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문제 정의
- 따라서 이 연구에서는 건강한 성인으로부터 분리된 Lactobacillus 균주들의 시험관내 ADH와 ALDH 활성을 시험하여 이에 관한 기초 자료로 제공하며, 생체내에서 Lactobacillus 섭취에 의한 혈중 알코올 감소를 연구하고자 시행하였다.
제안 방법
- ADH 및 ALDH 활성이 높고 시험관내에서 에탄올 및 acetaldehyde 감소효과가 우수한 Lactobacillus 균주를 쥐에게 급여하여 체내 에탄올 및 초산 수준의 변화를 시험하였다. 5주된 Sprague-Dawley계 웅성 쥐(대한 바이오링크 주식회사)를 실온 25℃ 1℃, 습도 50+5%, 명암 12시간 주기의 일정한 조건에서 고형사료(CJ 주식회사)로 1주간 예비 사육한 다음 시험용으로하였다.
- 조효소액의 단백질 함량은 protein assay kit(10)를 이용하여 측정하였다. ADH 활성은 조효소액의 단백질(mg) 그리고 반응시간 당 생성되는 NADH의 양으로 계산하였으며, ALDH 활성은 조효소액의 단백질(mg) 그리고 반응시간 당 생성되는 NAD(P)H의 양으로 계산하였다.
- 공시시료는 다음과 같이 제조하였다. L. brevis HY7401를 MRS 액체배지에 접종하여 3TC에서 24시간 배양한 후 균체를 생리식염수로 2회 세척하고 다시 생리식염수에 109 cfu/mL 수준이 되도록 현탁하여 공시시료로 하였다. 시험 14일째에 2시간 동안 절식시킨 후 22% 에탄올 용액으로 에탄올 4.
- Ltietobacillus 균주들의 에탄올과 acetaldehyde의 대사 가능성을 시험관내 및 생체내에서 시험하였다. ADH와 ALDH 활성은 L brevis 균주들이 다른 Lactobacillus 균주들과 비교하여 높게 나타났으며, 특히 L.
- 상등액내에 에탄올 함량은 ethanol kit를 사용하여 측정하였다. 그리고 acetaldehyde 감소는 45O|1L의 Lactobacillus 균체 현탁액과 50 |1L°] 50 mM acetaldehyde를 시험관에서 혼합한 다음 에탄올 감소와 동일한 조건에서 반응시킨 후 상등액내에 acetaldehyde 함량을 acetaldehyde kit를 사용하여 측정하였다.
- 1 mM의 4-methylpyrazole을 첨가한 후 100 UL의 조효소액을 첨가하여 25℃ 항온수조에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후 NADH 또는 NADPH의 양을 분광광도계를 이용하여 2S, C, 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 조효소액의 단백질 함량은 protein assay kit(10)를 이용하여 측정하였다.
- brevis HY7401를 MRS 액체배지에 접종하여 3TC에서 24시간 배양한 후 균체를 생리식염수로 2회 세척하고 다시 생리식염수에 109 cfu/mL 수준이 되도록 현탁하여 공시시료로 하였다. 시험 14일째에 2시간 동안 절식시킨 후 22% 에탄올 용액으로 에탄올 4.0 g/kg BW를 강제 경구투여하고, 에탄올 투여 후 시간별로 채혈하여 혈중 에탄올의 양을 측정하였다. 에탄올 투여 6시간 후 채혈이 완료된 다음 에테르로 흡입 마취시켜 개복한 뒤 십이지장부터 공장사이를 절취하여 생리식염수를 이용하여 소장내용물을 회수하고 소장 내용물내 에탄올 및 초산의 양을 측정하였다.
- 시험 기간은 14일로 하고 사료 및 음용수는 자유롭게 섭취시켰다. 시험 기간중에 대조군에는 증류수를, HY7401 군에는 공시시료 1 mL을 1일 1회씩 2주간 각각 강제 경구투여하였다. 공시시료는 다음과 같이 제조하였다.
- 시험관내에서 ADH 및 ADH 활성이 높은 Lactobacillus 균주들의 에탄올 및 acetaldehyde의 감소는 Jokelainen 등(3)의 방법을 수정하여 시행하였다. ADH 및 ALDH 활성 측정과 동일한방법으로 Lactobacillus 균체를 얻은 후 멸균 10() mM potassium phosphate buffer(pH 7.
- 0 g/kg BW를 강제 경구투여하고, 에탄올 투여 후 시간별로 채혈하여 혈중 에탄올의 양을 측정하였다. 에탄올 투여 6시간 후 채혈이 완료된 다음 에테르로 흡입 마취시켜 개복한 뒤 십이지장부터 공장사이를 절취하여 생리식염수를 이용하여 소장내용물을 회수하고 소장 내용물내 에탄올 및 초산의 양을 측정하였다.
- gas chromatography(GC)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 에탄올 투여 후 일정시간이 경과한 후 미정맥으로부터 헤파린이 처리된 모세관으로 100 μL의 혈액을 취하고 여기에 1 mL의 dichloromethane을 가하고 강하게 교반한 후 소량의 무수 N&SQ4 처리하여 수분을 저)거하고 여과하여 혈액내 에탄올 함량 분석에 사용하였다. 또한 소장 내용물도 위와 동일한 방법으로 에탄올 분석용 시료를 제조하였다.
- 혈액 및 소장 내용물내 에탄올 함량은 Kim 등(12)의 방법을 변형하여 gas chromatography(GC)를 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 에탄올 투여 후 일정시간이 경과한 후 미정맥으로부터 헤파린이 처리된 모세관으로 100 μL의 혈액을 취하고 여기에 1 mL의 dichloromethane을 가하고 강하게 교반한 후 소량의 무수 N&SQ4 처리하여 수분을 저)거하고 여과하여 혈액내 에탄올 함량 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- 5주된 Sprague-Dawley계 웅성 쥐(대한 바이오링크 주식회사)를 실온 25℃ 1℃, 습도 50+5%, 명암 12시간 주기의 일정한 조건에서 고형사료(CJ 주식회사)로 1주간 예비 사육한 다음 시험용으로하였다. 쥐는 대조군과 HY7401 군으로 분류하였으며, 각 군은 10마리로 하였다.
- NAD*, NADPL NADH, NADPH, 4-methylpyrazole, dichloromethane, 그리고 NajSQ는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Protein assay kit는 Bio-Rad(USA)로부터 구입하였으며, ethanol kit, acetaldehyde kit, 및 acetic acid kit는 R-Biopharm(Germany)로부터 구입하여 사용하였다.
- 에탄올 정량은Hewlett Packard HP6890 GC를 사용하였으며, 시료는 HPG1512A autosampler를 이용하여 GC에 주입하였다. 검출기는 FID를 사용하였고 이동상 기체로 질소를 사용하였다. 분석에 사용한 column은 DB-Wax(30 mX0.
- 15 gm; Agilent)이었으며, 분석조건은 injector 온도가 200"C, temperature programing으로 55<>C에서 2분간 유지하고, WC/min씩 증가시켜 70℃에서 4분간 유지시켰다. 내부표준 물질로 ethyl acetate를 사용하였다. 한편, 장내용물내 초산 함량은 acetic acid kit를 이용하여 측정하였다.
- 시험에 사용한 Lactobacillus 균주들은 (주)한국야쿠르트 중앙연구소에 보관중인 균주들로서 건강한 성인의 분변에서 분리된 Lactobacillus acidophilus 4균주 (HY77001, HY77002, HY77003, HY77004), Lactobacillus brevis 7균주 (HY7401, HY7402, HY7403, HY7404, HY7405, HY7406, HY7407), Lactobacillus fermentum 5균주(HY33OOL HY33OO2, HY33003, HY33004, HY33005) 그리고 Lactobacillus plantarum 4균주 (HY73001, HY73002, HY73003, HY73004)를 사용하였으며, 그밖에 Lactobacillus reuteri 3균주(HY7701, HY7702, HY7703), Lactobacillus rhanmosus ATCC13075를 사용하였다.
- 또한 소장 내용물도 위와 동일한 방법으로 에탄올 분석용 시료를 제조하였다. 에탄올 정량은Hewlett Packard HP6890 GC를 사용하였으며, 시료는 HPG1512A autosampler를 이용하여 GC에 주입하였다. 검출기는 FID를 사용하였고 이동상 기체로 질소를 사용하였다.
이론/모형
- , USA)를 이용하여 세포를 파쇄하여 조효소액을 얻었다. 조효소액의 ADH와 ALDH 활성시험은 Nosova 등(9)의 방법에 따라 시행하였다. 조효소액의 ADH 활성 은 2.
- 반응이 완료된 후 NADH 또는 NADPH의 양을 분광광도계를 이용하여 2S, C, 340nm에서 흡광도를 측정하였다. 조효소액의 단백질 함량은 protein assay kit(10)를 이용하여 측정하였다. ADH 활성은 조효소액의 단백질(mg) 그리고 반응시간 당 생성되는 NADH의 양으로 계산하였으며, ALDH 활성은 조효소액의 단백질(mg) 그리고 반응시간 당 생성되는 NAD(P)H의 양으로 계산하였다.
성능/효과
- 과량 에탄올(4g/kg BW) 투여에 의해 쥐에서 외관적인 이상 증상은 관찰되지 않았다. 에탄올 투여 전 2주간 증류수를 급여한 대조군과 약 10" cfu/mL 수준의 L. brevis HY74()1 을 급여한 HY7401 군의 에탄올 투여 1시간 후 혈중 에탄올 수준은 각각 1151.4±193과 883.6士 15()mg/L로 에탄올 투여 전 L. brevis HY7401을 급여한 군에서 혈중 에탄올 수준이 낮게 나타났다. 두 군은 모두 에탄올 투여 2시간까지 혈중 에탄올 수준이 증가하였으며.
- brevis HY7401 의 ADH 활성은 약 2.140 nmol NADH/min/mg protein으로 시험혼!; 균주들 중에서 가장 높은 ADH 활성을 나타냈다. 그 이외에 L.
- 시험관내 및 생체내에서 시험하였다. ADH와 ALDH 활성은 L brevis 균주들이 다른 Lactobacillus 균주들과 비교하여 높게 나타났으며, 특히 L. brevis HY74()1 은 가장 높은 ADH와 ALDH 활성을 나타냈다. L.
- 1). ALDH 활성도 시험균들의 ADH 활성을 시험결과와 유사하게 L. brevis 균주들의 활성이 다른 시험 Lcictohaeillus 균주들의 활성보다 높은 것으로 나타났으며. L.
- brevis 균주들의 활성이 다른 시험 Lcictohaeillus 균주들의 활성보다 높은 것으로 나타났으며. L. brevis HY7401 의 ALDH 활성이 가장 높은 것으로 확인되었다(Fig. 2). 그리고 첨가한 co-factor(NAD+ 또는 NADP*)에 따라 종(species)간에 ALDH 활성이 다소 차이가 있었는데, L brevis 균주들과 L.
- brevis HY74()1 은 가장 높은 ADH와 ALDH 활성을 나타냈다. L. brevis HY74O1(IO9 cfu/mL)을 2주간 하루에 ImL 씩 쥐에게 급여한 후 시험 14일째에 에탄올(4g/kg BW/을 경구투여하고 혈중 에탄올 양을 측정한 결과, L. brevis HY7401 급여에 의해 혈종 에탄올 수준이 대조구에 비해 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 에탄올 투여 6시간 후의 혈중 에단올 양이 삭각 1, 195±929(대조군) 그리고 454±150 mg/L(HY740l 군)으로 나타났다.
- rhamnosus는 co-factor로서 NAD*보다는 NADP*를 첨가했을 때 ALDH의 활성이 매우 높게 나타났으며. L. reuteri 균주들은 NADP+보다는 NAD+를 첨가했을 때 비교적 ALDH 활성이 높게 나타났다. 그리고 ALDH 활성이 있는 L fennentum^ L.
- 2). 그리고 첨가한 co-factor(NAD+ 또는 NADP*)에 따라 종(species)간에 ALDH 활성이 다소 차이가 있었는데, L brevis 균주들과 L. rhamnosus는 co-factor로서 NAD*보다는 NADP*를 첨가했을 때 ALDH의 활성이 매우 높게 나타났으며. L.
- 4%로 나타났다. 따라서 시험 균주들의 ADH 및 ALDH 활성과 비교할 때 시험관내에서 에탄올 및 acetaldehyde 감소효과는 시험 균주들의 ADH 및 ALDH 활성과 관련이 있으며, ADH 및 ALDH 활성이 높은 균주들이 시험관내 에탄올 및 acetaldehyde의 감소효과가 높은 것으로 확인되었다. Jokelainen 등(4)도 ADH 활성과 에탄올 감소사이에는 유의적인 상관관계가 존재한다고 하였다.
- 의 acetaldehyde 감소를 시험한 결과, 시험한 모든 Lactobacillus와 Bifidobacterium 균주들이 알코올 섭취 후 대장에서 관찰될 수 있는 5()0 |1M 수준의 acetaldehyde를 효과적으로 대사할 수 있다고 보고하였다. 따라서 위 시험결과들을 종합해볼 때 젖산균의 균주에 따라 차이는 있지만 장내에는 다른 박테리아와 마찬가지로 ADH와 ALDH 활성을 갖고 있는 젖산균이 존재하며, 이 젖산균들은 장내에서 에탄올 및 아세트알데하이드를 효과적으로 대사할 수 있을 것으로 생각된다.
- 또한 L brevis HY7401 급여한 군에서 소장내 에탄올 농노가 대조구와 비교하여 약 1/2 수준이었으며, 초산 농도는 2배 정도 높은 것으로 확인되었다. 따라서 이 연구결과들은 사람으로부터 분리된 L brevis HY7401이 높은 ADH와 ALDH 활성을 갖고 있어 에탄올과 acetaldehyde를대사한다는 것을 의미하고 있다. 또한 L brevis HY7401을 쥐에게 급여함으로써 헐중 에탄올 수준을 낮출 수 있는 것으로 확인되었다.
- 따라서 이 연구에서 얻어진 결과를 종합해 볼때 ADH 및 ALDH 활성이 높은 L. brevis HY74이의 섭취에 의해 쥐에서 혈중 에탄올 수준을 낮출 수 있을 것으로 생각되며. 특히 소장에서 섭취한 에탄올의 흡수를 효과적으로 억제함으로써 과다한 알코올 대사에 의한 간기능 장애와 알코올성 간질환을 예방할 수 있을 것으로 생각된다.
- 에탄올 투여 6시간 후의 혈중 에단올 양이 삭각 1, 195±929(대조군) 그리고 454±150 mg/L(HY740l 군)으로 나타났다. 또한 L brevis HY7401 급여한 군에서 소장내 에탄올 농노가 대조구와 비교하여 약 1/2 수준이었으며, 초산 농도는 2배 정도 높은 것으로 확인되었다. 따라서 이 연구결과들은 사람으로부터 분리된 L brevis HY7401이 높은 ADH와 ALDH 활성을 갖고 있어 에탄올과 acetaldehyde를대사한다는 것을 의미하고 있다.
- 따라서 이 연구결과들은 사람으로부터 분리된 L brevis HY7401이 높은 ADH와 ALDH 활성을 갖고 있어 에탄올과 acetaldehyde를대사한다는 것을 의미하고 있다. 또한 L brevis HY7401을 쥐에게 급여함으로써 헐중 에탄올 수준을 낮출 수 있는 것으로 확인되었다.
- 7%로 에탄올 감소효과가 가장 높은 것으로 나타났다. 또한 acetaldehyde 감소효과에 있어서도 L. brevis HY7401 이 83.1±2.8%로 가장 높았으며, L. brevis HY7402, L. fementum HY33001, L. plantarum HY73OO3, 그리고 L. reuteri HY7703의 감소효과는 각각 75.5 ± 3.5, 40.0 + 2.8, 27.1+3.0. 그리고 22.
- 4). 또한 장내 초산의 농도는 176.2±37.4(대조군) 그리고 303.1±99.3 mg/L(HY740l 군)로 증류수를 급여한 대조군 보다 L. brevis HY7401을 급여한 군에서 장내 초산 함량이 높은 것으로 나타났다. 따라서 장내 에탄올과 초산의 함량을 비교해 볼 때, 급여한 L.
- 보고되고 있으며, 시험관 및 생체내에서 알코올을 acetaldehyde로 산화시킬 수 있는 것으로 보고되고 있다(3, 4, 12,13). 사람의 분변에서 분리된 2()종의 Lactobacillus 균주들과 상업용 Lactobacillus 종균을 이용하여 ADH 및 ALDH 활성을 시험한 결과, 시험한 L. brevis 균주들이 L. acidophilus, L. plantarum, 그리고 L. fennentum 균주들에 비해 ADH 및 ALDH 활성이 매우 높은 것으로 확인되었다. L.
- 시험관내에서 Lactobacillus 균주들에 의한 에탄올 및 acetaldehyde의 감소를 시험한 결과, 시험한 균주에 따라 감소효과에 있어 큰 차이가 있는 것으로 나타났다(Eble 1). 시험균주들의 에탄올의 감소효과는 31-51%이었으며, L.
- 큰 차이가 있는 것으로 나타났다(Eble 1). 시험균주들의 에탄올의 감소효과는 31-51%이었으며, L. brevis HY7401은 51.2± 2.7%로 에탄올 감소효과가 가장 높은 것으로 나타났다. 또한 acetaldehyde 감소효과에 있어서도 L.
- 한편. 에탄올 투여 6시간 후에 채혈한 다음 쥐의 십이지장부터 공장 사이를 절취하여 소장 내용물내 에탄올 및 초산의 양을 측성한 결과, 대조군과 HY74()1군의 장내 에탄올 농도는 각각 3149.3 ± 307.1 과 1371.2 ± 288.1 mg/L로 두 군 모두 혈액내보다 많은 양의 에탄올이 존재하는 것으로 나타났다(Fig. 4). 또한 장내 초산의 농도는 176.
후속연구
- 특히 소장에서 섭취한 에탄올의 흡수를 효과적으로 억제함으로써 과다한 알코올 대사에 의한 간기능 장애와 알코올성 간질환을 예방할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 장내에서 에탄올 산화에 의해 생성된 acetaldehyde 독소를 무해한 물질로 전환시켜 장 및 간질환 발생을 예방할 수 있는 것으로 판단된다.
- brevis HY74이의 섭취에 의해 쥐에서 혈중 에탄올 수준을 낮출 수 있을 것으로 생각되며. 특히 소장에서 섭취한 에탄올의 흡수를 효과적으로 억제함으로써 과다한 알코올 대사에 의한 간기능 장애와 알코올성 간질환을 예방할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 장내에서 에탄올 산화에 의해 생성된 acetaldehyde 독소를 무해한 물질로 전환시켜 장 및 간질환 발생을 예방할 수 있는 것으로 판단된다.
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