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문제 정의
- 대량폐사는 없었다. 본 연구자들은 이 복수증 원인 병원체규명을 위한 기초 자료를 얻기 위하여 병어체로부터 세균과 virus를 분리 동정하였다.
제안 방법
- Extended g-lactamase 생성균주 확인을 위한 double disk synegy 시험은 Mueller-Hinton agar에 시험균주를 면봉으로 고르게 도말한 다음 중앙에 Tim-85를 놓고 15 mm 간격을 띄운 다음제 3세대 cepha계열 항균제인 CTT, CAZ, CTX를 정삼각형이 되게 배열하여 균을 배양한 다음 항균제 간섭효과를 관찰하였다(25).
- 증균액은 10배수로 단계희석하여 TCBS agar와 DSS에 도말하였다. Vibrio 균주의 분리는 집락이 형성된 TCBS agar에서 노란색 또는 녹색 집락을선택하였고, Edwardsiella의 경우, DSS agar에서 집락 중앙에 흑섁 색소를 생성하는 것을 선택하였다(2). 동일한 균주의 중복선택을 피하기 위하여 해당 검체로부터 각각 1균주씩 선별하였다.
- Vibrio속과 Edwardsiella속의 생화학적 시험은 일반 분리법을따랐고(3, 4), 특히 해양성 호염세균인 Vibrio 분리를 위하여 nutrient broth (NB)에 0, 3, 5, 7, 10 퍼센트 농도로 NaCl을 첨가하여 성장유무를 확인하였다. 균주의 발광유무는 신선한 배양체를 암실에서 관찰하였다.
- 성장유무를 확인하였다. 균주의 발광유무는 신선한 배양체를 암실에서 관찰하였다. 항균제 감수성 시험, 참조균주, 특별히 언급되지 않은 기본배지의 제조(12, 15) 동정방법 등은 모두전보를 따랐다(19, 26, 27).
- Vibrio 균주의 분리는 집락이 형성된 TCBS agar에서 노란색 또는 녹색 집락을선택하였고, Edwardsiella의 경우, DSS agar에서 집락 중앙에 흑섁 색소를 생성하는 것을 선택하였다(2). 동일한 균주의 중복선택을 피하기 위하여 해당 검체로부터 각각 1균주씩 선별하였다. 이후 1.
- 바이러스는 채집된 넙치의 신장, 비장 및 장을 대상으로 일반적인 어류바이러스 분리용 조직액을 제작하여 어류 주화세포의 일종인 fathead minnow caudal trunk cell line (FHM)에 접종하여 분리를 행하였다. 주화세포는 100 IU/ml의 penicillin, 100 |ig/ ml의 streptomycin, 10% FBS (Fetal bovine serum)를 첨가한 MEM (Eagle's minimum essential medium, Gibco)을 사용하여 배양하여 준비하였고, 접종 후 2(TC에서 15일간 배양하면서 세포 변성 효과 (CPE)를 관찰하였다.
- 주화세포는 100 IU/ml의 penicillin, 100 |ig/ ml의 streptomycin, 10% FBS (Fetal bovine serum)를 첨가한 MEM (Eagle's minimum essential medium, Gibco)을 사용하여 배양하여 준비하였고, 접종 후 2(TC에서 15일간 배양하면서 세포 변성 효과 (CPE)를 관찰하였다. 분리된 바이러스의 확인을 위하여 MABV 검출용으로 제안되어(34) 사용되고 있는 primer (P1/P2, P3/P4)를 이용하여, RT-PCR을 행하여 확인하였다.
- 세균 분리방법은 양식장 현장에서 채집된 감염어로부터 적출된 장기 또는 복수액을 vibrio 선택배지인 TCBS agar (thiosulfate- citrate-bile salt-sucrose)와 Edwardsiella속의 선택배지인 DSS agar (double Salmonella-Shigella) 배지에 직접 도말하는 방법과, 해당 장기 또는 복수액을 1% 식염이 첨가된 20ml brain heart infusion broth (BHI)에 접종하여 30P에서 17시간 증균시켜 균주를 분리하는 2가지 방법을 사용하였다. 증균액은 10배수로 단계희석하여 TCBS agar와 DSS에 도말하였다.
- 동일한 균주의 중복선택을 피하기 위하여 해당 검체로부터 각각 1균주씩 선별하였다. 이후 1.5% 식염과 1.6% agar가 첨가된 BHI agar에서 3회 순수분리하고 유주(swamuning)하는 균주는 4% agar가 첨가된 BHI agar에서 재 순수분리 하였다.
- 분리를 행하였다. 주화세포는 100 IU/ml의 penicillin, 100 |ig/ ml의 streptomycin, 10% FBS (Fetal bovine serum)를 첨가한 MEM (Eagle's minimum essential medium, Gibco)을 사용하여 배양하여 준비하였고, 접종 후 2(TC에서 15일간 배양하면서 세포 변성 효과 (CPE)를 관찰하였다. 분리된 바이러스의 확인을 위하여 MABV 검출용으로 제안되어(34) 사용되고 있는 primer (P1/P2, P3/P4)를 이용하여, RT-PCR을 행하여 확인하였다.
대상 데이터
- 2002년 6월부터 2003년 11월까지 거제도 넙치양식장에서 사육중 복수증 증상을 수반하면서 폐사되어지는 양i]산 넙치를 대상으로 간, 복수(체강액), 신장, 비장 등으로부터 세균과 바이러스를 분리하였다.
- 2002년도 병어 체로부터 다수 분리가 이루어졌고 2003년에도 비교적 고르게 병어 체로부터 분리되었다. 균주분리는 신선하게 배양된 암실에서 강하게 발광 되는 균주를 선별하였다. 검체로부터 초기 분리된 균주는 TCBS, 0.
- 대조 균주는 본 연구실에 소장된 참조균주 및 생명공학연구소 등에서 분양받은 Vibrio 표준균주로서 V. parahaemolyticus ATCC 33844, V carchariae NCIMB 12705, V harveyi KCTC 2720, P. damsela KCTC 2734 이었다.
- 대한 고찰은 아래와 같다. 인위적인 균주선별의 쏠림현상을 방지하기위하여 한 검체 당 한 균주만을 선별하였다.
- 항균제 감수성 조사를 위한 약제의 선별은 양^장에서 많이사용하고 있는 tetracycline 계열의 약제 (tetracycline, doxycycline) 와 ampicilline gentamicin, kanamycine 등과 제 3세대 항균제인 ceftriaxone 1종을 선별하였다. 또한 균주 선별은 통계적인 유의성을 가질 수 있는 V.
이론/모형
- coli에 대한 검사는 15종으로 위 6종 외에 nalidixic acid (NA- 30 fig), cefotetan (CTT-30 |Ag), ceftazidime (CAZ-30 ㎍), cefotaxime (CTX-30]㎍), cefoxithin (FOX-30 p, g), ticacilline/clavulanic acid (TIM-85 75/101㎍), cephalothine (CF-30 |ig), colistine (CL-10 ㎍), immipenem (IPM-lOag)이 더 추가되었다. 약제시험 기준은 National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (33)과 Becton Dickinson사(8) 지침을 따랐다.
성능/효과
- Voges-Proskauer, Simmon's citrate, arginine dihydrolase 음성이었고 당을 거의 이용하지 못하였으며균주간의 생화학적 변이가 전혀 없이 단일한 시험결과가 나타났다. 10균주에 대하여 항균제 내성 검사 결과, NA 9균주, TE 9 균주, CAZ 1균주, CF 1균주, CL 9균주, K 8균주가 내성을 나타내었다. 이들에 대한 extended g-lactamase 생성유무를 관찰한결과 전 균주가 [3-lactamase를 생성하지 못하였다.
- TCBS agar상에서 Vibrio속으로 주정되는 convex, 또는 flat form의 녹색 또는 노란색의 186균주(2002년 81균주, 2003년 105 주)와 Edwardsiella 선별배지인 DSS agar 배지에서 투명한 convex형으로 집락 중앙부위에 흑색 색소가 침착되는 15개의 균집락을 포함한 총 201 균주가 분리되었다. 이중 47 퍼센트인 3 속 7종 94균주가 종 수준까지 동정되었다.
- 였다. Voges-Proskauer, Simmon's citrate, arginine dihydrolase 음성이었고 당을 거의 이용하지 못하였으며균주간의 생화학적 변이가 전혀 없이 단일한 시험결과가 나타났다. 10균주에 대하여 항균제 내성 검사 결과, NA 9균주, TE 9 균주, CAZ 1균주, CF 1균주, CL 9균주, K 8균주가 내성을 나타내었다.
- 우점균은 Vibrio속의세균으로 분리균주는 모두 NaCl이 첨가되지 않은 nutrient broth 에서 성장이 불가능하였다. 균종별로 K harveyi (32균주), V parahaemolyticus (23균주), V. alginolyticus (10균주), V. carcariae (2균주), V. metschenikovii (5균주)였다. 그 밖에도 Photobacterium damsela (7균주)와 장내세균인 Edwardsiella tarda (15균주)가 분리되었고 이들의 종별 생화학적 성상은 Table 1과 같았다.
- 1종을 선별하였다. 또한 균주 선별은 통계적인 유의성을 가질 수 있는 V. harveyi, V. parahaemolyticns에 대한 다약제내성시험을 하였고, 비록 분리된 숫자는 10여 균주에 불과하지만 기존의 양식 어류의 대표적인 병원균으로 알려진 장내세균속 VIbrio에 대한 약제 검사는 15종으로 하였고 이들에게 extended P-lactamase 생성균주의 존재유무를 조사할 목적으로제 3세대 cepha 계절 항균제 내성 검사와 double disk synergy 검사결과를 실시하였으나 양성균주는 한 균주도 나오지 않았다. 그밖에 Vibrio 세균들에게는 거의 약효가 없는 AM이 E.
- 복수증 넙치의 각 장기로부터 분리되어 종수준까지 동정된 세균속은 Vibrio속, Photobacterium속, 장내세균 Edwardsiella 3개속이었다. 이중 Edwardsiella 속은(4, 10) 대표적으로 알려진 어류 병원성 장내세균으로 E.
- Voges-Proskauer, arginine dihydrolase는 음성반응을 나타내었고 ornithine decarboxylase는 대분분이 양성이었지만 부분적으로 음성인 경우도 있었다. 항균제 내성검사를 실시한 25 균주 중 AM 25균주, TE 4균주, GM 1균주, K 3균주, D 4 균주가 내성을 보였고 나머지 약제들에 대해서는 감수성을 나타내었다.
- 항균제 시험을 실시한 14균주 중 AM 14균주, TE 1균주, GM 2균주, K 3균주, D 1균주가 내성을 보였고 나머지 약제들에 대해서는 감수성을 나타내었다.
- 해수 양식장의 특성상 Valginolyticus속의 세균이 우점으로 분리되었고, 그 중에서도 V harveyi7\ 우점종이었다. 2002년도 병어 체로부터 다수 분리가 이루어졌고 2003년에도 비교적 고르게 병어 체로부터 분리되었다.
후속연구
- 양^산 넙치 성어의 대량 폐사 개체에서 분리되어진 본 바이러스가 폐사에 이르는 정도의 병원성을 가지고 있는지 혹은 본조사에서 분리되어진 세균류들과 혼합감염 등의 과정을 거치면서 감염증으로 표현되어진 것인지에 대한 앞으로의 추가연구가필요한 것으로 사료된다.
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