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문제 정의
- 이에 따라, 본 연구에서는 ferrous sulfate와 hemin을 혼합한 철분 함유 리포좀을 제조함으로써 철분의 생이용성을 증진하고자 하였다. 이러한 철분 함유 리포좀을 제조하는데 가장 큰 문제점은 ferrous sulf ate 의 자체 산화와 ferrous sulfate 와 hemin 으로인한 리 포좀의 지 질산화로 지적 되 었고, 이러한 산화과정을 최소화하는데 연구의 초점이 맞춰졌다. 최종적으로, 리포좀에 ascorbic acid와 a-tocopherol의 항산화제를 복합하여 사용함으로써 제품 내에서 철분으로 인한 반응성을 최소화하였다.
- 이용한 많은 연구가 보고되었다(7-9). 이에 따라, 본 연구에서는 ferrous sulfate와 hemin을 혼합한 철분 함유 리포좀을 제조함으로써 철분의 생이용성을 증진하고자 하였다. 이러한 철분 함유 리포좀을 제조하는데 가장 큰 문제점은 ferrous sulf ate 의 자체 산화와 ferrous sulfate 와 hemin 으로인한 리 포좀의 지 질산화로 지적 되 었고, 이러한 산화과정을 최소화하는데 연구의 초점이 맞춰졌다.
제안 방법
- 이러한 목적으로 지용성 항산화제 인 a. -tocopherol(200 pM) 올 선택하여 철분 함유 리포좀에서의 리포좀 산화 억제 효과를 관찰하였다(18). [Lipid]/[hemin] 몰비율이 500인 경우와 [lipki]/[feiTous sulfate]/[ascorbic acid]의 몰비율이 500/1/10 인 경우 모두에서 « Tocopherol이 리포좀의 산화를 충분히 억제하는 효과가 관찰되 었다(Fig.
- 25℃에서 리포좀(10mM) 용액에 ferrous sulfate (2, 20, 2X102, 2X103, 2X104, 4X104 uM)와 hemin(2, 20, 2 x 102, 1 x 103 μM)의 농도를 변화시 키면서 첨가한 후에 반응시간(0.5, 1, 2, 3.5, 5시간)에 따라 각각 정량하였다.
- 하였다. 4℃의 온도 하에서, 15,000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리 를 2회 반복하여 MLV를 세 척 하고 dialysis 를 하여 MLV 외 부에 존재하는 ferrous sulfate와 ascorbic acid를 완전히 제거한 후에 철분(Fe) 정량과 인지질 정량을 하였다. 이러한 정량으로부터 리포좀에 의한 ferrous sulfate 의 포집효율을 계산하였다.
- MLV 리포좀 제조 과정 중 얇은 지질막을 형성한 후에 완충액을 첨 가하는 단계에서 ferrous sulfate(100 rnM)와 ascorbic acid(20 mM)를 첨가하여 MLV 안에 ferrous sulfate가 포집 되도록 하였다. 4℃의 온도 하에서, 15,000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리 를 2회 반복하여 MLV를 세 척 하고 dialysis 를 하여 MLV 외 부에 존재하는 ferrous sulfate와 ascorbic acid를 완전히 제거한 후에 철분(Fe) 정량과 인지질 정량을 하였다.
- 다음으로, ascorbic acid(200 μM)에 의한 철분 함유 리포좀 (10 mM)의 산화 억 제 효과를 측정하였다. 그 결과, ascorbic acid는 hemin에 의한 리 포좀의 산화를 억 제하는 효과가 없는것으로 관찰되었다(Fig.
- 또한, 각각에 대한 항산화제의 산화억 제효과를 측정 하기 위 해 수용성 인 ascorbic acid는 리포좀올 제조한 후에 첨가하였고, 지용성 인「tocopherol 리포좀을 만들기 전 얇은 지질 막 형성 단계에서 첨가하였다.
- 4℃의 온도 하에서, 15,000 rpm에서 30 분 동안 원심 분리 를 2회 반복하여 MLV를 세 척 하고 dialysis 를 하여 MLV 외 부에 존재하는 ferrous sulfate와 ascorbic acid를 완전히 제거한 후에 철분(Fe) 정량과 인지질 정량을 하였다. 이러한 정량으로부터 리포좀에 의한 ferrous sulfate 의 포집효율을 계산하였다.
- 따라서, 철분 함유 리 포좀이 산화에 대하여 구조적 안정성을 가지기 위해서 리포좀의 산화가 억제되는 방안이 검토되었다. 이에 따라, ferrous sulfate의 자동 산화를 억 제하는 것으로 관찰된 수용성 항산화제 인 ascorbic acid가 ferrous sulfate 또는 hemin을 함유한 철 분 함유 리 포좀의 산화에 미치는 영향을 관찰하였다. 한편, ascorbic acid는 수용액에서보다 리포좀 내에서 보다 더 안정성이 증대된다는 보고가 있으므로(15, 16), 여기서 철분 함유 리포좀에 첨가된 ascorbic acid는 수용액 에서 보다 더 안정 한 부가적 인 효과를 얻었다.
- 대한 연구가 꾸준히 진행되어 왔다. 이에 따라, 철분 공여 물질을 함유한 리포좀을 이용하여 철분 강화 식품 첨가제를 개발하였다. 철분공여물질로 ferrous sulfate와 hemin 을 사용하였으며, 이러한 철분 함유 리포좀을 제조하는데 가장 큰 문제점은 ferrous sulfate의 자체 산화와 ferrous sulfated hemin으로 인한 리포좀의 지질산화로 지적되었다.
- 5시간 이내에 색깔이 변하고 침전물이 생겨 단독으로는 철분 공여 물질로 사용할 수 없었다(data not shown). 이와 같은 ferrous sulfate의 자동산화를 억 제하기 위하여 ascorbic acid를 일정하게 20 mM을 첨가하여 ascorbic acid의 효과를 앞에서와 같은 조건에서 관찰하였다. 이에 따르면, ascorbic acid가 ferrous sulfate의 자동산화를 억 제하는 효과가 있었으며 , 냉장 보관 시 그 효과가 더 오래 간다는 것이 관찰되었다(data not 아iown), 결국 충분한 양의 ascorbic acid를 첨가시킨다면 ferrous sulfate의 자동산화를 상당한 기간 동안 억제할 수있올 것이라는 결론을 얻었다.
- 그러나, 우리의 결과와는 상반되는 결과를 보여주는 특허가 보고되 었다(9). 즉, 황산염, 젖산염, 시 트르산염의 형태로 존재하는 철올 리포좀의 내부에 포집하여 유제품 등의 식품에 첨가하는 첨가제를 제조하였으며, 여기서 철을 2가로 환원된 상태로 유지 하기 위하여 ascorbic acid를 함께 포집한 것이다. 더군다나, 우리의 결과에 따르면 본 특허 에서 사용한 고농도의 ferrous sulfate는 EPC의 인지 질 이리 포 좀을 형성하는 것을 방해하는 것으로 관찰되었다.
- 한편, ferrous sulfate가 수용액에서 자동산화되는 정도를 농도(50, 100, 200, 300 mM)와 온도(4, 25℃) 에 따라 관찰하였다. zl 결과에 따르면, ferrous sulfate 수용액은 3.
이론/모형
- Ferrous sulfate와 hemin의 농도에 따른 리 포좀의 산화뿐만 아니라 항산화제 인 ascorbic acid(20011M)와 a -tocopherol (200 μM) 에 의한 리포좀의 산화억제효과는 thiobarbituric acid reacting substances(TBARS) assay를 이용하여 측정하였다(10). 25℃에서 리포좀(10mM) 용액에 ferrous sulfate (2, 20, 2X102, 2X103, 2X104, 4X104 uM)와 hemin(2, 20, 2 x 102, 1 x 103 μM)의 농도를 변화시 키면서 첨가한 후에 반응시간(0.
- 리포좀(10 mg/mL)은 vortex 법을 사용하여 multilamellar vesicle(MLV)로 제조하였고, 이 리포좀의 구성 인지질로 egg phosphatidylcholine(EPC)-& 사용하였다. MLV(10 mg/ mL)를 제조하기 위하여 , chloroform에 용해된 EPC 10 mg을 vial에 넣은 후에 질소가스로 chloroform을 날려 보내 얇은지 질 막을 만들고, 여 기 에 Tris 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7) 또는 증류수 1 mL을 넣고 격 렬하게 voilex하였다.
- 여기서 첨가된 ascorbic acid는 앞의 결과에서 설명한 것처럼 ferrous sul- fate의 자체 산화를 방지 하기 위하여 사용된 것이다. 앞에서 설명한 실험방법에 따라, 제조된 MLV 내부로 포집되지 않은 ferrous sulfate와 ascorbic acid를 제거하기 위하여 centrifugation 법과 dialysis 법을 사용하였다. 이러한 과정을 통해 얻은 MLV의 농도는 8 mM이 었고 포집 된 ferrous sulfate 의 농도는 1.
- 여기 에서 철분 농도는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)의 Iron and Total Iron-binding Capacity Kit를 구입 하여 수정된 Stookey의 방법으로 결정하였다(11). 리포좀을 함유한 시료의 경우에는 리포좀에 의한 빛 산란을 제거하기 위해 10% Triton-X 100을 첨가하여 리포좀을 작게 단편화시킨 후에 정량하였다.
성능/효과
- 또한, ferrous sulfate에 의한 리포좀의 산화 정도는 hemin의 경우보다 낮은 것으로 관찰되었다. Ferrous sulfate의 자동산화를 억 제 하기 위하여 수용성 항산화제 인 ascorbic acid가 첨가되 었으나, 첨가된 ascorbic acid-c- ferrous sulfate와 hem~ in을 함유한 리포좀의 산화를 억제시키지 못했으며, 오히려 ferrous sulfate에 의한 리 포좀의 산화를 촉진시 키 는 것 으로관찰되었다. 여기에 지용성 항산화제인 Q— tocopherol을 추가적으로 첨가함으로써, ferrous sulfate의 자동산화를 억제하고 hemin과 ferrous sulfate에 의한 리포좀의 산화가 억제된 철분 함유 리포좀이 제조되었다.
- 7 mM이 었다. Ferrous sulfate의 포집 효율을 계산하기 위한 [ferrous sulfate]/[lipid] 몰 비율의 초기값과 최종값은 각각 8.3과 0.21이며, 이 값으로부터 계산된 ferrous sulfate의 포집효율은 0.21/8.3x100 = 2.5%로 나타났다. 이러한 결과를 철분(Fe*)의 양으로 계산을 하면 0.
- 리포좀의 산화를 최소화한 철분 함유 리포좀을 제조하기 위하여 , hemin과 fer~ rous sulfate에 의한 리포좀의 산화 정도가 측정되었다(13, 14). Fig. 1에서 보는 바와 같이, hemin에 의한 리포좀의 산화 정도는 [lipid]/[hemin]의 몰 비율(M/W이 630일 때를 정점으로 630보다 큰 6300에서는 상당히 감소하였으며, [lipid]/ [hemin]의 몰 비율(M/M)이 630보다 작은 경우에는 hemin 의 농도가 높을수록 산화 정도가 감소하는 경향을 보였다. 이러한 관찰은 Cannon 등에 의해 관찰된 결과와 일치하는 것이었다 (12).
- mM)의 산화 억 제 효과를 측정하였다. 그 결과, ascorbic acid는 hemin에 의한 리 포좀의 산화를 억 제하는 효과가 없는것으로 관찰되었다(Fig. 3). Hemine 리포좀의 지용성 영역에 포함되어 있고 ascorbic acid는 수용성 항산화제이므로, ascorbic acid가 hemin 에 의한 리 포좀의 산화를 억 제 하기 에는 물리적인 장벽이 있는 것으로 보인다.
- 즉, 황산염, 젖산염, 시 트르산염의 형태로 존재하는 철올 리포좀의 내부에 포집하여 유제품 등의 식품에 첨가하는 첨가제를 제조하였으며, 여기서 철을 2가로 환원된 상태로 유지 하기 위하여 ascorbic acid를 함께 포집한 것이다. 더군다나, 우리의 결과에 따르면 본 특허 에서 사용한 고농도의 ferrous sulfate는 EPC의 인지 질 이리 포 좀을 형성하는 것을 방해하는 것으로 관찰되었다. 앞의 결과를 요약하면, ascorbic acid는 feirous sulfate의 자동산화를 상당히 억 제하는 효과가 있었으나, ferrous sul- fate에 의한 리 포좀의 산화를 촉진시 키는 효과가 있었다.
- 더군다나, 우리의 결과에 따르면 본 특허 에서 사용한 고농도의 ferrous sulfate는 EPC의 인지 질 이리 포 좀을 형성하는 것을 방해하는 것으로 관찰되었다. 앞의 결과를 요약하면, ascorbic acid는 feirous sulfate의 자동산화를 상당히 억 제하는 효과가 있었으나, ferrous sul- fate에 의한 리 포좀의 산화를 촉진시 키는 효과가 있었다. 따라서, ascorbic acid는 수용액상의 ferrous sulfate의 자동산화를 억제하기 위해서는 필요하나, ascorbic acid의 첨가로 ferrous sulfate에 의해 촉진되는 리포좀의 산화를 억제하기 위한 또 다른 항산화제의 첨가가 필요하게 되었다.
- 5%로 나타났다. 이러한 결과를 철분(Fe*)의 양으로 계산을 하면 0.096 mg/mL이 되므로, 연령별 및 성별 1일당 철 권장량(5~18 mg)에 따라 섭취해야 하는 ferrous sulfate 함유 리포좀의 양 (mL)을 계산해 보면 최소 50mL에서 최대 190mL인 것으로 나타났다. 더군다나, 철분제재를 구강투여 했을 때는 투여 량중 위장관에서 흡수되는 양은 체내 철분 결핍 여하에 따라 변동이 있을 수 있으나 정상인인 경우 약 10%로 알려져 있다.
- 이와 같은 ferrous sulfate의 자동산화를 억 제하기 위하여 ascorbic acid를 일정하게 20 mM을 첨가하여 ascorbic acid의 효과를 앞에서와 같은 조건에서 관찰하였다. 이에 따르면, ascorbic acid가 ferrous sulfate의 자동산화를 억 제하는 효과가 있었으며 , 냉장 보관 시 그 효과가 더 오래 간다는 것이 관찰되었다(data not 아iown), 결국 충분한 양의 ascorbic acid를 첨가시킨다면 ferrous sulfate의 자동산화를 상당한 기간 동안 억제할 수있올 것이라는 결론을 얻었다.
- 철분공여 물질로 사용된 ferrous sulfate와 hemin의 상대적인 농도에 따라 다르지 만 철분 함유 리포좀의 산화는 리포좀을 이용한 철분 강화 식품첨가제를 구성하는 큰 제약인 것으로 나타났다. 따라서, 철분 함유 리 포좀이 산화에 대하여 구조적 안정성을 가지기 위해서 리포좀의 산화가 억제되는 방안이 검토되었다.
- 이러한 철분 함유 리포좀을 제조하는데 가장 큰 문제점은 ferrous sulf ate 의 자체 산화와 ferrous sulfate 와 hemin 으로인한 리 포좀의 지 질산화로 지적 되 었고, 이러한 산화과정을 최소화하는데 연구의 초점이 맞춰졌다. 최종적으로, 리포좀에 ascorbic acid와 a-tocopherol의 항산화제를 복합하여 사용함으로써 제품 내에서 철분으로 인한 반응성을 최소화하였다.
후속연구
- 또한, ferrous sulfate를 함유한 MLV를 centrifugation으로 농축을 한다면 고농도로 농축된 ferrous sulfate 함유 리포좀을 제조하는 것도 가능할 것이다. 더군다나 무기 철보다 흡수율이 좋은 헴철을 외부에서 단순히 첨가하는 것만으로 헴 철을 리포좀의 지용성 영역에 포집시키는 것이 가능하므로 보다 더 효과적인 철분 함유 리포좀의 제조가 가능하여 식품 첨가제로 활용하는 것이 가능할 것으로 보인다.
- 그러나, ascorbic acid는 철의 흡수를 촉진시키는 것으로 알려져 있으며 200 mg 이상이면 철의 홉수를 최소 30%나 증가시키는 것으로 알려져 있어서 ascorbic acid가 이미 복합 처방된 철분 함유 리포좀의 1일 섭취량은 다소 감소될 것으로 보인다. 또한, ferrous sulfate를 함유한 MLV를 centrifugation으로 농축을 한다면 고농도로 농축된 ferrous sulfate 함유 리포좀을 제조하는 것도 가능할 것이다. 더군다나 무기 철보다 흡수율이 좋은 헴철을 외부에서 단순히 첨가하는 것만으로 헴 철을 리포좀의 지용성 영역에 포집시키는 것이 가능하므로 보다 더 효과적인 철분 함유 리포좀의 제조가 가능하여 식품 첨가제로 활용하는 것이 가능할 것으로 보인다.
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