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문제 정의
- 보고하였다. 본 연구는 그에 계속된 연구로써 일반적으로 사용하는 제초제 Basta 처리와 PAT assay를 통해 제 초제 저 항성 유전자 phosphinothricin acetyltransferase(PAT) 유전자를 도입 한 현사시 형 질전환체를 조기 에 선발하는 효율적 인 선발 방법을 제시 하고자 하였 던 바, 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- Kanamycin으로 선 발되 어 형 질전환체 로 추정 되는 8개 체 (약 70mm 길 이 )와 비 교 식 물을 각각 제 초제의 최적 선발 농도가 첨가되어 있는 CIM, SIM 및 액아 유도 배 지 에 서 캘 러 스와 부정 아, 액 아가 유도되는 지의 여 부를 조사하였다.
- PAT assay 방법 은 D' Halluin 등의 방법 (1992)을 변형하여 실시하였다. 형질전환된 조직 05g을 1.
- 모든실험의 배 양조건은 온도 25±2℃, 습도 70%, 40/μmol m-2s-1의 냉백색 형 광등으로 1일 16시간 조명하였다.
- Basta는 배지를 고압 멸균한 후 여과 살균하였다. 배양 4주 후 절편체의 생존 유무 및 액아로부터의 줄기 발생을 관찰하여 제초제로 형질전환체를 선발하고 확인할 수 있는 최적의 선발 농도를 결정하였다.
- 배지는 캘러 스 유도 배지 (CIM, callus induction medium, MS medium with l.Omg/L 2, 4-D and 0.2mg/L kinetin, 0.8% Gum-agar), 부정 아 유도 배지 (SIM, adventitious bud induction medium, WPM(Lloyd 와 McCown, 1981)medium with 1.0mg/L zeatin, 0.8% Gum-agar), MS배지 에 BAP 0.2mg/L가 첨가된 액아 유도 배지 이며, 각각 Basta(원액 18%)농도를 0, 0.1, 0.5, 1.0, 3.0mg/L로 처 리하여 CIM, SIM에는 엽절편을, 액아 유도 배지 에는 액아가 1~2개가 붙도록 조제하여 치상하였다. Basta는 배지를 고압 멸균한 후 여과 살균하였다.
- 본 실험에서는 제초제 Basta를 직접 선발매체로의 이용 가능성을 알아보기 위하여 kanamycin 대신 Basta 최소 억제농도인 1.0mg/L를 이용, 형질전환체를 선발하였다. 엽절편과 균주의 2일간 공조배양 뒤균을 제 거 하기 위 한 cefotaxime과 제 초제 Basta를 처리한 CIM에 서 엽 절편으로부터 직 접 제 초제 에 내성을 가지는 캘러스를 유도해 보았으나, 15일 후 거의 모든 엽 절편들이 갈변화되 며 고사되 었다.
- 그러나 재분화된 형질전환체의 2차 선발표지로서 제초제 Basta의 사용은 매우 빠르고 효과적이었다. 약 12~16주동안 증식된 성숙한 기내 형질전환식물체 가운데 임의로 선 발한 8개 체 (약 70mm 길 이 )와 비 교 식 물을 재료로 Basta 1.0mg/L가 첨 가된 CIM, SIM 및 액 아 유도 배지에 4주간 배양하였다. 이 가운데 형질전환된 8개체중 2개 체는 캘 러 스, 부정 아유도 및 액 아유도에 제 초제의 영 향을 받지 않고 가능하여 제초제를 이용한 형질전환체 선발의 가능성을 보였다.
- 정상적인 현사시 3호의 엽절편에 미치는 제초제 Basta 액제(경농주식회사)의 최소 억제 농도를 조사하였다. 배지는 캘러 스 유도 배지 (CIM, callus induction medium, MS medium with l.
대상 데이터
- 기내에서 배양된 현사시 3호의 정아 부분을 MS(Murashige와 Skoog, 1962)배지에 절편체로 이식하여 4~8주간 생 장시 킨 후 재 료로 사용하였다. 모든실험의 배 양조건은 온도 25±2℃, 습도 70%, 40/μmol m-2s-1의 냉백색 형 광등으로 1일 16시간 조명하였다.
- 제초제 저항성 유전자는 독일 Hoechst사에서 인공합성 한 phosphinothricin acetyltransferase 유전자이며 (NCBI Accession NO-A02774), NPT::GUS 선발유전자와 함께 모두 35S-35S-AMV promoter와 Tnos에 부착되어 형질전환용 binary vector에 재조합되어 있으며, 캐나다 식 물 유전공학 연구소 Dr. Keller로부터 분양 받았다. 이 binary vector는 disarmed Tiplasmid(Hoekema et al, 1986)를 가지 고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP90/PAT에 들어 있다.
이론/모형
- 이 binary vector는 disarmed Tiplasmid(Hoekema et al, 1986)를 가지 고 있는 Agrobacterium tumefaciens MP90/PAT에 들어 있다. 한편, 본 실험의 형질전환은 오 등(1999)의 방법에 의해 수행하였다.
성능/효과
- 0mg/L에서는 전혀 캘러스 형성 없이 엽절편이 완전히 고사되었다. 따라서 본 실험 결과, 형질전환체의 엽절편에서 부정아 유도를 위한 제초제의 선발 농도는 캘러스 유도와 마찬가지로 Basta 1.0mg/L이면 충분하다고 생각되었다.
- 0mg/L에서 부정아가 유도되었다는 것은 배양체가 형질전환체 임을 시사한다. 배양 1주 후 형질전환체의 엽절편은 녹색의 캘러스와 부정아가 유도된 반면, 비형질전환체의 엽절편은 부분적으로 흑반점을 보이며 고사되었다. 한편, 형질전환체의 엽절편에서 배양4주 후의 부정아 유도는 저조했지만, 녹색을 띠며 생존되었고, 1차 계대배양 후에는 다수의 부정 아가 유도되었다.
- 그러나 비교식물은 모두 고사되 었다. 선발된 형질전환체의 엽절편 유래 캘러스 형성은 각각 30개 엽절편에서 모두 캘러스가 유도되 어 제초제 무첨가 배지 와 다름없는 유사하였고, 생장도 매우 왕성하였다(Fig. 1). 그러나 비 형 질전환체는 비 교 식물과 마찬가지 로 모든 절편이 백화되 어 고사되 었다.
- 0mg/L를 이용, 형질전환체를 선발하였다. 엽절편과 균주의 2일간 공조배양 뒤균을 제 거 하기 위 한 cefotaxime과 제 초제 Basta를 처리한 CIM에 서 엽 절편으로부터 직 접 제 초제 에 내성을 가지는 캘러스를 유도해 보았으나, 15일 후 거의 모든 엽 절편들이 갈변화되 며 고사되 었다. 이로써 제초제 최 소 억 제 농도를 이 용한 캘 러 스 유도시에는 엽절편의 형질전환된 세포들까지 고사시켰으므로 제초제는 선발 매체로써 적합하지 못하였다.
- 0mg/L가 첨 가된 CIM, SIM 및 액 아 유도 배지에 4주간 배양하였다. 이 가운데 형질전환된 8개체중 2개 체는 캘 러 스, 부정 아유도 및 액 아유도에 제 초제의 영 향을 받지 않고 가능하여 제초제를 이용한 형질전환체 선발의 가능성을 보였다. 그러나 비교식물은 모두 고사되 었다.
- 벼와 같은 단자엽 식물에서는 항생제 kanamycin으로는 선발이 어렵기 때문에 이들은 벼의 형질전환을 위해 제초제 저항성 유전자를 이 용하여 완벽하게 형 질전환된 세포를 선발할 수 있었다는 결과로 bar 유전자가 좋은 선발 표지인 것을 입증하였다. 이상의 결과들은 제초제 저항성 유전자가형질전환의 필수 단계인 선발 과정 에서 선발 표지로 이용될 수 있음을 보여준 것이다. 그리고 식물체내로 multiple 유전자의 도입 등을 목표로 할 때 유전자 재조합으로 제초제 저항성 유전자를 선발 표지로 사용한다면 효과적일 것으로 기대된다 .
- 0mg/L에서는 절편이 모두 백화 현상을 보이며 고사하였다. 이상의 결과로 형질전환된 현사시를 재료로 제 초제 처 리 를 통한 선 발은 Basta 1.0mg/L이면 충분하다고 사료된다.
- 그러나 비 형 질전환체는 비 교 식물과 마찬가지 로 모든 절편이 백화되 어 고사되 었다. 형 질전환체를 이 용한 부정아 유도에서는 모든 엽절편에서 절단면과 주맥 부위에서 부분적으로 연한 갈색, 녹색 또는 적색의 캘러스가 유도되 었고, 절편에 따라서는 줄기도 유도되었다. 비 교구에 서는 Basta 농도 0.
- 형질전환체와 대조식물체의 조효소 추출액을 이용하여 PAT assay를 시도한 결과 대조식물체에는 PAT 효소의 활성 을 볼수 없었으나 형 질전환체 모두 PAT 효소의 활성 을 보였다. PAT에 의해 유리된 CoA는 DTNB와 반응하며 , 동량의 자유 5-thio-2-nitri benzoic acid를 생성하며, 이 화합물 1M은 412nm파장에서 13, 600의 흡광계수를 가진다.
후속연구
- 이상의 결과들은 제초제 저항성 유전자가형질전환의 필수 단계인 선발 과정 에서 선발 표지로 이용될 수 있음을 보여준 것이다. 그리고 식물체내로 multiple 유전자의 도입 등을 목표로 할 때 유전자 재조합으로 제초제 저항성 유전자를 선발 표지로 사용한다면 효과적일 것으로 기대된다 .
- 또한 비형질전환체는 Akama 등(1995)의 결과에서 처럼 제초제만의 처리로 단기간에 제거할 수 있어 저비용으로 형질전환체를 선발하는 효과적 인 방법으로 생각된다. 한편, 제초제 처리로 선발된 개체는 비교 식물과 유사한 생장을 보여주었는데, 차후 포장 이식 등을 통해 계속된 관찰이 요구된다. 기타 제 초제 Basta를 이용한 형질전환체 선발은 여러 식물에서 보고된바 있다.
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