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문제 정의
- 따라서 생약. 한약재의 품질 표준화를 위한 연구가 진행되고 있는데 여기서는 그 하나의 예로서 이뇨, 이질, 해열, 습진, 위출혈 등에 쓰이는 생약재인 고삼(苦蔘, Sophorae Radix)의 품질 표준화를 위해 약전에 규정되어 있는 각종 이화학적 시험과 주성분의 하나인 matrine을 분리하여 이를 지표물질로한 분석법의 개발을 소개하고자 한다.
제안 방법
- Matrine 2.0 mg을 정밀하게 달아 CH2C12 10 ml로 정용하여 200 |lg/ml의 stock solution을 만들고 이를 CH2CI2로 희석시켜 100, 50, 25, 12.5 |lg/ml 농도의 표준용액을 조제하였다. 각 표준용액 10 ㎕를 취하여 HPLC를 실시하여 얻은 chromatogram으로부터 면적을 구한 후 이들 면적과 표준용액의 농도를 변수로 하여 검량선을 작성하였다(Fig.
- 5 |lg/ml 농도의 표준용액을 조제하였다. 각 표준용액 10 ㎕를 취하여 HPLC를 실시하여 얻은 chromatogram으로부터 면적을 구한 후 이들 면적과 표준용액의 농도를 변수로 하여 검량선을 작성하였다(Fig. 1). 이때 회귀 직선 방정식은 y = 3363.
- 5% 이하라는 규정에 적합하였다. 다음 채집한 고삼을 재료로 추출, 분획 및 column chromatography를 실시하여 표준물질인 matrine을 단리 하였다. 이 화합물의 IR data를 보면 3405 cm』에서 N-H, 2936 cm-1에서 C-H에 기 인한 흡수 band 외 에 2800~2700 err"에 multiple peak들은 mzs-quinolizidine에 특징적인 band이며 이 외에도 1605 cm"에서 lactam C = O에 기인하는 강한 흡수 band가 나타나고 있다.
- 9998로 양호한 직선성이 인정되었다. 마쇄한 고삼 검체 2.0g으로부터 추출하여 얻은 엑스에 함유된 matrine의 함량분석을 위하여 HPLC를 실시하였다. 얻어진 chromatogram으로부터 matrine의 peak 면적을 구한 후 상기 회귀직선방정식으로부터 그 함량을 분석하여 결과를 Table I에 나타내었다.
- 선별된 검체들이 약전규격에 적합한지를 평가하기 위하여 약전에 명시된 회분량과 산불용성회분량을 대한약전내 생약시험법에 따라 각각의 :함량을 분석하였다. 선별된 고삼 검체에 대한 확인시험결과 20개 검체 모두 양성으로 확인되었으며, 회분량과 산불용성회분량은 20개 검체중 1개 검체만이 대한약전에 명시된 기준 함량을 초과하는 것으로 나타났다.
- ⑶ 따라서 이 화합물은 matrine 임을 확인하였다. 이상과 같이 분리 확인된 matrine을 지표물질로하여 함량분석을 시도하였다. 고삼으로부터 matrine의 분석법에 관하여 지금까지 보고된 분석법에 관한 문헌조사 결과 TLC 법⑸, HPLC법618) 및 모세관 전기영동법 19, 20)GLC법a 등이 보고되었다.
- 78 분대에서 나타나는 peak와 일치함을 알았다. 이어 표준검량선을 작성하였다(Fig. 1). 이때 회귀직선 방정식은 y = 3363.
- 65 kg을 MeOH로 추출하여 얻은 MeOH엑스를 CH2C12) EtOAc 및 H2O 분획으로 나누었다. 이중 CH2C12 (128.4 g)분획을 silica gel (No. 7734, Merck) column에 걸어 CHKh-MeOH 용매로 기울기 용리(0—10%)시켜 43개의 소분획을 얻었다. 이중 소분획
- 채집한 고삼뿌리 3.65 kg을 MeOH로 추출하여 얻은 MeOH엑스를 CH2C12) EtOAc 및 H2O 분획으로 나누었다. 이중 CH2C12 (128.
- 회분에 묽은염산 25 ml을 조심 하여 넣고 5분간 가만히 끓여 불용성물을 정 량용여과지를 써서 여과하여 취하고 열탕으로 잘 씻어 잔류물을 여과지와 함께 건조한 다음 회분에서와 같은 조작으로 무게를 미리단 사기제 도가니에서 3시간 강열하여 데시케이터(실리카겔)에서 방냉한 다음 그 무게를 정밀하게 달아 산불용성 회분량(%)으로 하였다.
대상 데이터
- 1999년 국내에서 시판되고 있는 고삼을 지역별로 40여 개를, 구입하여 이중 20개를 선별하였다. 선별된 고삼 약 50g씩을 마쇄한 후 검체로 사용하였다.
- 국내에서 시판되고있는 고삼을 지역별로 40여 검체를 구입하여 그중 20개 검체를 선별하였다. 선별된 검체들이 약전규격에 적합한지를 평가하기 위하여 약전에 명시된 회분량과 산불용성회분량을 대한약전내 생약시험법에 따라 각각의 :함량을 분석하였다.
- 선별된 고삼 약 50g씩을 마쇄한 후 검체로 사용하였다.
성능/효과
- 이 화합물의 IR data를 보면 3405 cm』에서 N-H, 2936 cm-1에서 C-H에 기 인한 흡수 band 외 에 2800~2700 err"에 multiple peak들은 mzs-quinolizidine에 특징적인 band이며 이 외에도 1605 cm"에서 lactam C = O에 기인하는 강한 흡수 band가 나타나고 있다.2)다음 mass data는 분자이온 peak가 m/z 248에서 base peak로 나타나고 [M- 1]+으] peak 강도가 77%로 매우 강하게 나타나며, 이 외에도 matrine의 특징적인 peak들이 각각 m/z 219, 205, 192, 177, 150, 137, 136 및 96에서 나타나고 있음을 알 수 있었다# 1R- NMR에서 52.07 (1H, ddd, J=5.4, 10.8, 16.9 Hz)에서 C-14 axial proton이 나타나고, <52.38 (1H, dt, J=4A, 162Hz)에서 doublet of triplets 형태로 C-14 equatorial proton이 나타나고 있으며, 63.03 (1H, dd, J= 12.6, 12.6 Hz)에서 C-17 axial proton이 나타나고 있고, 53.56 (1H, ddd, J = 5.7, 9.4, 9.6 Hz)에서 C-ll axial proton이 나타나고, 54.73 (1H, dd, J = 4.2, 12.6 Hz)에서 C-17 equatorial proton이 나타나고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 l3C-NMR data가 문헌에 보고된 내용과 완전히 일치함을 알 수 있었다.
- 선별된 고삼 검체에 대한 확인시험결과 20개 검체 모두 양성으로 확인되었으며, 회분량과 산불용성회분량은 20개 검체중 1개 검체만이 대한약전에 명시된 기준 함량을 초과하는 것으로 나타났다. 20개 검체의 평균 회분량은 5.00+1.18%, 산불용성회분량은 0.48土0.29%로 나타나(Table I 참조) 대한약전의 기준함량인 회분량 6.0% 이하, 산불용성회분량 1.5% 이하라는 규정에 적합하였다. 다음 채집한 고삼을 재료로 추출, 분획 및 column chromatography를 실시하여 표준물질인 matrine을 단리 하였다.
- 얻어진 chromatogram으로부터 matrine의 peak 면적을 구한 후 상기 회귀직선방정식으로부터 그 함량을 분석하여 결과를 Table I에 나타내었다. Matrine의 평균함량은 0:13土0.06%로 나타나 고삼의 matrine 함량은 0.05% 이상으로 규정한 약전규정 이 적합함을 확인하였다. 그러나 Table I에서 볼 수 있는 바와 같이 matrine 의 함량변이가 매우 심한 것을 알 수 있다.
- 6 Hz)에서 C-17 equatorial proton이 나타나고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 l3C-NMR data가 문헌에 보고된 내용과 완전히 일치함을 알 수 있었다.⑶ 따라서 이 화합물은 matrine 임을 확인하였다.
- 선별된 검체들이 약전규격에 적합한지를 평가하기 위하여 약전에 명시된 회분량과 산불용성회분량을 대한약전내 생약시험법에 따라 각각의 :함량을 분석하였다. 선별된 고삼 검체에 대한 확인시험결과 20개 검체 모두 양성으로 확인되었으며, 회분량과 산불용성회분량은 20개 검체중 1개 검체만이 대한약전에 명시된 기준 함량을 초과하는 것으로 나타났다. 20개 검체의 평균 회분량은 5.
- 고삼으로부터 matrine의 분석법에 관하여 지금까지 보고된 분석법에 관한 문헌조사 결과 TLC 법⑸, HPLC법618) 및 모세관 전기영동법 19, 20)GLC법a 등이 보고되었다. 이들을 검토한 결과 Saito 등의'6)방법에 따라 HPLC법으로 분석하는 것이 적합하였으므로 이들의 분석조건으로 HPLC를 실시 한 결과 Fig. 2와 같은 chromatogram을 얻을 수 있었으며 spike test 결과 matrine은 tR=7.78 분대에서 나타나는 peak와 일치함을 알았다. 이어 표준검량선을 작성하였다(Fig.
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