선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 또한 유아에게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 유당불내증을 가지고 있는 성인에게도 생균제제로서 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 그러므로 본 연구에서는 선발된 생균제를 기개발된 생균제와의 효능 비교 및 복합배양으로 상호간의 작용에 의한 효능 향상 실험, 그리고 유전자 분석을 통한 신규성 확인 등의 보다 다양한 연구를 통하여 유아의 유익한 장내세균총을 유지 및 개선시킬 수 있는 유아용 생균제로 제품화하고자 한다.
- 따라서 본 실험은 충북에 거주하고 있는 모유, 분유, 두유 수유아로부터 내산성, 내담즙성 및 효소 활성 등의 생균제 특성이 우수한 Bifidobacterium균을 선발하고, 이를 제품화하기 위한 첫 단계로서 분리균주의 생육 특성을 조사하고자 하였다.
- 우유와 함께 섭취된 유산균은 우유 내의 유당을 분해하여 젖산을 만들어 pH를 낮춤으로 서 장내 환경에 있어서 보다 좋은 효과를 나타낼 수 있기 때문에 우유 내에서의 생육 특성이 생균제로 이용하기 위한 우선적 조건이라 볼 수 있다. 따라서 본 연구에서는 선발된 7종의 Bfdobacterium균에 대한 생육특성을 조사하기 위하여 먼저 내산성 및 내담즙성을 비교하였다. pH 2.
- bfdum의 우세가 줄어들면서 매우 적은 분포로 존재하는 다양한 Bifidobacterium균이 성인에 이르기까지 존재하여, 성인의 경우 주로 발견되는 것으로 사료된다. 이와 같은 결과를 통하여 본 연구에서는 영유아의 분변으로부터 다양한 7종의 생균제용 Bfdobacterium균을 선발하였으며, 선발된 균주의 생육 특성을 고려하여 생균제 용 Bifidobacterium균으로 선정하고자 하였다.
제안 방법
- 10% Skim powder(Seoul Milk Co., Seoul, Korea) 용액을 121℃ 에서 15분간 멸균한 후 분리균주를 106-107 cfU/mL 수준으로 접종하여 37oC에서 48시간 동안 혐기적으로 배양하면서, 6시간 간격으로 TPY 평판 배지에 도말하여 우유배지에서의 생육 특성을 조사하였다.
- Kok(16)의 방법에 따라 genus specific PCR primer 로 Bif164와 Bif662(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였고 Table 1에 나타내었다. PCR 반응을 하기 위한 조성으로 target DNA 4L, 10X reaction buffer 2.5 L, 20 mmol MgCl2 1 L, 각각의 100pmol primer 1L, 200 pmol dNTP 1L, Taq DNA polymerase 0.5 L, D.W 14 L를 첨가하였다. PCR(Bio-Rad, Hercules, USA) 조건은 95℃에서 5분간 방치한 다음 95 1분, 60℃ 45초, 72℃ 1분 과정을 35회 반복하여 하였고, 마지막으로 72℃ 10분 동안 방치하였다.
- 그리고 B. psedocatenulatum PBH-29와 B. bifidum PBH-30을 10% skim milk에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양하여 우유에서의 성장능을 비교하였다 (Fig. 5). 두균주 모두 skim milk에서 높은 성장률을 나타내었는데, 48시간 배양 후의 균수에 있어서 B.
- 5로 조정한 다음 분리균주를 접종하여 37℃ 에서 15시간 동안 혐기적으로 배양하면서 5시간 간격으로 TPY 평판 배지에 도 말하여 생육여부를 확인하였다. 그리고 내담즙 성 실험은 분리균주를 0.3%oxgall(Sigma, St. Louis, USA)이 첨가된 TPY broth에 접종하여 37℃ 에서 15시간 동안 혐기적으로 배양하면서 5시간 간격으로 TPY 평판 배지에 도 말하여 생육 여부를 확인하였다.
- 내산성 실험은 TPY broth를 4N HCl로 pH 2.5로 조정한 다음 분리균주를 접종하여 37℃ 에서 15시간 동안 혐기적으로 배양하면서 5시간 간격으로 TPY 평판 배지에 도 말하여 생육여부를 확인하였다. 그리고 내담즙 성 실험은 분리균주를 0.
- 그리고, Bifidobacterium균과 다른 유산균을 구별하는데 이용되는 F6PPK 시험을 통해 42종의 균주 중에서 17종의 균주를 2차 선발하였다. 또한 선발된 17종의 균주는 세포막의 지방산 조성 분석을 이용한 MIDI 방법과 Bfdobacterium genus specific primer를 이용한 PCR 방법으로 균주의 동정 및 확인실험을 수행하였다. F6PPK 시험에 의해 선발된 17균 주 중 최종 7균주가 MIDI 방법에 의해 Bifidobacterium spp로 동정되었는데, B.
- 에 의한 직접적인 저해 이외에 배양배지 조성및 혐기적 배양조건에 의한 영향이 나타날 수 있기 때문에, 병원성균만을 TPY broth에 접종하여 배양한 것과 Bifidobacterium spp.만을 접종하여 배양한 것을 control로 하여 비교하였다.
- 25 mL를 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 1.5 mL hydroxylamine·HCl(13 g/ 100 mL, Sigma, USA)을 첨가하여 실온에서 10분 동안 방치한 다음 Trichloroacetic acid(Merck, USA), 4N HCl ferric chloride (FeCl3 · 6H2O, 5% w/v in 0.1 N HCl, Wako, Japan)을 각각1 mL 을 넣고 잘 섞은 후색의 변화를 관찰하여, 적자 색을 보이는 것은 F6PPK test 양성, 연노란색은 음성으로 판별하였다.
- 분리균주와 병원성균은 각각 TPY broth와 LB broth(Difco, Detroit, USA)에 접종한 다음, 37oC에서 각각 49시간, 24시간동안 배양하였다. 배양된 분리균주와 병원성 균을 새로운 TPY broth에 함께 접종하여 37℃ 에서 24시간 동안 혐기배양하면서 3시간 간격으로 각각의 선택배지에도말하였다.
- W 1 L)에 취하여 즉시 운반하였다. 운반된 분변 1g을 혐기희석액(KH2PO4(Shnyo, Japan) 4.5g, Na2HPO4 (TEDIA, USA) 6 g, L-cystein - HCl(Sigma, USA) 0.5 g, Tween 80(Junsei, Japan) 0.5 g, agar 1 g, D.W 1 L)에 십진희석한 후 BS 평판 배지에 도 말하여 anaerobic jar(N2: 85%, CO2: 10%, H2: 5%, Mart, Holland)에서 37℃, 48시간 배양하였다. BS 평판배지에서 brown-colony, gram positive, V자 또는 Y자 모양의 morphology 를 나타내면 Bifidobacterium 균으로 분리 하였다(13, 15).
- Louis, USA)를 3mL 첨가하여 다시 원심분리하였다. 이때 회수된 pellete saponification, methylation, extraction 및 wash-ing의 4단계를 거쳐 세포막 지방산을 추출한 다음 MIDI를 통하여 동정하였다.
- 충북지역에 거주하는 1세 미만의 영유아 20명의 분변을 수집하여 mitsuoka 방법(14)과 Bergey's manual(13)에 따라 Bifido-bacterium 균주를 분리하였는데, 먼저 Bifidobacterium균의 선택배지인 BS배지에서 배양된 brown-colony를 선별한 다음, 그람염색을 하고 현미경으로 관찰하여 그람 양성 및 Y자 또는 V자, 곤봉형을 나타내는 42종의 1차 균주를 분리하였다. 그리고, Bifidobacterium균과 다른 유산균을 구별하는데 이용되는 F6PPK 시험을 통해 42종의 균주 중에서 17종의 균주를 2차 선발하였다.
대상 데이터
- 1세 미만의 모유수유아, 분유수유아, 두유수유아 각각 10명, 5명, 5명의 분변을 충북대학교병원을 통하여 수집하였고, 수집 직후에는 수송 배지 (BHI broth(Difco, USA) 37 g, yeast extract (Difco, USA) 5 g, agar, Difco, USA) 0.7 g, 0.1% resazurin solution(Sigma, USA) 1 mL, 0.1% hemin solution(Sigma,USA) 5mL, D.W 1 L)에 취하여 즉시 운반하였다. 운반된 분변 1g을 혐기희석액(KH2PO4(Shnyo, Japan) 4.
- Bifidobacterium속의 선택 배지로는 기본 배지로 사용된 BL 배지에 리터당 sodium propionate(Junsei, Japan) 30 g, paromo-mycin(Sigma, USA) 100 mg, neomycin(Sigma, USA) 400 mg, litium chloride(ACROS, USA) 6 g을 첨가하여 만든 BS 배지 (Bifidobacterium selective agar)를 사용하였고 (15), 증균 배지로는 TPY 배지 (trypticase pytone yeast extract medium, Difco,USA)가 사용되었는데, Bergey's manual에서 제시하는 조성대로 조제하여 사용하였다 (13).
- typhimuriume SS 배지(DifCo, Detroit, USA), Staph. aureus는 MSA 배지(Difco, Detroit, US A) 를 각각의 선택 배지로 사용하였다. 이때 병원성 균이 배양되면서 Bifidobacterium spp.
- 본 실험에 사용된 균주로 유아로부터 선별된 균주를 제외한 모든 균주는 한국 유전자은행 (Korean Collection for Type Cultures,KCTC, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 공시균주로 B. longum KCTC 3421는 BL 배지(DifCo, USA)에서, Salmonella typhimurium KCTC 2515와 Staphylococcus aureus KCTC 1916는 TSB 배지(trypticase soy broth, DifCo, USA)에서 각각 일주일마다 계대하여 사용하였다.
- 그리고, Bifidobacterium균과 다른 유산균을 구별하는데 이용되는 F6PPK 시험을 통해 42종의 균주 중에서 17종의 균주를 2차 선발하였다. 또한 선발된 17종의 균주는 세포막의 지방산 조성 분석을 이용한 MIDI 방법과 Bfdobacterium genus specific primer를 이용한 PCR 방법으로 균주의 동정 및 확인실험을 수행하였다.
- bifidum PBH-30이 보다 높은 성장능을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 최종적으로 유아의 분변으로부터 분리 선발한 Bifidobacterium균 중에서 내산성, 내담즙성, 병원성균의 억제능 및 우유에서의 성장능이 높게 나타낸 B. bifidum PBH-30 을 유아용 생균제로 선발하였다. 선발된 B.
- 본 실험에 사용된 균주로 유아로부터 선별된 균주를 제외한 모든 균주는 한국 유전자은행 (Korean Collection for Type Cultures,KCTC, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 공시균주로 B.
이론/모형
- F6PPK test에 사용된 시약과 방법은 Scardovi의 Bergery's man-ual(13)의 방법에 의하여, TPY 액체배지에 균체를 접종한 다음, 37℃에서 48시간 배양한 후 배양액 10mL를 12,000 rpm, 4℃, 15 분간 원심분리하여 배양액을 버리고, phosphate buffer solution(PBS)을 넣고 다시 현탁시킨 다음 원심분리하는 과정을 2회 반복하여 수세하였다. Fructose-6-phosphate phosphoketolase는 extracellular enzyme이기 때문에 mini-bead beater(5,000 rpm, 4℃, 15 min, Biospec, USA)에 의해 세포를 파괴한 후, sodium fluo-ride(NaF, 3mg/mL, Sigma, USA)와 sodium iodoacetate(5 mg/mL, Sigma, USA)를 첨가한 다음 기질로서 sodium fructose-6-phosphate(80 mg/mL, Sigma, USA) 0.
- 이를 12,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 target DNA로 이용하였다. Kok(16)의 방법에 따라 genus specific PCR primer 로 Bif164와 Bif662(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였고 Table 1에 나타내었다. PCR 반응을 하기 위한 조성으로 target DNA 4L, 10X reaction buffer 2.
성능/효과
- 또한 선발된 17종의 균주는 세포막의 지방산 조성 분석을 이용한 MIDI 방법과 Bfdobacterium genus specific primer를 이용한 PCR 방법으로 균주의 동정 및 확인실험을 수행하였다. F6PPK 시험에 의해 선발된 17균 주 중 최종 7균주가 MIDI 방법에 의해 Bifidobacterium spp로 동정되었는데, B. PBH-2는 B. adolescentis로, B. PBH-29는 B. psedocatenulatum으로, B.PBH-30은 B. bifidum으로 동정되었고, B. PBH-34, PBH-36, PBH-38, PBH-39는 모두 B. angulatum으로 동정되었다(Table 1). 그리고 동정되어진 7종의 Bfdobacterium균을 Ruben(17)의 방법에 따라 PCR을 수행한 결과, Bifidobacterium균의 genus spe-cific 16s rRNA를 나타내는 523 bp에서 7균주 모두 양성을 나타내어 Bifidobacterium균으로 확인되었다 (Fig.
- aureus 및 그람음성균의 대표적인 식중독균인 Sal. typhimurium을 억제함에 있어서 높은 효과를 나타내었다 (Fig. 4).
- angulatum으로 동정되었다(Table 1). 그리고 동정되어진 7종의 Bfdobacterium균을 Ruben(17)의 방법에 따라 PCR을 수행한 결과, Bifidobacterium균의 genus spe-cific 16s rRNA를 나타내는 523 bp에서 7균주 모두 양성을 나타내어 Bifidobacterium균으로 확인되었다 (Fig. 1). 그러나 최종선발된 7종의 Bifidobacterium균 중에서 B.
- 5). 두균주 모두 skim milk에서 높은 성장률을 나타내었는데, 48시간 배양 후의 균수에 있어서 B. bifidum PBH-30과 B. psedocatenulatum PBH-29은 각각 109 cfu/g, 108 cfU/g로 최종 잔존하여 B. bifidum PBH-30이 보다 높은 성장능을 보유하고 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 최종적으로 유아의 분변으로부터 분리 선발한 Bifidobacterium균 중에서 내산성, 내담즙성, 병원성균의 억제능 및 우유에서의 성장능이 높게 나타낸 B.
- 3). 따라서 내산성 및 내담즙성 효과가 모두 높게 나타낸 균주로는 B. psedocatenulatum PBH-29와 B. bfum PBH-30이라고 사료되었다.
- 따라서 유아용 생균제는 초기 유아의 장내 세균총을 형성하는 데 많은 도움을 줄 수 있을 뿐만 아니라, 유아가 성장함에 있어서 유익한 세균총의 유지 및 유익한 세균총으로의 변화를 유도하여 최종적으로 성인의 장내세균총에게도 영향을 줄 수 있다. 이러한 생균제는 유아의 생육과 건강에 도움이 될 수 있는 요구르트와 치즈 제품에 이용될 뿐만 아니라, Bifidobacterium속이 첨가된 분유, 아이스크림 등의 다양한 식품에 적용될 수 있어 그 가치가 매우 중요시 되고 있는 실정이다.
- 2). 또한 선발 균주의 내담즙 성 실험하기 위하여 0.3% oxgall 첨가 배지에서 성장능을 실험한 결과, B. bifdum PBH-30이 가장 높게 나왔고, B. adolescentis PBH-2를 제외한 다른균들도 높은 성장률을 보였다 (Fig. 3). 따라서 내산성 및 내담즙성 효과가 모두 높게 나타낸 균주로는 B.
후속연구
- bifidum PBH-30은 기존의 모유 및 분유수유아에서 분리된 것과는 다르게 두유 수유아로부터 분리된 것으로 두유 내에 포함되어 있는 다양한 올리고당을 이용하여 인체 유익한 생리활성물질을 유도할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 유아에게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 유당불내증을 가지고 있는 성인에게도 생균제제로서 이용될 수 있을 것으로 사료된다. 그러므로 본 연구에서는 선발된 생균제를 기개발된 생균제와의 효능 비교 및 복합배양으로 상호간의 작용에 의한 효능 향상 실험, 그리고 유전자 분석을 통한 신규성 확인 등의 보다 다양한 연구를 통하여 유아의 유익한 장내세균총을 유지 및 개선시킬 수 있는 유아용 생균제로 제품화하고자 한다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.