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문제 정의
- 본 연구는 우리나라에서 사육되고 있는 순종종돈 York-shire 종 150두, Landrace 종 89두, Duroc 종 80두, 총 319두를 대상으로 모근에서 채취한 DNA를 이용하여 PCR-RFLP 방법으로 스트레스 증후군 유전자인 ryanodine receptor의 품종별 출현율을 검색하여 우량한 종돈을 선발하기 위한 기초적 자료를 얻기 위하여 실시하였다.
- PCR-RFLP방법으로 분석한 결과를 토대로 유전자형 출현빈도가 품종별 모집단에서 Hardy-Weinberg equilibrium상태에 도달했는가의 여부를 조사하였다. 자유도가 1인 상태에서 P=5 % 값은 3.
제안 방법
- 선정된 공시동둘로부터 손상되지 않도록 주의하여 모발을 채취하였고 모근 부위의 genomic DNA의 손상을 방지하기 위하여 100% ethanol에 침지하여 운반한 후 4℃에서 보관하였다.
- 채취 후 4℃에서 보관된 모발을 100% ethanol에 2회 세척한 후 증류수에 1회 세척을 실시하였으며 모근 부위를 절단하여 게놈 DNA 추출용액(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 39 mM DTT, 200uL/mL Proteinase K, 2.0% SDS)을(Uchihi 등, 1992 ; Richards 등, 1993) 약 10개의 모근 당 게놈 DNA 추출용액 500 μℓ을 첨가한 후 56℃에서 18시 간 동안 digestion 하였다. 이후 동량의 phenol/chloroform (1:1)을 첨가한 후 상등액을 회수하였으며, 회수된 상등액에 2.
- 모근을 포함하는 모발에서 추출한 게놈 DNA를 사용하여 RYR 1 유전자의 절편을 증폭하기 위한 프라이머의 염기서열 설정은 RYR 1 유전자의 돌연변이가 위치한 cDNA의 1843번째 염기(Gene Bank accession number : 164647, 1769446, 164645)가 중합효소 연쇄반응 산물내에 포함될 수 있도록 설정하였다. 이러한 prhner쌍은 제 1차 PCR인 primary PCR 증폭과정에 사용된 프라이머는 Table 1에서 나타난 바와 같은 구조로 되어있는 Vogeli 등(1994)이 보고한 프라이머를 사용하였으며, nested PCR에서 사용된 프라이머는 우(2000)와 윤(2003)이 사용한바 있는 primer쌍으로 이는 품종간 또는 개체간에 알려진 돌연변이 염기가 존재하지 않는(Fujii등, 1991) 염기서열을 갖는 부위를 선택하여 사용하였다.
- GeneAmp PCR System 9700 (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, Clifbmia, U.S.A.)을 이용하여 실시하였다. 즉 primaiy PCR의 경우 반응액은 0.
- )을 이용하여 실시하였다. 즉 primaiy PCR의 경우 반응액은 0.5 mt tube에 template DNA, primer P-1 과 P-3을 각각 2.0μℓ, dNTPs 2.0μℓ, MgCl2 최종농도를 1.5 mM로 조절하였고, 10 X buflfbRMg" free) 2.5# 그리고 Taq DNA polymerase 1.25 units를 첨가하여 PCR 반응액을 총 25μℓ로 조정하였다. PCR cyclee denaturation 94℃에서 1 분, annealing 59℃에서 1분 extension에서 72℃ 1분간의 cycle 을 총 35회 반복한 다음 마지막으로 polymeriztion 72℃에서 3분간 가열하고 DNA 증폭과정을 종료하였다.
- Nested PCRe 반응액을 0.5μℓ tube에 template DNA를 primary PCR 산물 2.0μℓ로 사용하였고, primer P-4과 P-5 를 사용하여 PCR 반응액을 총 25μℓ로 조정하고, PCR cyclee denaturation 94℃에서 1분 annealing 47℃에서 30초, extension 에서 72℃ 1분간의 cycle을 총 30회 반복한 다음 마지막으로 polymeriztion 72℃에서 3분간 가열하고 DNA 증폭과정을 종료하였다.
- 증폭된 RYR1 유전자의 돌연변이 검사를 위해 GCGC의 염기서열을 인지하는 제한효소 Cfb I(Promega, WI, USA)을 사용하였다. RYR 1 유전자에 있어 스트레스증후군 유전자는 정상돈의 RYR1 유전자와 비교시 1843번째 염기가 정상돈에서는 시토신으로 존재(GCGC)하나 스트레스증후군의 경우는 돌연변이에 의해 티미딘으로 치환되어(GTGC) 제한효소 I 처리시 정상돈의 RYR 1 유전자 절편은 제한효소에 의하여 절단되나 스트레스증후군 유전자의 경우는 Cfo I 제한효소에 의해 인지되지 못해 절단되지 못한다.
- Cfb I 제한효소 처리는 PCR 증폭산물 15μℓ, Cfo I 효소 5 units, BSA 5 mg을 혼합한 후 37℃에서 6시간 실시하였으며, 제한효소 처리 후 PCR 증폭산물 4μℓ에 해당하는 양을 전기영동 하였다.
- PCR 증폭산물을 확인하기 위하여 1.5% agarose gel을 이용하여 확인하였으며, 전기영동 버퍼는 TAE buffer(40 mM Tris-acetate, 1.0 mM EDTA)를 사용하였으며, Cfb I 제한효소처리 후 RFLP 검사를 위한 경우는 2.0% agarose gel에서 전기영동을 실시하였으며, 전기영동을 실시한 후 UV상에서 유전자형의 검사를 실시하였다. 한편 증폭산물과 제한효소처리 후 절편들의 크기를 측정하기 위하여 size marker로서 1 kb DNA ladder와 100 bp ladder(MBI Fermentas Inc.
- 충남 소재의 S 종돈장과 경기도 소재의 K 종돈장에서 사육되고 있는 순종종돈 Yorkshire 종 150두, Landrace 종 89두, Duroc 종 80두, 총 319두의 종돈 모근을 공시재료로 RYR1 유전자형을 분류하여 분석하였다. 집단내의 Hardy-Weinberg equilibrium 통계분석은 Chi-square test를 이용하여 실시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 공시축은 충남 소재의 s 종돈장과 경기도 소재의 K 종돈장에서 사육되고 있는 순종 Yorkshire 종 150두, Landrace 종 89두, Duroc 종 80두의 총 319두를 공시 축으로 선정하였다.
- 충남 소재의 S 종돈장과 경기도 소재의 K 종돈장에서 사육되고 있는 Yorkshire 종 ]50두, Landrace 종 89두, Duroc 종 80두의 총 319두의 종돈 모근에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 본 연구에서 설정한 중합효소 연쇄반응 및 Cfo I 제한효소처리 후 전기영동상에서 RYR1 좌위의 유전자형 및 유전자 출현 빈도를 분석한 결과는 Table 2와 같다.
데이터처리
- 분류하여 분석하였다. 집단내의 Hardy-Weinberg equilibrium 통계분석은 Chi-square test를 이용하여 실시하였다.
성능/효과
- 이러한 결과는 Table 1에서 보여준 primer(P-l, P-3)를 통하여 예상된 RYR1 부분의 유전자가 증폭되었음을 확인하여 주고 있다. 그러 나 primary PCR을 수행 한 결과, primary PCR 증폭의 효율성이 낮아 증폭이 잘 이루어지지 않은 것으로 사료되었다.
- 2와 같다. 즉 Fig. 2에서 보이는 것과 같이 nested PCR의 증폭산물은 약 522 bp의 단일 밴드로 증폭되었음을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 Table1에서 보여준 primei(P-45 P-5)를 통하여 예상된 RYR1 gene 부분의 유전자가 증폭되었음을 확인시켜 주고 있다. 또한 primary PCR 증폭산물과 비교하여 nested PCR의 증폭 산물은 PSS 검색을 위한 충분한 양의 산물이 증폭된 것을 확인할 수 있었다.
- 2에서 보이는 것과 같이 nested PCR의 증폭산물은 약 522 bp의 단일 밴드로 증폭되었음을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과는 Table1에서 보여준 primei(P-45 P-5)를 통하여 예상된 RYR1 gene 부분의 유전자가 증폭되었음을 확인시켜 주고 있다. 또한 primary PCR 증폭산물과 비교하여 nested PCR의 증폭 산물은 PSS 검색을 위한 충분한 양의 산물이 증폭된 것을 확인할 수 있었다.
- Table 2에서 보는 바와 같이 품종 구분 없이 319두를 대상으로 분석한 결과는 정상 개체(NN), 헤테로 개체(Nn) 및 감수성 개체(nn) 3종류의 유전자형이 확인되었다. 정상 개체 (NN)는 전체 319두 중에서 305두로 95.
- 6%를 보여 매우 높게출현 하였다. 헤테로 개체(Nn)는 13두로 4.1%를 보인 반면에, 감수성 개체 (nn)는 1두 발현으로 0.3%의 매우 낮은 비율로 나타났다. 이러한 결과는 국내에서 박 등(1997)이 품종 구별 없이 정상돼지의 비율은 76.
- 84이므로 현재의 x2 값에 기초한 P 값은 5% 이하가 된다. 따라서 현재의 유전자형 관측치는 유전자형 기대치와 유의성이 없는 것으로 나타나, Hardy-Weinberg 법칙과 일치하여 유전적 평형을 이루고 있음을 보여주었다. 이러한 결과는 90년대 말 이후 PSS돼지의 우수한 검색방법이 개발되어진 이후 PSS돼지의 강력한 도태(선발)가 이루어져 PSS 유전자를 보유한 돼지가 점차 줄어들었기 때문인 것으로 사료된다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합하여보면, 모근을 이용한 PSS 검색 방법으로 보다 간편히 종돈장에서 PSS 유전인자를 보유한 돼지를 쉽게 검색하여 조기에 종돈수준에서부터 강력한 선발을 하여 PSS 유전인자를 줄여 PSE 돈육의 생산을 효과적으로 예방함으로서 농가의 소득 향상 및 생산성 향상을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
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