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문제 정의
- 본 연구에서는 인삼 천풍 종자의 부정근 배양계를 이용하여 인삼사포닌의 생산성을 높이기 위한 최 적 조건을 개발하는데 그 목적이 있다. 인삼 부정근의 ginsenosides 함량을 높이기 위하여 생장이 가장 양호한 배지를 선택하여 생리활성물질 유도제로 쓰이는 chitosan과 jasmonic acid을 처리 하여 인삼 부정근의 생장량과 ginsenosides 함량을 조사하였다.
제안 방법
- 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량에 미치는 jasmonic acid(Sigma)의 영향을 조사하고자 jasmonic acid를 stock solution으로 200 mM을 만들어 놓은 후 다시 20 mM로 희석 하여 working solution을 만들어 냉장 보관하여 사용하였다. 실험 처리구는。, 5, 10, 30, 50 mg/L 농도로 처리하였으며 각 처리구는 3반복하여 4주 동안 배양한 후 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량을 측정 하였다.
- 는 2x 로하여 분석하였다. Chromatogram의 각peak는 표준화 사포닌의 chromatography에 의해 동정하고, 각 ginsenosides의 함량은 표준폼과 비교하여 peak height로 계산하였 다. 추출 및 용매 분획 분리 용매로 사용한 메탄올, 에테르, n부탄올 등은 일급시약을 사용하였으며, 액체크로마토그래피의 전개용매인 아세토니 트릴, 증류수, n부탄올, 메탄올 등은 Merck사 HPLC용을 사 용하였다.
- 1과 같은 방법으로 추출하였다. 건조시킨 분말시 료 0.5 g을 취 하 여 80X)에서 메탄올 30 ml로 3회 추출하여 건조시킨 후 메탄올 엑기스를 얻은 다음 에테르로 추출하여 탈지시키고 수포화 〃-부탄올로 3회 추출하여 a부탄 올층을 모두 합하여 증류수로 1회 세척한 후 수층은 버리고 n부탄올층만 건조시킨 후 HPLC용 메탄올 500 ㎕ 에 녹여 0.45 ㎛ millipore syringe filter로 여과하여 10 ㎕ 를 HPLC(Waters)7]에 주입하여 ginsenosides를 분리정량하였다.
- Furuya 등(1970)이 처음으로 인삼 캘러스로부터 ginsenosides^l 분리 . 동정 을 확인하였고, 이 후 각종 regulators, inhibitor, precursor 등에 대한 인삼 캘러스 의 ginsenosides 생 산 특성 (Furuya et al., 1983)을 조사 하였다. 또한 인삼세포 현탁배 양에서 ginsenosides 생 산 특성 을 조사하였다(Furuya et al.
- 인삼 부정 근 생장율은 1/2 SH 액체배지 40 ml를 함유한 100 ml 삼각플라스크에 증식된 인삼 부정근 근단을 2〜3 cm 길이로 잘라내어 5개씩 접종하여 진탕배양기 (100 rpm, 25。로 암상태 하에서 4주간 배양하였다. 수확된 인삼 부정근은 증류수로 세척하고 여과지로 건조시킨 후 생체중(fresh weight)을 측정하였으며, 이들 시료들은 건조시켜 건중량(dry weight)을 측정하였 다.
- 실험처리구는 0, 5, 10, 20, 30 mg/L 농도로 처리하 였으며 각 처 리구는 3반복하여 4주 동안 배양한 후 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량을 측정하 였다.
- 본 연구에서는 인삼 천풍 종자의 부정근 배양계를 이용하여 인삼사포닌의 생산성을 높이기 위한 최 적 조건을 개발하는데 그 목적이 있다. 인삼 부정근의 ginsenosides 함량을 높이기 위하여 생장이 가장 양호한 배지를 선택하여 생리활성물질 유도제로 쓰이는 chitosan과 jasmonic acid을 처리 하여 인삼 부정근의 생장량과 ginsenosides 함량을 조사하였다.
- 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량에 미치는 jasmonic acid(Sigma)의 영향을 조사하고자 jasmonic acid를 stock solution으로 200 mM을 만들어 놓은 후 다시 20 mM로 희석 하여 working solution을 만들어 냉장 보관하여 사용하였다. 실험 처리구는。, 5, 10, 30, 50 mg/L 농도로 처리하였으며 각 처리구는 3반복하여 4주 동안 배양한 후 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides의 함량을 측정 하였다.
대상 데이터
- 천풍(Rzwx ginseng C.A. Meyer “Chun-Poong") 종자의 배 (embryo)로부터 유도한 부정근을 2 mg/L IBA(indole 3-butyric acid)가 첨가된 1/2 SH 액체배지 에서 4주 간격으로 계대배양하면서 실험에 사용하 였다.
- 검출은 Waters R401 Refractive index(RI) 검출기로 정량하여 분석하였다. Column은 Lichrosorb-NH2 column(Merck Co., 10 ㎛, 4mm ID x 250 mm)을 사용하였고 Solvent는 acetonitrile / HQ / n- butanol (80:20:10)을 사용하였으며, flow rate은 0.5 ml /min이 었고, attenuator.는 2x 로하여 분석하였다.
- 사포닌 화합물의 확인 및 정량에 사용된 개별 사포닌 성분인 ginsenosides 표준품(Rgi, Rf, Re, Rd, Rc, Rb、Rbi)은 한국인삼연초연구원에서 분양받은 것 을 사용하였다. 검출은 Waters R401 Refractive index(RI) 검출기로 정량하여 분석하였다.
- Chromatogram의 각peak는 표준화 사포닌의 chromatography에 의해 동정하고, 각 ginsenosides의 함량은 표준폼과 비교하여 peak height로 계산하였 다. 추출 및 용매 분획 분리 용매로 사용한 메탄올, 에테르, n부탄올 등은 일급시약을 사용하였으며, 액체크로마토그래피의 전개용매인 아세토니 트릴, 증류수, n부탄올, 메탄올 등은 Merck사 HPLC용을 사 용하였다.
데이터처리
- 사포닌 화합물의 확인 및 정량에 사용된 개별 사포닌 성분인 ginsenosides 표준품(Rgi, Rf, Re, Rd, Rc, Rb、Rbi)은 한국인삼연초연구원에서 분양받은 것 을 사용하였다. 검출은 Waters R401 Refractive index(RI) 검출기로 정량하여 분석하였다. Column은 Lichrosorb-NH2 column(Merck Co.
이론/모형
- Chitosan은 Young(1982)의 방법 에 따라서, chitosan을 90 ml의 0.1 M acetic acid에 녹인 후, 이 를 30분 동안 원심분리 한 후 상등액을 5MNaOH로 pH8.0으로 맞추어 흰색으로 침전된 chitosan 덩어리를 여과지로 걸러낸 후 증류수로 세척하여 동결건조하 였다. 건조된 chitosan은 0.
- Ginsenosides의 함량은 수포화 *부탄올 추출법인 Ando 등(1971)의 방법을 참조하여 Fig. 1과 같은 방법으로 추출하였다. 건조시킨 분말시 료 0.
성능/효과
- 55 mg/g . DW보다 12.6%정도 높은 ginsenosides 함량을 보였으며 , PD/PT 조성 비율이 control에 비하여 5, 10 mg/L 처 리 구에서 증가하였으나, ginsenosides 생산성 면에서는 5 mg/L 처 리 구에서 가장 높았다(Fig. 3).
- Jasmonic acid(JA)를 인삼 부정근 배양시 배지에 첨가하여 생장과 ginsenosides 생산성 을 확인한 결과 인삼 부정근의 생장은 대조군에 비해 5, 10uM 처 리 구를 제외 한 모든 처 리 구에 서 감소되 었으며 (Fig. 4), ginsenosides 함량은 50 uM 처리구에서 대조군에 비하여 낮은 함량을 보였다. PD/PT의 조성 비율은 JA 처리구에서 증가하였으며 PD 계열중 ginsenosides Rbl함량이 높았던 10uM에서 가장 높았다(Fig.
- 4), ginsenosides 함량은 50 uM 처리구에서 대조군에 비하여 낮은 함량을 보였다. PD/PT의 조성 비율은 JA 처리구에서 증가하였으며 PD 계열중 ginsenosides Rbl함량이 높았던 10uM에서 가장 높았다(Fig. 5).
- 따라서 JA 처리시 생장량이 생산성에 비례하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 인삼 부정근의 ginsenosides의 생산을 위 해서는 JA 10 uM을 첨가하는 것이 가장 효율적일 것으로 판단된다(Fig 5).
- 48 mg /g • DW로 대조구에 비해 약 9%의 함량증대를 가져왔다. 세포내에서 이차대사계를 활성화시키는 중간 신호전달 물질(signal transducer)로 알려진 jasmonic acid를 인삼 부정근 배양에 처리 한 결과 부정근의 생장량은 10 uM 처리구에서 ginsenosides 함량이 가장 양호하였으나, 인삼 부정근의 생장은 다소 억제되었다
- 이 결과는 인삼모상근 배양에서 JA 5, 10 uM 처 리구에 서 생장이 가장 양호하였고 10uM 처 리 구에서 ginsenosides 함량이 높았다는 Park 등(2000)의 보고와 유사하였다.식물의 생장과 발달에 있어 천연 생장조절물질의 개념으로 분류되어 있는 JA는 일반적으로 피자식물에 광범위하게 분포되어 있으며, 나자식물에도 다소 함유되어 있다는 것으로 밝혀졌다. 일반적 으로 상처나 자극이 새로운 단백질의 합성을 유도하기 위해서는 세포막에서 핵으로의 신호전달이 될 수 있어야 하는더], 물리적인 상처자극이 생화학적인 반응을 유도하는 과정에 작용하는 elicitor가 세포벽 성분인 올리고당으로 이들이 상처 자극시 에 식물의 세포벽 에 서 떨어져 나온 것인데, 인위적으로 이것을 상처받지 않은 식물에 처리해주면 단백질 분해효소 저해제 등 여러 방어물질의 합성이 유도된다.
- 이상의 결과를 종합하여 보면 인삼의 부정근에서 ginsenosides의 생산증대을 위해서는 chitosan 5 mg/L 를 첨가하는 것이 가장 효율적일 것으로 판단된 다.
- 따라서 JA 처리시 생장량이 생산성에 비례하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 인삼 부정근의 ginsenosides의 생산을 위 해서는 JA 10 uM을 첨가하는 것이 가장 효율적일 것으로 판단된다(Fig 5). 이 결과는 인삼모상근 배양에서 JA 5, 10 uM 처 리구에 서 생장이 가장 양호하였고 10uM 처 리 구에서 ginsenosides 함량이 높았다는 Park 등(2000)의 보고와 유사하였다.
- 인삼 부정근의 생장과 ginsenosides 함량에 미치는 elicitor의 영향을 조사한 결과 chitosan 처리 구의 생 장 량 은 10 mg /L 에 서 가장 양호하였으며 , ginsenosides의 함량은 5 mg/L 처리 농도에서 14.48 mg /g • DW로 대조구에 비해 약 9%의 함량증대를 가져왔다. 세포내에서 이차대사계를 활성화시키는 중간 신호전달 물질(signal transducer)로 알려진 jasmonic acid를 인삼 부정근 배양에 처리 한 결과 부정근의 생장량은 10 uM 처리구에서 ginsenosides 함량이 가장 양호하였으나, 인삼 부정근의 생장은 다소 억제되었다
- 인삼 부정근의 생장은 chitosan 10 mg/L 처 리구에 서 가장 양호하였으며 30 mg/L 처리구에서 평균 대조구에 비해 낮은 생장률을 보였다(Fig. 2). Ginsenosides의 함량은 5 mg/L 처리구에서 14.
- JA는 호르몬으로 서 생 리적 기능이 있으며, Strukelj 등(1995)은 감자에 1 uM의 JA를 처 리 하여 뿌리의 비대생 장을 가져왔다는 보고가 있으며 , 토마토나 감자에서 단백질 분해효소 저해제의 합성 및 대두에서 저장단백질의 합성을 유도하는데 이러한 단백질들은 상처 자극반응에 의해서도 유도된다고 하였다(Staswick, 1992). 인삼부정근의 경우 뿌리의 생장은 저농도에서는 증가하였고, 고농도에서는 둔화되었으나 함량은 적정 농도에서 증가하는 것으로 미루어 보아 세포의 크기가 증가되면서 생리활성물질의 축적이 증가된 것으로 사료된다.
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