Mancozeb, a polymeric complex of zinc and manganese salts of ethylene bisthiocarbamate (EBDC), is used widely in agriculture as fungicides, insecticides, and herbicides. Mancozeb can be occupationally and environmentally exposed to human and has been reported to induce estrogenic activity, therein i...
Mancozeb, a polymeric complex of zinc and manganese salts of ethylene bisthiocarbamate (EBDC), is used widely in agriculture as fungicides, insecticides, and herbicides. Mancozeb can be occupationally and environmentally exposed to human and has been reported to induce estrogenic activity, therein it is considered as an endocrine disrupter, We investigated the effects of acute exposure of Mancozeb on the immune function in mice. After single oral administration of Mancozeb to female ICR mice, the immunopathological parameters (body- and organ-weight, splenic cellularity hematological parameters), mitogen (Con A, PHA+IL-2, LPS)-induced splenocyte proliferation (SP) and splenic IgM plaque forming cell (PFC). WBC and splenic cellularity were decreased, but liver-, kidney-, and spleen-weight were increased when compared with control group. Splenic IgM PFC against SRBC was slightly lowered. Mitogen-induced proliferation of spleen cells from Mancozeb-treated mice was not signifcantly changed ex vivo, however, SP in vitro were significantly lowered in concentration dependent manner. These results indicate that Mancozeb could affect the immune function in mice.
Mancozeb, a polymeric complex of zinc and manganese salts of ethylene bisthiocarbamate (EBDC), is used widely in agriculture as fungicides, insecticides, and herbicides. Mancozeb can be occupationally and environmentally exposed to human and has been reported to induce estrogenic activity, therein it is considered as an endocrine disrupter, We investigated the effects of acute exposure of Mancozeb on the immune function in mice. After single oral administration of Mancozeb to female ICR mice, the immunopathological parameters (body- and organ-weight, splenic cellularity hematological parameters), mitogen (Con A, PHA+IL-2, LPS)-induced splenocyte proliferation (SP) and splenic IgM plaque forming cell (PFC). WBC and splenic cellularity were decreased, but liver-, kidney-, and spleen-weight were increased when compared with control group. Splenic IgM PFC against SRBC was slightly lowered. Mitogen-induced proliferation of spleen cells from Mancozeb-treated mice was not signifcantly changed ex vivo, however, SP in vitro were significantly lowered in concentration dependent manner. These results indicate that Mancozeb could affect the immune function in mice.
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문제 정의
또한 Mancozeb을 rat에 104주 동안 식이 투여하였을 때 유방종양, 귀암, 간암, 췌장종양, 갑상선종양, 두개골의 뼈육종, 혈액임파망상구의 신형성 등의 증가와I》rat에서 nitrosomethylurea(NMU)로 유발된 췌장암을 촉진한다는 보고丑⑸ 도 있으며 Colosio 등I®은 내분비 계장애물질로 분류되고 있는 Mancozeb을 장기간 직업적으로 노출된 사람에게서 면역계 변화가 약하게 나타난다고 보고하였다. 그러나 Mancozeb의 일반 독성이나 유전독성 및 생식독성 등에 대한 연구결과에 비해 면역계에 미치는 영향에 대한 연구결과는 거의 보고 되지 않아 본 연구에서는 Mancozeb] 생체내의 면역계에 미치는 영향을 체계적으로 검토하기 위하여 Mmcozeb을 일차적으로 급성노출시킨 후 면역병리, 비장 세포의 IgM 용혈반 형성세포수 및 비장세포 증식능을 측정하였다.
제안 방법
측정하였다. 즉, SRBC용액(5乂 IO。cells/m/) 0.5 m2, 기니 픽 보체 0.3 ml, 10% FBS-HBSS 2.0 m2를 혼합한 액 50 W 와 비장세포액cells/mZ) 50 p/를 혼합하여 microchamber 에 35 业씩 주입하고, 바세린과 파라핀을 동량 혼합한 액으로 밀봉하여 37°C에서 1시간 방치한 후 형성되는 PFC수를 현미경하에서 측정하여 비장세포 I"개 중의 PFC수로 환산하여 나타내었다.
침전된 비장 세포를 HBSSS. 2회 원심세척한 후 일정량의 HBSS를 가하여 trypan blue exclusion method®로 세포수를 측정하여 2X106 cells/mZ 의 비장세포액을 만들었다.
)에 취하고 roll mMxer로 혼화한 후 WBC(white blood cell), RBC(red blood cell), HGB (hemoglobin), HCT(hematocrit), MCV(mean corpuscular vol ume), MCH(mean corpuscular hemoglobin), MCHC(mean corpuscular hemoglobin concentration), PLT(platelet)를 Coul ter counter로 측정하였다. Coulter counter는 사용 전에 4C plus® 액으^ WBC, RBC, HGB, HCT PLT값을 표준成용액에 맞게 보정한 후 혈액을 분석하였다.
Ex vivo 실험 - 예비실험에서 산출한 Mancozeb의 LD50 (25.5 飮g, ICR 암컷 마우스, 경구투여)를 기준으로 투여용량을 2, 500, 5, 000, 10, 000 m以kg을 1회 경구투여하여 급성노출시켰다. Mancozeb은 투여직전 차 증류수에 현탁하였으며, 대조군에는 동량의 3차 증류수를 1회 경구투여하였다.
In vitro 실험 -Mancozeb이 비장세포의 증식능에 미치는 영향을 연구하기 위하여 in 0汐0에서 비장세포에 Mancozeb을 농도별로 가하고 T cell mitogen(Con A, PHA와 IL-2) 또는 B cell mitogen(LPS)를 가한 후 3일간 배양하여 비장세포 증식 정도를 MTT assay로 측정한 결과를 Fig. 2와 3에 나타내었다. Fig.
5 飮g, ICR 암컷 마우스, 경구투여)를 기준으로 투여용량을 2, 500, 5, 000, 10, 000 m以kg을 1회 경구투여하여 급성노출시켰다. Mancozeb은 투여직전 차 증류수에 현탁하였으며, 대조군에는 동량의 3차 증류수를 1회 경구투여하였다.
SRBC액 조제 -4°C에 보관된 SRBC를 사용직전에 HBSS으로 3회 원심세척 (2, 500 rpm, 5 min, 4°C)한 후 Hayme's solution 을 이용하여 5X IO’ cells/m/가 되도록 HBSS로 조정하였다.
Splenocytes were cultured with Con A (2 J丄g/m/) for 3 days. Splenocytes proliferation was assessed by MTT assay The results are expressed as the means ±S.D. of 3 separate experiments for 3 mice per treatment.
ex vivo 실험 -Mancozeb을 2, 500, 5, 000, 10, 000mg/kg 용량으로 1회 경구투여하여 급성노출시킨 후 2일 째에 마우스의 비장을 무균적으로 적출하였다. 앞의 in vitro 실험과 동일한 방법으로 조제한 비장세포액 100 B(2X 106 c이0m/)를 96 well flat bottomed plate의 각 w이1에 가하고 30분 동안 배양(37°C, 5% (為)하여 안정시킨 후 LPS(50昭/m/) 또는 Con A(2询m/)를 가하고 10% FBS-RPMI 배지로 200 卩£가 되도록 하여 배양하였 .
내분비계 장애물질로 알려진 Mancozeb을 2, 500, 5, 000, 10, 000 mgZkg 용량으로 1회 경구투여하여 급성노출시킨 후 면역 병리(체중, 장기무게, 비장세포수, 혈액학적 parameter), 비장 세포 중 IgM 용혈반 형성세포수(PFC) 및 mitogen에 대한 비장 세포 증식능에 미치는 영향을 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다. Mancozeb에 급성노출된 경우 투여용량에 차이는 있으나 간장, 신장 및 비장의 중량비가 대조군에 비하여 증가되었고 백혈구 수는 현저히 감소되었으며 혈소판은 약하게 감소하는 경향을 보이고 고농도로 노출시 비장세포수가 유의적으로 감소하였다.
斗. 배양 3일 후에 MTT assay를 이용하여 mitogen에 대한 비장 세포 증식능을 측정하였다.
세포침전물에 RBC lysis buffer를 가하여 적혈구를 용혈시키고 원심분리한 후 상징액을 제거하여 PBS로 2회 원심세척하고 10% FBS-RPMI 배지를 가한 후 viable cell을 trypan blue exclusion method18)5- 측정하여 4><1(沪 c이Is/mZ가 되도록 비장 세포액을 만들었다. 비장세포액 1OOB(2X1()6 cells/m/)를 96 weU flat bottomed plate의 각 well에 가하고 3。분 동안 배양(37°C, 5% C(&)하여 안정시킨 후 Mancozeb의 최종농도가 0, 50, 500, 1, 000, 1, 500, 2, 500 ng/r旬이 되도록 하고 LPS(50 卩以m/), Con A(2 |ig/mZ) 또는 PHA(5 卩g/m/)와 IL-2(0.1 卩她)를 각각 가하여 배양하였고 3일 후에 MTT assay를 이용하여 mitogen에 대한 임파구 증식능을 측정하였다.
적혈구를 용혈시킨 후 원심분리하였다. 상징액을 제거하고 침전된 비장세포에 일정량의 HBSS용액을 가한 후 Turk's solutio수7)으로 세포수를 측정하여 비장세포수를 계산하였다.
세포침전물에 RBC lysis buffer를 가하여 적혈구를 용혈시키고 원심분리한 후 상징액을 제거하여 PBS로 2회 원심세척하고 10% FBS-RPMI 배지를 가한 후 viable cell을 trypan blue exclusion method18)5- 측정하여 4><1(沪 c이Is/mZ가 되도록 비장 세포액을 만들었다. 비장세포액 1OOB(2X1()6 cells/m/)를 96 weU flat bottomed plate의 각 well에 가하고 3。분 동안 배양(37°C, 5% C(&)하여 안정시킨 후 Mancozeb의 최종농도가 0, 50, 500, 1, 000, 1, 500, 2, 500 ng/r旬이 되도록 하고 LPS(50 卩以m/), Con A(2 |ig/mZ) 또는 PHA(5 卩g/m/)와 IL-2(0.
실험동물실의 온도는 21~24°C, 습도는 40~60%로 유지하였고 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.
무균적으로 적출하였다. 앞의 in vitro 실험과 동일한 방법으로 조제한 비장세포액 100 B(2X 106 c이0m/)를 96 well flat bottomed plate의 각 w이1에 가하고 30분 동안 배양(37°C, 5% (為)하여 안정시킨 후 LPS(50昭/m/) 또는 Con A(2询m/)를 가하고 10% FBS-RPMI 배지로 200 卩£가 되도록 하여 배양하였 .斗.
혈액학적 parameter 측정 - 마우스의 안정맥총에서 heparinized capillary(Chase instruments Co.)로 채혈하여 EDTA(K3yl- 들어 있는 시험관(Sherwood medical Co.)에 취하고 roll mMxer로 혼화한 후 WBC(white blood cell), RBC(red blood cell), HGB (hemoglobin), HCT(hematocrit), MCV(mean corpuscular vol ume), MCH(mean corpuscular hemoglobin), MCHC(mean corpuscular hemoglobin concentration), PLT(platelet)를 Coul ter counter로 측정하였다. Coulter counter는 사용 전에 4C plus® 액으^ WBC, RBC, HGB, HCT PLT값을 표준成용액에 맞게 보정한 후 혈액을 분석하였다.
대상 데이터
3〜4주령인 ICR계 암컷 마우스를 유한양행 중앙연구소로부터 분양받아 고형사료(삼양사)와 수돗물을 자유롭게 공급하면서 실험동물실에서 2~3주간 적응시킨 후, 건강상태가 양호한 6〜8주령(25±2g)의 마우스를 선택하여 실험에 사용하였다. 실험동물실의 온도는 21~24°C, 습도는 40~60%로 유지하였고 조명은 12시간 간격으로 조정하였다.
5%, technical grade, Dau Agro Science, France)을 (주)경농에서 공급받아 사용하였고, 시약으로는 Coulter 제품인 Lyse, phosphate buffer; Clenz, Gibco 제품인 RPMI 1640 medium power fetal bovine serum(FBS), antibiotic-antimycotic agent, MEM-nonessential amino acid, sodium bicarbonate, trypan blue, Hank's balanced salt solut- ion(HBSS), guinea pig complement, Sigma 제품인 dimethyl- sulphoxide(DMSO), concanavalin A(Con A), phytohemagglutinin (PHA) lipopolysaccharides(LPS), interleuldn-2(IL-2), 4-(2-hy- droxy ethyl)piperazine-l-ethanesulfonic acid(HEPES), Amresco 제품인 3-(4, 5f-dimethythiazol-2-yl)-2f5-diphenyltetrazoliumbro- mide(MTT)와 Wako 제품인 2-mercaptoethanol, 한국배지사의 sheep red blood cell(SRBC) 등을 사용하였으며 그 외의 시약은 모두 세포배양용 또는 특급을 사용하였다. 기기로는 CO2 incubator(NAPCO, Precision scimtific Inc.), Coulter counter (T-890, Coulter Co.), ELISA microplate reader(ELx800, BIO- TEK instruments Co.) Auto strip washer(ELx800t BIO-TEK instruments Co.) 등을 사용하였다.
면역 및 실험물질 투여 - 비장세포중의 IgM 항체 생성세포수 :plaque forming cell : PFC)를 측정하기 위하여 항원인 면양 적혈구(sheep red blood cell : SRBC)를 한국배지(주)에서 구입하여 4K에 보관하면서 2주 이내에 사용하였다. 사용직전에 PBS 용액으로 3회 원심세척(2, 500 rpm, 5 min, 4°C)한 후 Hayme's solution으로 세포수를 측정한 다음 2X109 cells/mZ가 되도록 PBS용액으로 조정하여 SRBC용액을 만들었다.
실험물질로는 Mancozeb(86.5%, technical grade, Dau Agro Science, France)을 (주)경농에서 공급받아 사용하였고, 시약으로는 Coulter 제품인 Lyse, phosphate buffer; Clenz, Gibco 제품인 RPMI 1640 medium power fetal bovine serum(FBS), antibiotic-antimycotic agent, MEM-nonessential amino acid, sodium bicarbonate, trypan blue, Hank's balanced salt solut- ion(HBSS), guinea pig complement, Sigma 제품인 dimethyl- sulphoxide(DMSO), concanavalin A(Con A), phytohemagglutinin (PHA) lipopolysaccharides(LPS), interleuldn-2(IL-2), 4-(2-hy- droxy ethyl)piperazine-l-ethanesulfonic acid(HEPES), Amresco 제품인 3-(4, 5f-dimethythiazol-2-yl)-2f5-diphenyltetrazoliumbro- mide(MTT)와 Wako 제품인 2-mercaptoethanol, 한국배지사의 sheep red blood cell(SRBC) 등을 사용하였으며 그 외의 시약은 모두 세포배양용 또는 특급을 사용하였다. 기기로는 CO2 incubator(NAPCO, Precision scimtific Inc.
데이터처리
각 실험군의 측정값의 평균과 표준편차를 구하고, 대조군의 실험치와 비교하여 Student's t-test로 유의성을 검정하였다.
이론/모형
SRBC에 대한 IgM PFC수 측정 -Cunningham의 방법】이을 약간 변형시킨 Deyo 등2°)의 방법을 사용하여 비장세포중의 IgM PFC수를 측정하였다. 즉, SRBC용액(5乂 IO。cells/m/) 0.
성능/효과
1과 같才. 2, 500, 5, 000 mg/kg 용량에서는 대조군에 비해 큰 변화가 없었으며 10, 000 mg/kg 용량에서는 대조군보다 유의성있게(p<0.05) 감소하여 고농도로 Mancozeb을 급성노출시 비장세포수가 영향을 받는 것으로 보인다.
6과 같다. Mancozeb 2, 500, 5, 000, 10, 000 mg/kg 투여군의 PFC수가 대조군에 비해 각각 13.3%, 15.9%, 20.2% 정도 감소되는 경향을 나타냈으나 유의성은 보이지 않았다.
Mancozeb에 급성노출된 경우 투여용량에 차이는 있으나 간장, 신장 및 비장의 중량비가 대조군에 비하여 증가되었고 백혈구 수는 현저히 감소되었으며 혈소판은 약하게 감소하는 경향을 보이고 고농도로 노출시 비장세포수가 유의적으로 감소하였다. Mancozeb을 경구적으로 급성노출시킨 비장세포의 증식능은 대조군에 비해 큰 변화가 없었으나, in 勿7m에서 Mancozeb을 처리시에는 T cell mitogen(Con A, PHA와 IL-2)과 B cell mitogen(LPS)에 대한 비장세포 증식능은 농도의존적으로 저하되었다.
Mancozeb에 급성노출된 경우 투여용량에 차이는 있으나 간장, 신장 및 비장의 중량비가 대조군에 비하여 증가되었고 백혈구 수는 현저히 감소되었으며 혈소판은 약하게 감소하는 경향을 보이고 고농도로 노출시 비장세포수가 유의적으로 감소하였다. Mancozeb을 경구적으로 급성노출시킨 비장세포의 증식능은 대조군에 비해 큰 변화가 없었으나, in 勿7m에서 Mancozeb을 처리시에는 T cell mitogen(Con A, PHA와 IL-2)과 B cell mitogen(LPS)에 대한 비장세포 증식능은 농도의존적으로 저하되었다. SRBC 항원주사 후 2일째에 Mancozeb을 투여 했을때 비장세포중 IgM PFC수는 감소되는 경향을 나타내었으나 유의성은 없었다.
Mancozeb을 경구적으로 급성노출시킨 비장세포의 증식능은 대조군에 비해 큰 변화가 없었으나, in 勿7m에서 Mancozeb을 처리시에는 T cell mitogen(Con A, PHA와 IL-2)과 B cell mitogen(LPS)에 대한 비장세포 증식능은 농도의존적으로 저하되었다. SRBC 항원주사 후 2일째에 Mancozeb을 투여 했을때 비장세포중 IgM PFC수는 감소되는 경향을 나타내었으나 유의성은 없었다.
체중과 장기무게를 측정하여 그 결과를 Table I에 나타내었다. 간장의 중량비는 Mancozeb의 모든 용량에서 대조군에 비해 유의성있게(p<0.01) 증가하고 신장의 중량비도 5, 000, 10, 000 m眺g 용량 투여군에서 유의성있게 (p<0.01) 증가하였다. 비장의 중량비는 2, 500, 5, 000 mg/kg에서 증가되었으나 흉선의 중량비는 고농도(10, 000mg/kg)에서 대조군에 비해 유의적인(p<0.
Ol) 감소하였다. 또한 PHA와 T cell 성장인자인 IL-2를 Mancozeb 과 동시에 처리하여 측정한 비장세포 증식능도 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의하게(p<0.01) 감소하였다. Colosio 등16)도 PHA를 투여하여 실험하였을 때 Mancozeb 100, 1, 000ng/m/에서 임파구 증식능을 강하게 억제한다는 보고를 하여 본 실험의 결과와 유사하였다.
본 실험에서 대조군의 순환 말초혈액 내의 혈액학적 분석결과는 Guest 등幻)이 보고한 결과와 유사하였다. 백혈구(WBC)수는 모든 투여용량에서 대조군에 비해 유의성있게(p<0.01) 감소되었으며 혈소판(PLT)은 5, 000mg/kg/day 투여군에서는 대조군에 비해 약간 증가하였으나 유의성은 없었으며 10, 000 mggkg/day 투여군에서는 유의성있게 감소하는 경향을 보였다. 그 외의 parameter에서는 큰 변화가 없었다.
01) 증가하였다. 비장의 중량비는 2, 500, 5, 000 mg/kg에서 증가되었으나 흉선의 중량비는 고농도(10, 000mg/kg)에서 대조군에 비해 유의적인(p<0.05) 감소를 보였다. 체중의 변화는 대조군에 비해 다소 차이는 있으나 유의성 있는 큰 변화를 보이지 않았으며 이는 Kackar 등%] male albino rat에 360일 동안 Mancozeb을 투여한 결과 30일까지는 유의성 있는 체중 변화가 없었으나 360일 후에는 유의성있는 체중증가율의 감소를 보였다는 보고를 볼 때 Mancozeb의 급성노출이 체중에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 보인다.
이상의 결과는 Mancozeb은 급성노출시 면역병리학적 pcira- meter에 변화를 유발하고 비장세포 증식능 및 PFC수를 억제하는 경향을 보여 생체 면역계에 영향을 미칠 수 있음을 시사해 주고 있다.
Colosio 등16)도 PHA를 투여하여 실험하였을 때 Mancozeb 100, 1, 000ng/m/에서 임파구 증식능을 강하게 억제한다는 보고를 하여 본 실험의 결과와 유사하였다. 이상의 결과로, in 0汐0에서 Mancozeb은 T cell mitogen인 Con A 또는 PHA와 IL-2에 대한 임파구 증식 능을 강하게 억제하는 것으로 보인다.
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