[국내논문]젖소 초유 중의 Insulin-like Growth Factor-1 함유 분획이 세포 성장에 미치는 영향 Effect of Bovine Colostral Whey Fraction containing Insulin-like Growth Factor on Cell Proliferation원문보기
젖소 초유 유청을 ultrafiltration으로서 30kDa 사이의 IGF-I rich fraction을 분획하였다. 분획한 IGF-I rich fraction은 SDS-PAGE와 Western blotting으로 IGF-I이 존재하는 것을 확인하였고, sandwich ELISA로써 그 함량을 측정한 결과 fraction중 IGF-I의 함량은 단백질 mg당 10ng으로 나타났다. IGF-I rich fraction으로 IEC-6, Detroit 551, EL-4 및 L6 in vitro세포의 증식에 미치는 효과를 실험한 결과 IEC-6 cell은 IGF-I 기준으로 10ng, 1 ng, 0.1ng, 0.01ng에서 각각 대조구에 비해서 60%, 53%, 30 그리고 20%의 세포증식효과를 나타내었다. IEC-6의 증식은 ICF-I의 투여량이 증가할수록 세포의 증식효과가 더 높게 나타났다. Detroit 551 cell은 10ng과 1ng수준에서 각각 56%와 26%의 세포증식 효과를 나타내었다. 그리고 EL-4 cell과 L6 cell은 10ng 수준에서 각각 53%와 46%의 세포증식 효과를 나타내었다. 모든 세포주에서 IGF-I 함유농도가 10 ng 투여구에서 세포 증식율이 가장 높았으며 IEC-6 cell, Detroit 551 및 EL-4 cell은 모두 약 60%의 세포 성장률을 나타내었고 L6 cell은 약 50%의 성장률을 보였다.
젖소 초유 유청을 ultrafiltration으로서 30kDa 사이의 IGF-I rich fraction을 분획하였다. 분획한 IGF-I rich fraction은 SDS-PAGE와 Western blotting으로 IGF-I이 존재하는 것을 확인하였고, sandwich ELISA로써 그 함량을 측정한 결과 fraction중 IGF-I의 함량은 단백질 mg당 10ng으로 나타났다. IGF-I rich fraction으로 IEC-6, Detroit 551, EL-4 및 L6 in vitro세포의 증식에 미치는 효과를 실험한 결과 IEC-6 cell은 IGF-I 기준으로 10ng, 1 ng, 0.1ng, 0.01ng에서 각각 대조구에 비해서 60%, 53%, 30 그리고 20%의 세포증식효과를 나타내었다. IEC-6의 증식은 ICF-I의 투여량이 증가할수록 세포의 증식효과가 더 높게 나타났다. Detroit 551 cell은 10ng과 1ng수준에서 각각 56%와 26%의 세포증식 효과를 나타내었다. 그리고 EL-4 cell과 L6 cell은 10ng 수준에서 각각 53%와 46%의 세포증식 효과를 나타내었다. 모든 세포주에서 IGF-I 함유농도가 10 ng 투여구에서 세포 증식율이 가장 높았으며 IEC-6 cell, Detroit 551 및 EL-4 cell은 모두 약 60%의 세포 성장률을 나타내었고 L6 cell은 약 50%의 성장률을 보였다.
Insulin-like growth factor-I (IGF-I) rich fraction, which was obtained molecules ranged between 30 kDa and 1 kDa, was fractionated by ultrafiltration from bovine colostral whey with 30 kDa and 1 kDa membrane. IGF-I included in fractionated IGF-I rich fraction was confirmed by SDS-PAGE and western bl...
Insulin-like growth factor-I (IGF-I) rich fraction, which was obtained molecules ranged between 30 kDa and 1 kDa, was fractionated by ultrafiltration from bovine colostral whey with 30 kDa and 1 kDa membrane. IGF-I included in fractionated IGF-I rich fraction was confirmed by SDS-PAGE and western blotting and then the quantity of IGF-I was measured by ELISA. IGF-I concentration in IGF-I rich fraction was 10ng/mg protein. Effect of IGF-I rich fraction on in vitro proliferation of several cells was tested. IEC-6 cell proliferation rate was increased 60%. 53%, 30%, and 20% at l0ng, 1ng, 0.1ng and IGF-I of IGF-I, respectively, compared to control group which was not supplemented by IGF-I rich fraction. IGF-I rich fraction stimulated in vitro proliferation of IEC-6 cell in a dose dependent manner by increasing cell number. Detroit 551 cell proliferation was enhanced 56% and 26% at 10ng and 1ng level of IGF-I, respectively, compared to control group. EL-4 cell and L6 cell proliferation was increased 53% and 46% at 10ng of IGF-I, respectively, compared to control group.
Insulin-like growth factor-I (IGF-I) rich fraction, which was obtained molecules ranged between 30 kDa and 1 kDa, was fractionated by ultrafiltration from bovine colostral whey with 30 kDa and 1 kDa membrane. IGF-I included in fractionated IGF-I rich fraction was confirmed by SDS-PAGE and western blotting and then the quantity of IGF-I was measured by ELISA. IGF-I concentration in IGF-I rich fraction was 10ng/mg protein. Effect of IGF-I rich fraction on in vitro proliferation of several cells was tested. IEC-6 cell proliferation rate was increased 60%. 53%, 30%, and 20% at l0ng, 1ng, 0.1ng and IGF-I of IGF-I, respectively, compared to control group which was not supplemented by IGF-I rich fraction. IGF-I rich fraction stimulated in vitro proliferation of IEC-6 cell in a dose dependent manner by increasing cell number. Detroit 551 cell proliferation was enhanced 56% and 26% at 10ng and 1ng level of IGF-I, respectively, compared to control group. EL-4 cell and L6 cell proliferation was increased 53% and 46% at 10ng of IGF-I, respectively, compared to control group.
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문제 정의
따라서 본 연구에서 IGF-I을 선택적으로 분리하기 위해서 사용한 ultrafiltration이 효과적으로 IGF-I을 포함하는 IGF-I 농축물을 제조하는데 적합한 방법으로 판단된다.
본 연구는 대부분 free IGF-I의 형태로 존재하는 24시간이 내의 초유를 이용하여 IGF-I rich 行彼仍!! 을 회수한 후 in vitro 에서 동물 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해서 실시하였다.
제안 방법
IGF-I의 분자량을 기초로 free IGF-I을 분리하기 위하여 30 kDa과 1 kDa의 ultrafiltration cartridge를 사용하여 분획하였다. 이 과정에서 retentate인 30 kDa 이상의 성분을 제거하고 free IGF-I을 포함하는 30 kDa과 1 kDa 사이의 IGF-I rich ☆action을 분리하여 SDS-PAGE(Fig.
Ultrafiltration에 의해 얻어진 30 kDa에서 1 kDa 범위의 IGF-I rich fiaction의 분리와 함유된 IGF-1을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시하였고(Laemmli, 1970) western blotting (Ho- ssenlopp et al., 1986)을 실시하여 IGF-I을 확인하였다. 그리고 IGF-1 rich faction에 함유하고 있는 IGF-I의 정량은 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay로 측정하였다(Battelli et al.
세포증식 효과의 측정은 Marin 등(1996)의 방법을 변형하여 실험하였고, 각 세포주의 적정 농도는 예비실험 결과에 준하여 정하였다. 각 세포는 적정 농도별로 96 well microplate (TPP, Swiss)에 분주한 후 처리 구의 경우 각각의 IGF-I rich fraction을 첨가하고 5% C6와 95%의 상대습도의 조건 하에서 37℃, 2일간 배양한 다음 세포의 증식은 3-(4, 5-Dimethyl- thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법 으로 540nm에서 흡광도를 측정(ELx 800, Biotec, USA)하였고 대조 구의 경우 IGF-I rich fiaction을 첨가하지 않고 처리 구와 동일한 조건에서 배양한 다음 측정하였으며, 처 리구의 세포 증식 율은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
세포증식 효과의 측정은 Marin 등(1996)의 방법을 변형하여 실험하였고, 각 세포주의 적정 농도는 예비실험 결과에 준하여 정하였다. 각 세포는 적정 농도별로 96 well microplate (TPP, Swiss)에 분주한 후 처리 구의 경우 각각의 IGF-I rich fraction을 첨가하고 5% C6와 95%의 상대습도의 조건 하에서 37℃, 2일간 배양한 다음 세포의 증식은 3-(4, 5-Dimethyl- thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법 으로 540nm에서 흡광도를 측정(ELx 800, Biotec, USA)하였고 대조 구의 경우 IGF-I rich fiaction을 첨가하지 않고 처리 구와 동일한 조건에서 배양한 다음 측정하였으며, 처 리구의 세포 증식 율은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
젖소 초유 유청을 ultrafiltration으로서 30kDa와 IkDa 사이의 IGF-1 rich 危故加을 분획 하였다. 분획 한 IGF-I rich :fractione SDS-PAGE와 Western blotting으로 IGF-1 이 존재하는 것을 확인하였고, sandwich ELISA로써 그 함량을 측정한 결과 危故珈중 IGF-1의 함량은 단백질 mg당 10 ng으로 나타났다.
본 연구에 사용된 세포주는 IEC-6(KCLB 21592), Detroit 551(KCLB 10110), EL-4(KCLB 40039), L6(KCLB 21458)로서한국세포주은행(KCLB) 으로부터 분양받은 후 계대 배양하여 사용하였다. 즉, 10%(v/v)의 fetal bovine serum, l%(v/v) 항생제 (penicillin 100unit/mL, streptomycin 100 “g/mL) 와 10 mM의HEPES buffer, 20mM의 L-glutamine을 함유한 DMEM(pH 7.2, Gibco/BRL, USA) 배지에서 배양하였다. 세포가 petri dish® 100)의 90% 정도로 충분히 성장하였을 때 trypsin/EDTA를 이용하여 세포를 petri dish로부터 떼어낸 후 1:9의 배율로 계대 배양하며 실험에 사용하였다.
대상 데이터
본 실험에서 IGF-I rich fraction 제조를 위해서 사용한 초유는 수원시 소재 축산농가에서 사육 중인 홀스타인으로부터 분만 후 24시간 이내에 착유한 초유를 사용하였다.
본 연구에 사용된 세포주는 IEC-6(KCLB 21592), Detroit 551(KCLB 10110), EL-4(KCLB 40039), L6(KCLB 21458)로서한국세포주은행(KCLB) 으로부터 분양받은 후 계대 배양하여 사용하였다. 즉, 10%(v/v)의 fetal bovine serum, l%(v/v) 항생제 (penicillin 100unit/mL, streptomycin 100 “g/mL) 와 10 mM의HEPES buffer, 20mM의 L-glutamine을 함유한 DMEM(pH 7.
2, Gibco/BRL, USA) 배지에서 배양하였다. 세포가 petri dish® 100)의 90% 정도로 충분히 성장하였을 때 trypsin/EDTA를 이용하여 세포를 petri dish로부터 떼어낸 후 1:9의 배율로 계대 배양하며 실험에 사용하였다.
이론/모형
, 1986)을 실시하여 IGF-I을 확인하였다. 그리고 IGF-1 rich faction에 함유하고 있는 IGF-I의 정량은 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay로 측정하였다(Battelli et al., 1999).
5로 조정하여 casein을 침전시키고 원심분리한 후 상 등 액인 유청을 회수하였다. 회수된 유청은 Hossner과 Yeinm (2000)의 방법에 준하여 30 kDa과 1 kDa(prep/scale-TFF, Millipore, USA)의 ultrafiltration catridge로 free IGF-I이 함유되어 있는 30 kDa과 1 kDa 사이의 IGF-I rich fiaction을 분리하였다 (Fig. 1). 이 모든 과정은 4C cold room에서 수행하였다.
성능/효과
IEC-6 cell(epithelial cell line)은 1 mg, mL IGF-I rich fraction처리구에서 대조구보다 약 60%의 세포성장율 증가를 보였으 며 100 ㎍/mL과 10 ㎍/ml에서는 각각 53%, 30%의 성장률 증 가를 나타내었다. Detroit 551(skin cell line)은 1 mg/mL에서처리구에서 대조구에 비해 약 56%의 세포성장율 증가를 나타내었고 100 ㎍/mL과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%, 15%의 성 장률 증가를 보였으며, EL-4(Th cell line)는 1 mg/mL 처리구 에서 대조구에 비해 약 55%의 세포 성장률 증가를 나타내었다. L6 cell(skeletal muscle cell)은 1 mg/mL 처리구에서 대조구에 비해 약 46%의 세포성 장율 증가를 보였고 100 ㎍/ml과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%와 20%의 세포성장률 증가를 나타내었다.
IEC-6 cell(epithelial cell line)은 1 mg, mL IGF-I rich fraction처리구에서 대조구보다 약 60%의 세포성장율 증가를 보였으 며 100 ㎍/mL과 10 ㎍/ml에서는 각각 53%, 30%의 성장률 증 가를 나타내었다. Detroit 551(skin cell line)은 1 mg/mL에서처리구에서 대조구에 비해 약 56%의 세포성장율 증가를 나타내었고 100 ㎍/mL과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%, 15%의 성 장률 증가를 보였으며, EL-4(Th cell line)는 1 mg/mL 처리구 에서 대조구에 비해 약 55%의 세포 성장률 증가를 나타내었다.
01 ng에서 각각 대조구에 비해서 60%, 53%, 30%, 그리고 20%의 세포증식효과를 나타내었다. IEC-6의 증식은 IGF-I의 투여 량이 증가할수록 세포의 증식효과가 더 높게 나타났다. Detroit 551 celle 10 ng과 1 ng 수준에서 각각 56%와 26%의 세포증식 효과를 나타내었다.
분획 한 IGF-I rich :fractione SDS-PAGE와 Western blotting으로 IGF-1 이 존재하는 것을 확인하였고, sandwich ELISA로써 그 함량을 측정한 결과 危故珈중 IGF-1의 함량은 단백질 mg당 10 ng으로 나타났다. IGF-1 rich faction으로 IEC-6, Detroit 551, EL-4 및 L6 in vitro 세포의 증식에 미치는 효과를 실험한 결과 IEC-6 celle IGF-I 기준으로 10 ng, 1 ng, 0.1 ng, 0.01 ng에서 각각 대조구에 비해서 60%, 53%, 30%, 그리고 20%의 세포증식효과를 나타내었다. IEC-6의 증식은 IGF-I의 투여 량이 증가할수록 세포의 증식효과가 더 높게 나타났다.
IGF-1을 함유하는 것으로 확인된 IGF-I rich fraction에서 IGF-1의 함량을 측정한 결과 IGF-I rich faction에는 단백질 1 mg 당 10 ng의 IGF-I의 함유되어 있는 것으로 확인되었다.
IGF-I rich fraction의 SDS-PAGE 결과 20 kDa 이하 성분만 확인되었으며 30 kDa 이상의 성분은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 ultrafiltration0] IGF-I rich faction을 선택적으로 분 리하는 과정에서 유청 중 30 kDa 이상의 거대분자를 효과적으로 제거할 수 있는 방법이라는 사실을 확인할 수 있었다.
Detroit 551(skin cell line)은 1 mg/mL에서처리구에서 대조구에 비해 약 56%의 세포성장율 증가를 나타내었고 100 ㎍/mL과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%, 15%의 성 장률 증가를 보였으며, EL-4(Th cell line)는 1 mg/mL 처리구 에서 대조구에 비해 약 55%의 세포 성장률 증가를 나타내었다. L6 cell(skeletal muscle cell)은 1 mg/mL 처리구에서 대조구에 비해 약 46%의 세포성 장율 증가를 보였고 100 ㎍/ml과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%와 20%의 세포성장률 증가를 나타내었다.
Detroit 551 celle 10 ng과 1 ng 수준에서 각각 56%와 26%의 세포증식 효과를 나타내었다. 그리고 EL-4 cell과 L6 celle 10 ng 수준에서 각각 53%와 46%의 세포증식 효과를 나타내었다. 모든 세포주 에서 IGF-1 함유농도가 10 ng 투여구에서 세포 증식율이 가장 높았으며 IEC-6 cell, Detroit 551 및 EL-4 celle 모두 약 60%의 세포 성 장률을 나타내었고 L6 celle 약 50%의 성 장률 을 보였다.
IGF-I과 세포증식 효과에 대해서 Qureshi 등(1997)의 보고 에 의하면 human esophageal epithelial cell에 IGF-1 을 처리 했을 때 세포수가 농도 의 존적으로 증가함을 나타내었다. 또한 세포배양 3일 후는 대조구가 4.5xl05cell 인데 비해 IGF-I 처리구는 9×105cell로 약 두 배가 증가한 것과 비교해보면 본 실험의 결과에서도 동일한 경향을 나타내는 것으로 보아 IGF-1 이 세포의 증식을 촉진한다는 사실을 확인할 수 있었다. 그리고 Belford 등(1995)은 recombinant IGE와 EGF를 각각 50ng/mL의 농도로 투여하였을 때 L6 skeletal muscle myoblast, Balb/c 3T3 fibroblasts 및 human skin fibroblast SFcell의 세포 성장에 미치는 영향을 평가한 결과 IGF는 Balb/c 3T3 fibroblast와 human skin fibroblast SF 에서 각각 대조구에 비해 약 8% 미 만의 성 장률 증가를 보였고, L6 skeletal muscle myoblast 에서는 약 30%의 성장률 증가를 나타내었으나 EGF 는 Balb/c 3T3 fibroblast 와 L6 skeletal muscle myoblast에서는5% 이하의 성장률 증가를 보이는 것으로 보고되고 있으며L6 skeletal muscle myoblast의 경우 EGF보다 IGF-I 이 더 많은영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.
그리고 EL-4 cell과 L6 celle 10 ng 수준에서 각각 53%와 46%의 세포증식 효과를 나타내었다. 모든 세포주 에서 IGF-1 함유농도가 10 ng 투여구에서 세포 증식율이 가장 높았으며 IEC-6 cell, Detroit 551 및 EL-4 celle 모두 약 60%의 세포 성 장률을 나타내었고 L6 celle 약 50%의 성 장률 을 보였다.
본 실험에서 나타난 IGF-I의 L6 skeletal muscle myoblast 세 포의 증진효과는 Belford 등(1995)이 보고한 recombinant IGF-I의 투입농도 보다 훨씬 낮은 수준에서도 더 높은 세포 증식효과를 나타내었다. 이러한 결과는 초유 유청에서 유래 하는 IGF-I rich fraction 중에는 IGF-I 뿐만 아니 르+ 세포성장에 영향을 주는 생리활성 peptide가 함유되어 있어 기 인된 결과 로 생각된다.
젖소 초유 유청을 ultrafiltration으로서 30kDa와 IkDa 사이의 IGF-1 rich 危故加을 분획 하였다. 분획 한 IGF-I rich :fractione SDS-PAGE와 Western blotting으로 IGF-1 이 존재하는 것을 확인하였고, sandwich ELISA로써 그 함량을 측정한 결과 危故珈중 IGF-1의 함량은 단백질 mg당 10 ng으로 나타났다. IGF-1 rich faction으로 IEC-6, Detroit 551, EL-4 및 L6 in vitro 세포의 증식에 미치는 효과를 실험한 결과 IEC-6 celle IGF-I 기준으로 10 ng, 1 ng, 0.
IGF-I rich fraction의 SDS-PAGE 결과 20 kDa 이하 성분만 확인되었으며 30 kDa 이상의 성분은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 ultrafiltration0] IGF-I rich faction을 선택적으로 분 리하는 과정에서 유청 중 30 kDa 이상의 거대분자를 효과적으로 제거할 수 있는 방법이라는 사실을 확인할 수 있었다.
참고문헌 (13)
Battelli, M.G., Abbondanza, A., Musiani, S., Buonamici, P. Trocchi, P. L., Tazzari, L., and Gramantieri, F. S. (1999) Determination of xanthine oxidase in human serum by a competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinica. Chimica. Acta. 281, 147
Belford, D. A., Rogers, M. L., Regester, G. O., Francis, G. L., Smithers, G. W., Liepe, I. J., Priebe, I. K., and Ballard, F. J. (1995) Milk-derived growth factors as serum supplements for the growth of fibroblast and epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. BioI. Ani. 31, 752-760
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Marin, M. L., Murtha, J., Dong, W., and Pestka, J. J. (1996) Effects of mycotoxins on cytokine production and prolife-ration EL-4 thymoma cells. J. Toxicol. Environ. Health 48(4), 379-396
Qureshi, F. G., Tchorzewski, M. T., Dimcan, C. J., and Harmon, J. W. (1997) EGF and IGF-I synergistically stimulate proliferation of human esophageal epithelial cells. J. Surg. Res. 69(2), 354-358
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