 전기전도도가 800, 500, 450, 265, 155 pS인 다섯 종류의 이온채널을 확인하였다. 이들 중 450 pS의 전기전도도를 갖는 것이 가장 빈번하게 관측되었으며, 이것은 이 채널의 밀도나 활성이 다른 종류에 비하여 높음을 의미한다.
대상 데이터
- 활성측정. 인공지질 이중막을 만들기 위한 인지질은 Avanti Polar Lipids 사로부터 구입하였으며, Cho 등의 방법에 따라 phosphatidyl serine과 phosphatidyl ethanolamine을 n-decane°l] 각각 20mg/m/의 농도가 되도록 녹인 후, 이들을 1 :1의 비율로 혼합하여 제조하였다. 지질 이중막은 Derlin 컵에 만들어진 0.
- 인공지질 이중막을 만들기 위한 인지질은 Avanti Polar Lipids 사로부터 구입하였으며, Cho 등의 방법에 따라 phosphatidyl serine과 phosphatidyl ethanolamine을 n-decane°l] 각각 20mg/m/의 농도가 되도록 녹인 후, 이들을 1 :1의 비율로 혼합하여 제조하였다. 지질 이중막은 Derlin 컵에 만들어진 0.25 mm 직경의 구멍에 인지질을 유리막대로 문질러 형성하였다. 마이크로솜은 단백질 함량이 0.
- 재료. 흥농종묘의 서광토마토(Lycopersz'con esculentum L.; Pink Forcer) 종자를 발아용 스폰지를 이용하여 빛을 주지 않은 상태로 251를 유지하며 증류수에서 약 3-5일간 발아시켰고, 발아 후에는 양액이 담긴 플라스틱 용기에 이식하였다. 양액의 조성은 Cho 등'»의 방법에 따라 제조하였다.
이론/모형
- ; Pink Forcer) 종자를 발아용 스폰지를 이용하여 빛을 주지 않은 상태로 251를 유지하며 증류수에서 약 3-5일간 발아시켰고, 발아 후에는 양액이 담긴 플라스틱 용기에 이식하였다. 양액의 조성은 Cho 등'»의 방법에 따라 제조하였다. 이식한 토마토는 온도를 28-32。(2로 유지하며 약 5주간 온실에서 재배한 후, 뿌리조직을 채취하여 마이크로솜을 분리하였다.
성능/효과
- 중금속에 의한 저해효과는 각각의 중금속을 100pM이 되도록 cis chambere] 첨가하였을 때 나타나는 열림확률(open probability, 尸。)의 감소정도로써 측정하였다. TNSC의 정상적인 Po는 음의 막 전위에서 0.83±0.35로 측정되었으며, AF+과 CcF+은 g 각각 0.65±0.41과 0.67±0.37로 감소시킴으로써 TNSC 활성을 약 20%정도 저해하였다. 이에 비하여, La, +과 Ba2+, ZW+는 강한 저해제로서 TNSC의 활성을 70% 이상 저해하였다(Fig.
- La%에 의한 TNSC의 저해는 다른 중금속들에 의한 채널 활성의 부분적인 저해에 비교하여 매우 확실하게 나타났다. 식물체에서 La, +에 의한 이온채널의 저해효과는 이전의 보고들을 통하여 알려져 있으며, Lewis 등끼은 Arabidopsise 존재하는, Ca2+ 채널과 청색광에 의해 활성화되는 음이온 채널, K+ 채널 등의 활성이 10mM La, +에 의하여 비선택적으로 저해됨을 보여, La3+°] 다양한 이온채널들의 비선택적 저해제임을 확인하였다.
- 식물체에서 NSCC의 역할은 자세히 밝혀지지 않았으나, 다른 이온채널과 마찬가지로 양분의 흡수, 삼투압 조절, 세포 내외부로의 염류이동, 신호전달 등의 생리현상에 관여한다고 알려졌다. 07)본 연구는 식물의 염류조절 현상을 이해하기 위하여 수행되었으며, 주로 뿌리조직의 이온채널을 동정하고 특성을 구명하는데 중점을 두었다.
- 따라서, 450 pS 채널단백질은 뿌리조직의 생리활성에 중요한 역할을 수행할 것으로 추정되며, 이를 밝히기 위하여 먼저 채널의 특성 및 중금속에 의한 활성 변화를 조사하였다. 이 채널단백질은 음이온보다는 양이온을 선택적으로 통과시키지만 양이온 종류에 대한 선택성은 낮은 것으로 판명되어, 전기전도도가 450 pS인 비선택성 양이온채널(TNSC, tomato nonselective cation channele로 확인하였다.
- 토마토 뿌리조직의 생체막에서 분리 한 마이크로솜을 지질이중막에 유입시켜 전기전도도가 800, 500, 450, 265, 155 pS인 다섯 종류의 이온채널을 확인하였다. 이들 중 450 pS의 전기전도도를 갖는 것이 가장 빈번하게 관측되었으며, 이것은 이 채널의 밀도나 활성이 다른 종류에 비하여 높음을 의미한다. 따라서, 450 pS 채널단백질은 뿌리조직의 생리활성에 중요한 역할을 수행할 것으로 추정되며, 이를 밝히기 위하여 먼저 채널의 특성 및 중금속에 의한 활성 변화를 조사하였다.
- 대부분의 중금속은 450 pS TNSC의 활성을 저해하였으나, 중금속에 따라 저해의 형태가 특이적으로 달랐다. 이러한 결과는 각각의 중금속이 TNSC에 대하여 특이적인 결합 부위를 가질 수 있음을 의미하며, 따라서 TNSC의 특성 조사에 이들 중금속 이온들이 효율적인 활성조절제 또는 추적자로써 사용될 수 있음을 시사한다. 나아가 중금속들이 TNSC 뿐만 아니라 다양한 이온채널들의 활성변화에.
- 즉, 채널단백질은 C* cF 에 의하여 최대 전기전도도와 subconductance 사이를 오가는 매우 활발한 flikering 상태를 보였다. 이러한 사실은 채널의 열림시간 분석인 dwell-time distribution에서도 확인되어, 열림의 빈도가 모든 dwell-time 구간에서 일정하였으나, Cd財 첨가시 3 msec 이내의 짧은 열림의 빈도수가 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 6B).
- 이상의 결과를 요약하면, 토마토 뿌리조직에서 다양한 종류의 이온채널과 함께 450 pS의 비선택성 양이온채널을 확인하였다. 이 이온채널은 세 가지 subconductance 상태를 보임으로써 뿌리의 생리활성에 따라 이온의 이동량을 조절할 수 있는 가능성을 갖고 있다.
- 6A). 즉, 채널단백질은 C* cF 에 의하여 최대 전기전도도와 subconductance 사이를 오가는 매우 활발한 flikering 상태를 보였다. 이러한 사실은 채널의 열림시간 분석인 dwell-time distribution에서도 확인되어, 열림의 빈도가 모든 dwell-time 구간에서 일정하였으나, Cd財 첨가시 3 msec 이내의 짧은 열림의 빈도수가 증가함을 확인할 수 있었다(Fig.
- Al, +은 TNSC의 활성을 농도 의존적으로 저해하였다. 채널 활성은 100pM AF+에 의하여 닫힌 상태가 증가하였고, 1.5 mM에서는 RR뿐만 아니라 전기전도도가 감소하였다(Fig. 5). 즉, 높은 농도에서 subconductance 상태의 열림이 자주 관측되었고, 이들의 전기전도도 크기는 257 pS과 450 pS의 중간 정도에서 나타났다.
- 2D 이들 subconductance 상태의 채널 열림은 모두 음의 막전위에서 빈번하게 관측되었다. 한편, 막전위를 단계별로 변화시키며, 각 단계에서 단일채널 전류를 측정하여 막전위 변화에 따른 전류■전위 변화그래프(I-V curve)로 나타냈을 때, 세 가지 subconductance 상태는 모두 직선의 관계를 보였으며, 각 상태의 전기전도도는 105, 257, 450 pS으로 측정되었다(Fig. IB).
후속연구
- 나아가 중금속들이 TNSC 뿐만 아니라 다양한 이온채널들의 활성변화에. 미치는 효과를 전기 생리학적 방법으로 측정한다면 토마토 뿌리 세포의 생리활성변화를 이해하는데 기여할 수 있을 것이다.
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