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문제 정의
- 내충성 검정과 수량성 평가 등 기존의 육종체계와의 연계가 필수적이라 할 수 있다. 따라서 본 연구는 형질전환 벼를 이용하여 약배양 등 기존의 육종체계와 연계함으로써 우량 계통을 조기에 육성할 수 있는 체계를 확립하고자 수행하였다.
- 형질전환 식물체를 직접 이용하기에는 후대에 유전적인 고정 및 포장검정이라는 문제가 대두되는데, 이를 해결하기 위하여 본 연구는 바스타저항성 유전자가 도입된 벼와 직파적응성 계통을 교잡한 후 약배양에 의한 형질전환체 고정 등 기존 육종체계와 연계하여 제초제 저항성 직파적응 계통을 조 기에 육성할 수 있는 체계를 확립하고자 수행하였다. 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성하고자 1999년 동계에 교배된 동진벼 Dsl5 (BarR)/주남벼 등 5조합으로부터 2000년 F1을 양성하고, 이들을 PCR 분석으로 제초제 저항성 유전자 bar 도입을 확인한 후 약배양을 실시하여 얻어진 1, 508개의 재분화 식물체 중 제초제 저항성 유전자가 도입된 169개체 (AJ에서 채종하였다.
제안 방법
- YR23235 조합 R 39립을 2000년 5월 17일 파종, 6월 10일에 이앙하여 F1 개체양성을 하였으며, YR22511 등 4조합 F, 213 립은 2000년 동계온실에서 F, 개체양성을 하였다. F1 식물체에 서 제초제저항성 유전자 도입 여부를 확인하였으며, 이들을 이용하여 형질을 조기에 고정시키고자 약배양을 실시하였다. 약배양은 화분이 1핵기 말〜2핵기 초의 발달단계에 있을 때 이삭을 채취하여 12℃에서 15일간 저온 전처리를 실시한 후, N6-Y2배지에 치상하였다.
- 증폭된 산물은 1XTBE 용액에 ethidium bromide# 함유한 2% agarose 젤에 전기 영동하여 밴드를 확인하였다. 또한 비선택성 제초제인 상업용 Basta를 권장농도인 0.3%로 희석하여 유묘에 엽면살포하고, 10일 후 고사여부를 조사하였다.
- 2 ppm kinetin을 첨가한 배지를 사용하였고 치상후 25 土1 ℃, 암조건을 유지하면서 배양하였다. 식물체 재분화를 위해서는 약치상 후 35〜45일에 N0Y2배지 (pH 5.8)에 0.8% Gelrite, 0.2 ppm IAA, 2 ppm kinetin을 첨가한 배지를 사용하였고 25 ±1 ℃, 1 일 14시간 2, 500 Lux 광조건 하에서 배양하였다. 약배양 에서 재분화된 개체 (A)는 온실에 이앙하여 관행에 준하여 재배한 후 A? 종자를 수확하였다.
- 1999)와 단간 내도 복성이면서 양질 다수성인 밀양165호를 1999/2000년 동계에 온실에 공시하였고 2000년 하계에는 동진 Ds3, 동진 Ds7, 동진 Dsl5, 밀양165호 그리고 직파적응성 양질계통인 밀양178 호를 공시하였다. 제초제저항성 인자 도입을 위해서 공시된 계통들 간에 인공교배를 실시하였다.YR23235 (동진 Ds 15/밀 양165호)조합 F1들은 2000년 하계 포장에, YR22513 (동진벼 Ds7/주남벼) 등 4조합 F1은 2000년 동계 온실에 공시하여 약 배양에 이용하였다.
- PCR 증폭조건은 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분간 35회 반복한 다음 72℃에서 10분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 1XTBE 용액에 ethidium bromide# 함유한 2% agarose 젤에 전기 영동하여 밴드를 확인하였다. 또한 비선택성 제초제인 상업용 Basta를 권장농도인 0.
- 기타 재배법은 영남농업시험장 벼 표준재배법에 준하였다. 포장에 이앙한 후 계통별로 PCR 분석을 이용하여 제초제저항성 계통을 선발하였으며, YR23235Acp31 등 초형, 출수기 등 주요 농업형질이 우수한 7 계통을 선발하여 모본들과 함께 생산력검정 시험에 공시하였다.
- 형질전환체 조기 고정을 위한 약배양은 F, 식물체의 화분이1핵기말~2핵기초 단계인 이삭을 채취하여 polyethylene film 으로 간이 진공포장하여 12℃에서 15일간 저온 전처리를 한 후 약치상을 하였다. 배지는 NuY| 기본배지에 4% maltose를 첨가한 N『Y2배지 (pH 5.
대상 데이터
- 제초제저항성 인자 도입이 확인된 227 개체 중 임실율이 불량한 계통을 제외한 A, 169개체를 채종하였다. YR23235조합 83 계통을 2001년 5월 17일에 파종, 6월 10일에 이앙하여 출 수기 등 주요 농업형질이 우량한 A?21 계통을 선발하였고 이 중 수량 및 도복관련 형질이 우수한 YR23235Acp31 등 7개의 유망계통을 선발하여 생산력검정 시험에 공시하였다.YR22511 등 4 조합 86 계통은 2002년 5월 17일에 파종하고 6월 6일에 이앙하여 그 중 주요농업형질이 우량한 A, 21 계통 을 선발하였다 (Table 3).
- YR23235조합 83 계통을 2001년 5월 17일에 파종, 6월 10일에 이앙하여 출 수기 등 주요 농업형질이 우량한 A?21 계통을 선발하였고 이 중 수량 및 도복관련 형질이 우수한 YR23235Acp31 등 7개의 유망계통을 선발하여 생산력검정 시험에 공시하였다.YR22511 등 4 조합 86 계통은 2002년 5월 17일에 파종하고 6월 6일에 이앙하여 그 중 주요농업형질이 우량한 A, 21 계통 을 선발하였다 (Table 3).
- 제초제저항성 인자 도입을 위해서 공시된 계통들 간에 인공교배를 실시하였다.YR23235 (동진 Ds 15/밀 양165호)조합 F1들은 2000년 하계 포장에, YR22513 (동진벼 Ds7/주남벼) 등 4조합 F1은 2000년 동계 온실에 공시하여 약 배양에 이용하였다.
- YR23235 (동진벼 Dsl5/밀양165호)조합에서 선발된 YR23235Acp31 등 7 계통과 모품종인 동진벼와 주남벼를 2002년 5월 8일에 파종하고, 6월 6일에 30x15 cm 재식거리 로 1주 1본, 난괴법 3 반복으로 이앙하였다. 시비는 N-P2O5- 00 = 11-4.
- YR23235 등 5 조합에 대한 약배양 결과, 재분화 식물체 1, 508 개체를 획득하여 식물체재분화율은 평균 14.2%를 보였으며, 반수체를 제외한 567 개체 중에서 PCR 분석을 이용 제초제저항성 유전자가 도입된 227 개체 (40%)를 선발하였다(Table 2, Figure 1).
- 형질전환체 조기 고정을 위한 약배양은 F, 식물체의 화분이1핵기말~2핵기초 단계인 이삭을 채취하여 polyethylene film 으로 간이 진공포장하여 12℃에서 15일간 저온 전처리를 한 후 약치상을 하였다. 배지는 NuY| 기본배지에 4% maltose를 첨가한 N『Y2배지 (pH 5.8)에 0.5% Gelrite, 2 ppm NAA, 0.2 ppm kinetin을 첨가한 배지를 사용하였고 치상후 25 土1 ℃, 암조건을 유지하면서 배양하였다. 식물체 재분화를 위해서는 약치상 후 35〜45일에 N0Y2배지 (pH 5.
- 온실에서 수확한 YR23235 (동진벼 Dsl5/밀양165호)조합의 A? 세대 288 계통을 2001년 5월 17일에 파종하여 6월 10일에 30x15 cm 재식거리로 1주 1본 이앙하였고 YR22513 (동진벼 Ds7/주남벼) 등 4 조합 A? 279 계통은 2002년 5월 17일에 파종하여 6월 6일에 같은 방법으로 이앙하였다. 기타 재배법은 영남농업시험장 벼 표준재배법에 준하였다.
- 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성하고자 1999년 동계에 교배된 동진벼 Dsl5 (BarR)/주남벼 등 5조합으로부터 2000년 F1을 양성하고, 이들을 PCR 분석으로 제초제 저항성 유전자 bar 도입을 확인한 후 약배양을 실시하여 얻어진 1, 508개의 재분화 식물체 중 제초제 저항성 유전자가 도입된 169개체 (AJ에서 채종하였다. 이들을 2001년 포장에 공시하여 42계통을 선발하고, 2002년에 동진벼 Dsl5 (BarR)/주남벼 조합에서 수량 등 주요 농업형질이 우수한 7계통을 생산력 검정시험에 공시한 결과 제초제 저항성이면서 직파적응성 등 기타 농업 형질이 우수한 YR23235Acp79를 선발하여 밀양 204호로 계통명을 부여하였다. 결과적으로 형질전환체를 이용하여 교배부터 계통선발까지 3년 만에 목적하는 계통을 조기에 육성할 수 있는 생력육종체계가 확립되었다.
- 형질전환 식물체를 직접 이용하기에는 후대에 유전적인 고정 및 포장검정이라는 문제가 대두되는데, 이를 해결하기 위하여 본 연구는 바스타저항성 유전자가 도입된 벼와 직파적응성 계통을 교잡한 후 약배양에 의한 형질전환체 고정 등 기존 육종체계와 연계하여 제초제 저항성 직파적응 계통을 조 기에 육성할 수 있는 체계를 확립하고자 수행하였다. 제초제 저항성 직파적응 계통을 조기에 육성하고자 1999년 동계에 교배된 동진벼 Dsl5 (BarR)/주남벼 등 5조합으로부터 2000년 F1을 양성하고, 이들을 PCR 분석으로 제초제 저항성 유전자 bar 도입을 확인한 후 약배양을 실시하여 얻어진 1, 508개의 재분화 식물체 중 제초제 저항성 유전자가 도입된 169개체 (AJ에서 채종하였다. 이들을 2001년 포장에 공시하여 42계통을 선발하고, 2002년에 동진벼 Dsl5 (BarR)/주남벼 조합에서 수량 등 주요 농업형질이 우수한 7계통을 생산력 검정시험에 공시한 결과 제초제 저항성이면서 직파적응성 등 기타 농업 형질이 우수한 YR23235Acp79를 선발하여 밀양 204호로 계통명을 부여하였다.
- 제초제저항성 유전자 (bar)7\ 선발마커로 있는 Ds 유전자를 형질전환하여 얻은 동진 Dsl5 (Chin et al. 1999)와 단간 내도 복성이면서 양질 다수성인 밀양165호를 1999/2000년 동계에 온실에 공시하였고 2000년 하계에는 동진 Ds3, 동진 Ds7, 동진 Dsl5, 밀양165호 그리고 직파적응성 양질계통인 밀양178 호를 공시하였다. 제초제저항성 인자 도입을 위해서 공시된 계통들 간에 인공교배를 실시하였다.
- 제초제저항성 인자 도입이 확인된 227 개체 중 임실율이 불량한 계통을 제외한 A, 169개체를 채종하였다. YR23235조합 83 계통을 2001년 5월 17일에 파종, 6월 10일에 이앙하여 출 수기 등 주요 농업형질이 우량한 A?21 계통을 선발하였고 이 중 수량 및 도복관련 형질이 우수한 YR23235Acp31 등 7개의 유망계통을 선발하여 생산력검정 시험에 공시하였다.
- 제초제저항성 인자도입 후대 육성을 위하여 1999년 동계에 bar 유전자가 도입된 동진 Ds 15를 모본으로 하고 주남벼를 부본으로 인공교배를 실시하여 39립의 교배립을 획득하였고, 2000년 하계에는 단간 양질 다수성 품종인 주남벼와 직파적응성이며 양질계통인 밀양178호를 모본으로 하고 동진 Ds3, 동진 Ds7, 동진 Ds 15를 부본으로 한 4 조합을 인공교배하여 213 립을 획득하여 총 252립의 F, 종자를 획득하였다 (Table 1).
이론/모형
- Polymerase chain reaction (PCR) 분석을 위하여 잎에서 genomic DNA는 McCouch et al. (1988)의 방법에 따라 추출하였고, Ds-GUS 특이 primer (Foward 5' -TTT TCG CGA TCC AGA CTG AAT GCC CAC AG-3', Reverse 5' -GGT TAA AGT CGA AAT CGG ACG-3')를 사용하였다. PCR 증폭조건은 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분간 35회 반복한 다음 72℃에서 10분간 반응시켰다.
- 온실에서 수확한 YR23235 (동진벼 Dsl5/밀양165호)조합의 A? 세대 288 계통을 2001년 5월 17일에 파종하여 6월 10일에 30x15 cm 재식거리로 1주 1본 이앙하였고 YR22513 (동진벼 Ds7/주남벼) 등 4 조합 A? 279 계통은 2002년 5월 17일에 파종하여 6월 6일에 같은 방법으로 이앙하였다. 기타 재배법은 영남농업시험장 벼 표준재배법에 준하였다. 포장에 이앙한 후 계통별로 PCR 분석을 이용하여 제초제저항성 계통을 선발하였으며, YR23235Acp31 등 초형, 출수기 등 주요 농업형질이 우수한 7 계통을 선발하여 모본들과 함께 생산력검정 시험에 공시하였다.
- 7 kg/10a을 완효성 : 요소=70 : 30%로 혼합하여 전량 기비로 주었다. 기타 재배법은 영남농업시험장 표준 재배법에 준하였으며, 이앙 후 내병성, 출수기, 수량 등 주요 농업형질을 조사하였다.
성능/효과
- 8 cm로 단간, 수수형 초형에 쌀 수량이 557 kg/10a로 모품종인 동진벼 대비 17%, 주남벼 대비 5% 증수되었다. 이 결과를 근거하여 YR23235Acp79 계통은 제초제 저항성 유전자가 도입되었으며 단간 내도복 양질이고, 영남지역 1모작 평야지에서 대표적인 품종인 주남벼와 동진벼에 비하여 수량성이 높은 우수한 계통임을 인정받아 "밀양 204호' 계통명이 부여되었다 (Table4).
- YR23235Acp31 등 7개의 유망계통들에 대한 생산력검정 예비시험 결과, YR23235Acp79 계통은 출수기가 8월 25일로 만생이고 간장은 65.8 cm로 단간, 수수형 초형에 쌀 수량이 557 kg/10a로 모품종인 동진벼 대비 17%, 주남벼 대비 5% 증수되었다. 이 결과를 근거하여 YR23235Acp79 계통은 제초제 저항성 유전자가 도입되었으며 단간 내도복 양질이고, 영남지역 1모작 평야지에서 대표적인 품종인 주남벼와 동진벼에 비하여 수량성이 높은 우수한 계통임을 인정받아 "밀양 204호' 계통명이 부여되었다 (Table4).
- 이들을 2001년 포장에 공시하여 42계통을 선발하고, 2002년에 동진벼 Dsl5 (BarR)/주남벼 조합에서 수량 등 주요 농업형질이 우수한 7계통을 생산력 검정시험에 공시한 결과 제초제 저항성이면서 직파적응성 등 기타 농업 형질이 우수한 YR23235Acp79를 선발하여 밀양 204호로 계통명을 부여하였다. 결과적으로 형질전환체를 이용하여 교배부터 계통선발까지 3년 만에 목적하는 계통을 조기에 육성할 수 있는 생력육종체계가 확립되었다.
후속연구
- “밀양 204호'가 육성된 일련의 과정을 정리하면 Table 5와 같은데, 1999년 동계에 교배를 하여 2002년 동계에 "밀양 204호'로 계통명이 부여될 때까지 걸린 기간이 3년이었다. 본 체계는 동계에 온실을 운영하는 장점을 살리고, F1 세대에서 유전적인 고정을 조기에 이루고자 약배양을 실시하여 얻어진 결과로서, 형질전환식물체를 이용하여 목적하는 계통을 조기에 육성할 수 있는 체계가 확립된 것이며 앞으로 또 다른 형질전환체를 이용한 계통육성에 크게 활용될 것으로 판단된다.
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