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문제 정의
- 본 연구는 사람의 간암세포인 HepG2 세포주를 이용하여 고려인삼 추출물의 세포 내 콜레스테롤 저하기전을 알아보기 위해 콜레스테롤을 첨가한 배지에 고려인삼(Rzm亦 g/ns曜 C.A. Meyer)의 사포닌 성분 중 ginseonoside-R&와 ginsenoside- Rbj 및 ginsenoside-Rbe 같은 protopanaxadiol saponin의 장내세균 대사체로 알려진 compound K10)> 첨가한 후 이들 성분들의 LDL receptor 및 SREBP mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하였고 현재 고콜레스테롤혈증의 치료제로 시용되고있는 lovastatin을 첨가한 그룹을 대조군으로 사용하여 인삼 ginsenoside 성분과 lovastatin의 약리작용 기전을 비교하였다.
가설 설정
- 顼 Ginsenoside-Rb》도 이런 nuclear recep- tor의 한 종류에 결합하여 SREBP mRNA의 전사를 증가시킬 가능성이 있다. 두번째 가설은 ginsenoside-Rbe가 세포 내 콜레스테롤 함량을 낮추어 이차적으로 SREBP 및 LDL receptor mRNA의 전사를 증가시키는 것이다. 세포 내 콜레스테롤 농도가 낮아지면 SREBP 단백질이 증가하고 LDL receptor mRNA의 전사가 증가한다는 것은 이미 알려져 있다.
제안 방법
- 그 후 여기에 2M sodium acetate(pH 4.5), water-saturated phenol, 그리고 chloroform/isoamyl alcohol(49:1, v/v)» 첨가한 후 20분간 원심분리(4。(3, 10, 000xg)한 후 상층액을 취해 phenol/chloroform 추출 1회와 chloroform/isoamyl alcohol 추출을 2회 실시하였다. 그 후 상층액에 0.
- 그리고 실험군은 무혈청 RPMI 1640 배지에 choles- terolQO μ以ml)를 전처리 한 후 각각의 배지에 ginsenoside- Rb2(10 pg/ml)나 lovastatin(101丄g/ml)를 첨가하여 세포를 8시간 동안 배양하였으며, 농도에 따른 ginsenoside-R切와 compound K의 영향을 알아보기 위해서는 무혈청 RPMI 1640 배지에 cholesterol(10 전처리 한 배지에 각각의 성분들을 실험에 명시한 농도만큼 첨가하여 8시간 동안 배양하였다. 각 군들의 세포는 ethanol이 1% 첨가된 PBS로 한번 세척하고 다시 PBS만으로 3번 세척한 후 l, 000xg에서 15분간 원심분리하여 세포를 수거하여 총 RNA를 추출하였다.
- 배지에 첨가된 ginsenoside-R也 및 compound K는 etha- nol에 녹여 사용하였으며 세포배양배지에 첨가시 ethanol의 최종농도가 0.1%가 넘지 않도록 조절하였다.
- Hybridization 실시 후 세척용액 (20mM NeHPC% ImM EDTA, 1% SDS)으로 68℃에서 20분씩 3 호 세척하였다. 세척이 끝난 후 membranee blocking 용액 [(f.lM maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.3% tween 20(pH 8.0), 05% blocking reagent]으로 실온에서 1시간 blocking 시킨 후 E*IG-alkaline phosphatase conjugated: 15,000瘴 첨가하여 30 븐간 실온에서 반응시킨 다음 다시 blocking 용액으로 20분씩 3번 세척한 다음 CSPD(Roche)를 이용하여 chemiluminescent 탕법으로 X-ray film에 노출시켰다. 각 mRNA band의 양을 Ruor-STM multiimager(Bio-Rad)로 측정하였고 같은 세포의 P-actin mRNA 값에 의해 보정하였다.
- 인삼성분 중 ginsenoside-Ig에 의한 LDL receptor 발현증가의 기전을 HepG2 세포에서 관찰하였고 이를 lovastatin 과 비교하였다. 콜레스테롤 투여에 의하여 억제된 LDL receptor mRNA 발현이 ginsenoside-R0에 의하여 다시 증가하였고 이는 lovastatin에 의한 증가 효과보다 뛰어났다.
- 전사인자의 하나인 SREBP는 SREBP-la, 1c와 SREBP-2 의 3종류의 isoform으로 존재하며(2) SREBP의 활성화는 LDL receptor의 발현과 밀접하게 연관되어 있기 때문에 먼저 ginsenoside-R切가 SREBP-1 mRNA의 발현에 미치는 영향을 알아보고 그 효과를 lovastatin과 비교하였다(Fig. 2). 10|ig/ml의 콜레스테롤 만을 투여한 대조군의 경우 SREBP-1 mRNA 발현은 정상군에 비하여 감소하였으나 각각 10 의 ginsenoside-Rbg와 lovastatin를 콜레스테롤과 함께 투여한 실험군의 경우 SREBP-1 mRNA의 발현은 정상군의 수준으로 회복되었으며 그 효과는 두성분이 거의 동일하였다.
대상 데이터
- 6 kb EcoRl/ Sall 절편을 사용하였다. 그리고 human。-actin cDNA(HHC 189, ATCC 65128)의 1.1 kb EcoRl 절편을 총 RNA 보정용으로 사용하였다. Probe는 각 절편을 digoxigenin (DIG)-high prime labeling Kit U(Roche)을 이용하여 random labeling하읏다
- LDL receptor mRNA의 probe는 pLDLR3(.X£CC 57004)의 1.9 kb BamHI 절편을, SREBP-1 mRNASi probed pSREBP-la (ATCC 79810)의 4.3 kb BamHI/Sall 절편을, SREBP-2 m RNA의 probe는 pSREBP-2(、NCCC 79816)2] 1.6 kb EcoRl/ Sall 절편을 사용하였다. 그리고 human。-actin cDNA(HHC 189, ATCC 65128)의 1.
- 배지에 첨가한 콜레스테롤은 수용성 콜레스테롤 (Sigma)을 사용하였고, 사용한 인삼 성분인 ginsenoside-I간b 와 compound K는 한국인 삼연초연구원으로부터 제공받았다. 세포배양에 필요한 fetal bovine serum(FBS), penicillinstreptomycin, sodium bicarbonate, trypsin-EDTA 및 N-[2- hydroxyethyl]piperazine-N'-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) 등은 Gibco-BRL 제품을 구입하여 사용하였다.
- 사람의 간암세포인 HepG2 세포는 한국세 포주 은행으로부터 분주 받았으며 배양배지는 RPMI 1640(Gibco BRL)을 사용하였다. 배지에 첨가한 콜레스테롤은 수용성 콜레스테롤 (Sigma)을 사용하였고, 사용한 인삼 성분인 ginsenoside-I간b 와 compound K는 한국인 삼연초연구원으로부터 제공받았다.
이론/모형
- 총 RNA의 추출은 Chomczynski 와 Sachhi(1987)의 방법을 이용하였다. 원심분리하여 수거한 세포에 GITC용액(4M guanidine thiocyanate, 25 mM sodium citrate, water-saturated phenol)을 5배 부피 이상 첨가하여 23 gauge needle을 사용해 균질화 시켰다.
성능/효과
- 8)CH0 세포를 이용한 실험에서 ginsenoside 성분은 LDL receptor 활성을 증가시켰고 이는 세포 내 콜레스테롤 함량이 감소하였기 때문으로 보고되었으며4)본 연구진도 이전의 실험에서 ginsenoside-R1五에 의하여 acyl CoA: cholesterol acyltransferase(ACAT) 및 cholesterol 7a-hydroxy- lase 활성이 증가하고 HMG-CoA reductase 활성이 감소하는 것을 관찰하였다."(3) ACAT 및 cholesterol 7a-hydroxy- lase 활성이 증가하여 콜레스테롤 배설이 증가하고 HMG- CoA reductase 활성 감소에 의하여 콜레스테롤 생성이 억제되는 것이 세포 내 콜레스테롤 함량을 감소시키는 기전으로 생각된다. 따라서 세포 내 콜레스테롤 함량의 감소가 LDL receptor의 발현 증가로 이어지고 최종적으로 혈중 콜레스테롤치가 감소되었을 가능성이 있다.
- SREBRla와 SREBP-h는 같은 유전자에서 다른 promoter 투■위를 사용하여 만들어지고 SREBP-2는 다른 유전자에서 만듵5진다, 14)주로 배양된 세포에서는 SREBP-la와 SREBP- 많이 발현되고⑸ 각각 지질 대사 관련 유전자와 콜레스태롤 대사 관련 유전자의 promoter 부위에 작용한다.(2) Gmsenoside-Rb2는 배양한 HepG2 세포에서 SREBP-1 과 SREBR2 mRNA의 발현을 모두 증가시켰고 lovastatin의 경우에는 SREBR1 만을 증가시켰다. 위의 실험결과를 통하여 gi:nsenoside-Rb2°fl 의한 LDL receptor mRNA 발현증가는 LDL receptor의 발현을 조절할 수 있는 SREBP mRNA의블-현 증가와 관련이 있음을 확인하였다,
- 진행되고 있다.1) 실험적으로 고콜레스테롤혈증을 유발 人 킨 동물에 인삼 사포닌 성분을 투여하면 동맥경화증이 억재되었고2) 또한 고콜레스테롤혈증을 유발한 쥐에게 인삼의 gmsenoside 성분을 투여하면 간세포의 low density lipoprotein (LDL) receptor의 활성 증가로 인하여 혈중 콜레스테롤 농도가 감소하였다.3)한편, 세포배양을 통한 in vitro 실험의 경우에서도 인삼의 ginsenoside 성분이 Chinese hamster ovary (CH0) 세포의 LDL receptor 활성을 증가시켰으며, 少 인간의 간암세포인 HepG2 세포를 이용한 실험에서는 LDL receptor mRNA의 발현이 인삼 사포닌 및 ginsenoside 성분에 의하여 증가하는 것이 확인되었으나 그 자세한 기전은 아직 밝혀지지 않았다.
- 1) 실험적으로 고콜레스테롤혈증을 유발 人 킨 동물에 인삼 사포닌 성분을 투여하면 동맥경화증이 억재되었고2) 또한 고콜레스테롤혈증을 유발한 쥐에게 인삼의 gmsenoside 성분을 투여하면 간세포의 low density lipoprotein (LDL) receptor의 활성 증가로 인하여 혈중 콜레스테롤 농도가 감소하였다.3)한편, 세포배양을 통한 in vitro 실험의 경우에서도 인삼의 ginsenoside 성분이 Chinese hamster ovary (CH0) 세포의 LDL receptor 활성을 증가시켰으며, 少 인간의 간암세포인 HepG2 세포를 이용한 실험에서는 LDL receptor mRNA의 발현이 인삼 사포닌 및 ginsenoside 성분에 의하여 증가하는 것이 확인되었으나 그 자세한 기전은 아직 밝혀지지 않았다.$
- Ginsenoside-R0에 의한 SREBP-1 mRNA의 발현이 정상군의 수준으로 회복된 것이 전사의 증가 때문인지 혹은 이미 발현된 SREBP-1 mRNA의 turnover의 감소 때문인지를 알아보기 위해 위와 동일한 조건하에 전사억제제의 하나인 actinomycin D를 처리한 결과(Fig. 4) actinomycin D의 처리에 의하여 모든 실험군에서 50% 정도의 SREBP-1 mRNA 의 발현이 감소됨을 확인하였다. 따라서 ginsenoside-R& 에의한 SREBP-1 mRNA 발현회복은 주로 SREBP-1 mRNA의 새로운 전사의 증가에 의한 것임을 확인하였다.
- Ginsenoside-Rbl과 -Rb2 같은 protopanaxadiol saponin의 장내서】균 대사체로 알려진 compound K가 SREBP-1 mRNA 발현에 미치는 영향을 ginsenoside-Rb2와 비교한 결과(Fig. 6), 0.1 瞄, ml의 compound K를 세포에 투여하여도 10μg/ ml의 ginseiioside-Rb2를 투여한 경우와 동일한 정도의 SREBP-1 mRNA 발현이 증가하였고 11丄g/ml과 의 compound K의 처리에 의한 SREBP-1 mRNA의 발현은 처리한 농도에 비례하여 증가되었다. 따라서 SREBP-lmRNA 발현에 대한 효과는 ginsenoside-Rb2보다 그 장내세균 대사체인 compound K가 뛰어난 것으로 확인되었다.
- 10|ig/ml의 콜레스테롤 만을 투여한 대조군의 경우 SREBP-1 mRNA 발현은 정상군에 비하여 감소하였으나 각각 10 의 ginsenoside-Rbg와 lovastatin를 콜레스테롤과 함께 투여한 실험군의 경우 SREBP-1 mRNA의 발현은 정상군의 수준으로 회복되었으며 그 효과는 두성분이 거의 동일하였다. 농도에 따른 ginsenoside-R0의 SREBP-l mRNA 발현에 대한 효과를 알아보기 의해 ginsenoside-R切를 콜레스테롤과 함께 O.ljLg/ml, 1 |ig/ml, 10 100昭血1의 농도로 각각 투여한 경우 10 a以ml의 농도까지는 투여한 ginsenoside- 即2의 농도에 비례하여 SREBP-1 mRNA의 발현이 증가되어이전 결과처럼 (Fig. 2) SREBP-1 mRNA의 발현이 정상군의 수준으로 회복되었으며 고농도(100 胞/ml)의 ginsenoside-R0 의 처리는 오히려 SREBP-1 mRNA 발현을 억제시키는 효과를 나타내었다(Fig. 3). 이러한 농도에 비례하여 나타나는 현상은 즉 ginsenoside-R耳의 효능을 확인할 수 있는 결과이며 또한 다양한 농도의 ginsenoside-R切의 투여시 농도에 비례하여 세포 내 콜레스테롤 함량이 감소하였고 100 “g/ml 의 농도보다 lOjig/ml의 농도에서 그 효과가 최대였다는 앞서의보고와도 일치하였다.
- 1 瞄, ml의 compound K를 세포에 투여하여도 10μg/ ml의 ginseiioside-Rb2를 투여한 경우와 동일한 정도의 SREBP-1 mRNA 발현이 증가하였고 11丄g/ml과 의 compound K의 처리에 의한 SREBP-1 mRNA의 발현은 처리한 농도에 비례하여 증가되었다. 따라서 SREBP-lmRNA 발현에 대한 효과는 ginsenoside-Rb2보다 그 장내세균 대사체인 compound K가 뛰어난 것으로 확인되었다. Compound K는 ginsenoside-Rbl보匸扌 세포나 체내로 더 잘 흡수되기 때문에 이러한 효과를 나타낸 것으로 추정되며 또한 in vivo 상에서 보여진 ginsenoside의 혈중 콜레스테롤치 강하와 LDL receptor 활성 증가匚(3)는 ginsenoside와 대사산물인 compound K의 상승효과일 가능성이 있다.
- 4) actinomycin D의 처리에 의하여 모든 실험군에서 50% 정도의 SREBP-1 mRNA 의 발현이 감소됨을 확인하였다. 따라서 ginsenoside-R& 에의한 SREBP-1 mRNA 발현회복은 주로 SREBP-1 mRNA의 새로운 전사의 증가에 의한 것임을 확인하였다.
- 하지만 콜레스테롤과 힘께 10|ig/ml의 ginsenoside-Rbe나 10 |ig/ml lovastatin 을 첨가한 실험군의 경우 LDL receptor mRNA의 발현이 콜레스테롤을 첨가하지 않은 정상군 보다 현저히 증가하였으며 이는 콜레스테롤 투여에 의하여 유발된 LDL receptor 발현억제6)가 ginsenoside-R切나 lovastatin에 의해 회복될 수 있음을 의미한다. 따라서 세포 내 콜레스테롤의 농도가 높을경우 LDL receptor의 발현이 억제되는데 ginsenoside-%는혈중 콜레스테롤강하제로 사용되는 lovastatin과 같이 세포 내의 LDL receptor의 발현을 정상 수준으로 회복시켜 혈중 LDL 콜레스테롤을 효과적으로 제거함으로써 고콜레스테롤 혈증이 유발된 동물의 혈중 콜레스테롤의 상승을 억제하고 결과적으로 동맥경화를 억제하거나 지연시킬 수 있는 약제로 사용할 수 있는 가능성을 보여주었다.
- 또한 ginsenoside-R*는 현재 HMG-CoA reductase inhibitors. 사용되어지는 lovastatin과 비교해 볼 때 상기한 수준이상의 LDL receptor mRNA의 발현을 증가시키는 효과를 나타내었다. 또한 compound K가 ginsenoside-R哄다 적은 농도에서 동등한 SREBP mRNA 의 발현 증가 효과를 보였기 때문에 이들 천연성분의 약제들에 대한 보다 정확한 약리기 전을 밝힌다면 이들 인삼 saponin 성분들을 간경화환자들에게 심각한 부작용을 초래하는 lovastatin을 대체할 수 있는 고콜레스테롤혈증 치료제로 사용할 수 있으리라 생각된다.
- (2) Gmsenoside-Rb2는 배양한 HepG2 세포에서 SREBP-1 과 SREBR2 mRNA의 발현을 모두 증가시켰고 lovastatin의 경우에는 SREBR1 만을 증가시켰다. 위의 실험결과를 통하여 gi:nsenoside-Rb2°fl 의한 LDL receptor mRNA 발현증가는 LDL receptor의 발현을 조절할 수 있는 SREBP mRNA의블-현 증가와 관련이 있음을 확인하였다,
- 3). 이러한 농도에 비례하여 나타나는 현상은 즉 ginsenoside-R耳의 효능을 확인할 수 있는 결과이며 또한 다양한 농도의 ginsenoside-R切의 투여시 농도에 비례하여 세포 내 콜레스테롤 함량이 감소하였고 100 “g/ml 의 농도보다 lOjig/ml의 농도에서 그 효과가 최대였다는 앞서의보고와도 일치하였다.13)
- 이상의 연구결과를 종합해보면 인삼의 saponin 성분중의 하나인 ginsenoside-叫는 고콜레스테롤 조건하에서도 HepG2 세포내의 LDL receptor mRNA 발현을 증가시켰으며 이는 LDL receptor의 전사조절인자인 SREBP의 발현과 밀접한 연관이 있음을 확인하였다. 또한 ginsenoside-R*는 현재 HMG-CoA reductase inhibitors.
- 즉 ginsenoside-Rle에 의한 SREBP 발.현 증가는 콜레스테롤 투여에 의하여 억제된 LDL receptor 발현을 증가시켜 결과적으로 혈중의 콜레스테롤을 효과적으로 제거하는 것으로 판단된다.
후속연구
- 사용되어지는 lovastatin과 비교해 볼 때 상기한 수준이상의 LDL receptor mRNA의 발현을 증가시키는 효과를 나타내었다. 또한 compound K가 ginsenoside-R哄다 적은 농도에서 동등한 SREBP mRNA 의 발현 증가 효과를 보였기 때문에 이들 천연성분의 약제들에 대한 보다 정확한 약리기 전을 밝힌다면 이들 인삼 saponin 성분들을 간경화환자들에게 심각한 부작용을 초래하는 lovastatin을 대체할 수 있는 고콜레스테롤혈증 치료제로 사용할 수 있으리라 생각된다.
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