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문제 정의
- 따라서 본 연구에서 IGF-I을 선택적으로 분리하기 위해서 사용한 ultrafiltration이 효과적으로 IGF-I을 포함하는 IGF-I 농축물을 제조하는데 적합한 방법으로 판단된다.
- 본 연구는 대부분 free IGF-I의 형태로 존재하는 24시간이 내의 초유를 이용하여 IGF-I rich 行彼仍!! 을 회수한 후 in vitro 에서 동물 세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해서 실시하였다.
제안 방법
- IGF-I의 분자량을 기초로 free IGF-I을 분리하기 위하여 30 kDa과 1 kDa의 ultrafiltration cartridge를 사용하여 분획하였다. 이 과정에서 retentate인 30 kDa 이상의 성분을 제거하고 free IGF-I을 포함하는 30 kDa과 1 kDa 사이의 IGF-I rich ☆action을 분리하여 SDS-PAGE(Fig.
- Ultrafiltration에 의해 얻어진 30 kDa에서 1 kDa 범위의 IGF-I rich fiaction의 분리와 함유된 IGF-1을 확인하기 위하여 SDS-PAGE를 실시하였고(Laemmli, 1970) western blotting (Ho- ssenlopp et al., 1986)을 실시하여 IGF-I을 확인하였다. 그리고 IGF-1 rich faction에 함유하고 있는 IGF-I의 정량은 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay로 측정하였다(Battelli et al.
- 세포증식 효과의 측정은 Marin 등(1996)의 방법을 변형하여 실험하였고, 각 세포주의 적정 농도는 예비실험 결과에 준하여 정하였다. 각 세포는 적정 농도별로 96 well microplate (TPP, Swiss)에 분주한 후 처리 구의 경우 각각의 IGF-I rich fraction을 첨가하고 5% C6와 95%의 상대습도의 조건 하에서 37℃, 2일간 배양한 다음 세포의 증식은 3-(4, 5-Dimethyl- thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법 으로 540nm에서 흡광도를 측정(ELx 800, Biotec, USA)하였고 대조 구의 경우 IGF-I rich fiaction을 첨가하지 않고 처리 구와 동일한 조건에서 배양한 다음 측정하였으며, 처 리구의 세포 증식 율은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
- 세포증식 효과의 측정은 Marin 등(1996)의 방법을 변형하여 실험하였고, 각 세포주의 적정 농도는 예비실험 결과에 준하여 정하였다. 각 세포는 적정 농도별로 96 well microplate (TPP, Swiss)에 분주한 후 처리 구의 경우 각각의 IGF-I rich fraction을 첨가하고 5% C6와 95%의 상대습도의 조건 하에서 37℃, 2일간 배양한 다음 세포의 증식은 3-(4, 5-Dimethyl- thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석법 으로 540nm에서 흡광도를 측정(ELx 800, Biotec, USA)하였고 대조 구의 경우 IGF-I rich fiaction을 첨가하지 않고 처리 구와 동일한 조건에서 배양한 다음 측정하였으며, 처 리구의 세포 증식 율은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
- 젖소 초유 유청을 ultrafiltration으로서 30kDa와 IkDa 사이의 IGF-1 rich 危故加을 분획 하였다. 분획 한 IGF-I rich :fractione SDS-PAGE와 Western blotting으로 IGF-1 이 존재하는 것을 확인하였고, sandwich ELISA로써 그 함량을 측정한 결과 危故珈중 IGF-1의 함량은 단백질 mg당 10 ng으로 나타났다.
- 본 연구에 사용된 세포주는 IEC-6(KCLB 21592), Detroit 551(KCLB 10110), EL-4(KCLB 40039), L6(KCLB 21458)로서한국세포주은행(KCLB) 으로부터 분양받은 후 계대 배양하여 사용하였다. 즉, 10%(v/v)의 fetal bovine serum, l%(v/v) 항생제 (penicillin 100unit/mL, streptomycin 100 “g/mL) 와 10 mM의HEPES buffer, 20mM의 L-glutamine을 함유한 DMEM(pH 7.2, Gibco/BRL, USA) 배지에서 배양하였다. 세포가 petri dish® 100)의 90% 정도로 충분히 성장하였을 때 trypsin/EDTA를 이용하여 세포를 petri dish로부터 떼어낸 후 1:9의 배율로 계대 배양하며 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 IGF-I rich fraction 제조를 위해서 사용한 초유는 수원시 소재 축산농가에서 사육 중인 홀스타인으로부터 분만 후 24시간 이내에 착유한 초유를 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 세포주는 IEC-6(KCLB 21592), Detroit 551(KCLB 10110), EL-4(KCLB 40039), L6(KCLB 21458)로서한국세포주은행(KCLB) 으로부터 분양받은 후 계대 배양하여 사용하였다. 즉, 10%(v/v)의 fetal bovine serum, l%(v/v) 항생제 (penicillin 100unit/mL, streptomycin 100 “g/mL) 와 10 mM의HEPES buffer, 20mM의 L-glutamine을 함유한 DMEM(pH 7.
- 2, Gibco/BRL, USA) 배지에서 배양하였다. 세포가 petri dish® 100)의 90% 정도로 충분히 성장하였을 때 trypsin/EDTA를 이용하여 세포를 petri dish로부터 떼어낸 후 1:9의 배율로 계대 배양하며 실험에 사용하였다.
이론/모형
- , 1986)을 실시하여 IGF-I을 확인하였다. 그리고 IGF-1 rich faction에 함유하고 있는 IGF-I의 정량은 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay로 측정하였다(Battelli et al., 1999).
- 5로 조정하여 casein을 침전시키고 원심분리한 후 상 등 액인 유청을 회수하였다. 회수된 유청은 Hossner과 Yeinm (2000)의 방법에 준하여 30 kDa과 1 kDa(prep/scale-TFF, Millipore, USA)의 ultrafiltration catridge로 free IGF-I이 함유되어 있는 30 kDa과 1 kDa 사이의 IGF-I rich fiaction을 분리하였다 (Fig. 1). 이 모든 과정은 4C cold room에서 수행하였다.
성능/효과
- IEC-6 cell(epithelial cell line)은 1 mg, mL IGF-I rich fraction처리구에서 대조구보다 약 60%의 세포성장율 증가를 보였으 며 100 ㎍/mL과 10 ㎍/ml에서는 각각 53%, 30%의 성장률 증 가를 나타내었다. Detroit 551(skin cell line)은 1 mg/mL에서처리구에서 대조구에 비해 약 56%의 세포성장율 증가를 나타내었고 100 ㎍/mL과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%, 15%의 성 장률 증가를 보였으며, EL-4(Th cell line)는 1 mg/mL 처리구 에서 대조구에 비해 약 55%의 세포 성장률 증가를 나타내었다. L6 cell(skeletal muscle cell)은 1 mg/mL 처리구에서 대조구에 비해 약 46%의 세포성 장율 증가를 보였고 100 ㎍/ml과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%와 20%의 세포성장률 증가를 나타내었다.
- IEC-6 cell(epithelial cell line)은 1 mg, mL IGF-I rich fraction처리구에서 대조구보다 약 60%의 세포성장율 증가를 보였으 며 100 ㎍/mL과 10 ㎍/ml에서는 각각 53%, 30%의 성장률 증 가를 나타내었다. Detroit 551(skin cell line)은 1 mg/mL에서처리구에서 대조구에 비해 약 56%의 세포성장율 증가를 나타내었고 100 ㎍/mL과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%, 15%의 성 장률 증가를 보였으며, EL-4(Th cell line)는 1 mg/mL 처리구 에서 대조구에 비해 약 55%의 세포 성장률 증가를 나타내었다.
- 01 ng에서 각각 대조구에 비해서 60%, 53%, 30%, 그리고 20%의 세포증식효과를 나타내었다. IEC-6의 증식은 IGF-I의 투여 량이 증가할수록 세포의 증식효과가 더 높게 나타났다. Detroit 551 celle 10 ng과 1 ng 수준에서 각각 56%와 26%의 세포증식 효과를 나타내었다.
- 분획 한 IGF-I rich :fractione SDS-PAGE와 Western blotting으로 IGF-1 이 존재하는 것을 확인하였고, sandwich ELISA로써 그 함량을 측정한 결과 危故珈중 IGF-1의 함량은 단백질 mg당 10 ng으로 나타났다. IGF-1 rich faction으로 IEC-6, Detroit 551, EL-4 및 L6 in vitro 세포의 증식에 미치는 효과를 실험한 결과 IEC-6 celle IGF-I 기준으로 10 ng, 1 ng, 0.1 ng, 0.01 ng에서 각각 대조구에 비해서 60%, 53%, 30%, 그리고 20%의 세포증식효과를 나타내었다. IEC-6의 증식은 IGF-I의 투여 량이 증가할수록 세포의 증식효과가 더 높게 나타났다.
- IGF-1을 함유하는 것으로 확인된 IGF-I rich fraction에서 IGF-1의 함량을 측정한 결과 IGF-I rich faction에는 단백질 1 mg 당 10 ng의 IGF-I의 함유되어 있는 것으로 확인되었다.
- IGF-I rich fraction의 SDS-PAGE 결과 20 kDa 이하 성분만 확인되었으며 30 kDa 이상의 성분은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 ultrafiltration0] IGF-I rich faction을 선택적으로 분 리하는 과정에서 유청 중 30 kDa 이상의 거대분자를 효과적으로 제거할 수 있는 방법이라는 사실을 확인할 수 있었다.
- Detroit 551(skin cell line)은 1 mg/mL에서처리구에서 대조구에 비해 약 56%의 세포성장율 증가를 나타내었고 100 ㎍/mL과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%, 15%의 성 장률 증가를 보였으며, EL-4(Th cell line)는 1 mg/mL 처리구 에서 대조구에 비해 약 55%의 세포 성장률 증가를 나타내었다. L6 cell(skeletal muscle cell)은 1 mg/mL 처리구에서 대조구에 비해 약 46%의 세포성 장율 증가를 보였고 100 ㎍/ml과 10 ㎍/mL에서는 각각 26%와 20%의 세포성장률 증가를 나타내었다.
- Detroit 551 celle 10 ng과 1 ng 수준에서 각각 56%와 26%의 세포증식 효과를 나타내었다. 그리고 EL-4 cell과 L6 celle 10 ng 수준에서 각각 53%와 46%의 세포증식 효과를 나타내었다. 모든 세포주 에서 IGF-1 함유농도가 10 ng 투여구에서 세포 증식율이 가장 높았으며 IEC-6 cell, Detroit 551 및 EL-4 celle 모두 약 60%의 세포 성 장률을 나타내었고 L6 celle 약 50%의 성 장률 을 보였다.
- IGF-I과 세포증식 효과에 대해서 Qureshi 등(1997)의 보고 에 의하면 human esophageal epithelial cell에 IGF-1 을 처리 했을 때 세포수가 농도 의 존적으로 증가함을 나타내었다. 또한 세포배양 3일 후는 대조구가 4.5xl05cell 인데 비해 IGF-I 처리구는 9×105cell로 약 두 배가 증가한 것과 비교해보면 본 실험의 결과에서도 동일한 경향을 나타내는 것으로 보아 IGF-1 이 세포의 증식을 촉진한다는 사실을 확인할 수 있었다. 그리고 Belford 등(1995)은 recombinant IGE와 EGF를 각각 50ng/mL의 농도로 투여하였을 때 L6 skeletal muscle myoblast, Balb/c 3T3 fibroblasts 및 human skin fibroblast SFcell의 세포 성장에 미치는 영향을 평가한 결과 IGF는 Balb/c 3T3 fibroblast와 human skin fibroblast SF 에서 각각 대조구에 비해 약 8% 미 만의 성 장률 증가를 보였고, L6 skeletal muscle myoblast 에서는 약 30%의 성장률 증가를 나타내었으나 EGF 는 Balb/c 3T3 fibroblast 와 L6 skeletal muscle myoblast에서는5% 이하의 성장률 증가를 보이는 것으로 보고되고 있으며L6 skeletal muscle myoblast의 경우 EGF보다 IGF-I 이 더 많은영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.
- 그리고 EL-4 cell과 L6 celle 10 ng 수준에서 각각 53%와 46%의 세포증식 효과를 나타내었다. 모든 세포주 에서 IGF-1 함유농도가 10 ng 투여구에서 세포 증식율이 가장 높았으며 IEC-6 cell, Detroit 551 및 EL-4 celle 모두 약 60%의 세포 성 장률을 나타내었고 L6 celle 약 50%의 성 장률 을 보였다.
- 본 실험에서 나타난 IGF-I의 L6 skeletal muscle myoblast 세 포의 증진효과는 Belford 등(1995)이 보고한 recombinant IGF-I의 투입농도 보다 훨씬 낮은 수준에서도 더 높은 세포 증식효과를 나타내었다. 이러한 결과는 초유 유청에서 유래 하는 IGF-I rich fraction 중에는 IGF-I 뿐만 아니 르+ 세포성장에 영향을 주는 생리활성 peptide가 함유되어 있어 기 인된 결과 로 생각된다.
- 젖소 초유 유청을 ultrafiltration으로서 30kDa와 IkDa 사이의 IGF-1 rich 危故加을 분획 하였다. 분획 한 IGF-I rich :fractione SDS-PAGE와 Western blotting으로 IGF-1 이 존재하는 것을 확인하였고, sandwich ELISA로써 그 함량을 측정한 결과 危故珈중 IGF-1의 함량은 단백질 mg당 10 ng으로 나타났다. IGF-1 rich faction으로 IEC-6, Detroit 551, EL-4 및 L6 in vitro 세포의 증식에 미치는 효과를 실험한 결과 IEC-6 celle IGF-I 기준으로 10 ng, 1 ng, 0.
- IGF-I rich fraction의 SDS-PAGE 결과 20 kDa 이하 성분만 확인되었으며 30 kDa 이상의 성분은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 ultrafiltration0] IGF-I rich faction을 선택적으로 분 리하는 과정에서 유청 중 30 kDa 이상의 거대분자를 효과적으로 제거할 수 있는 방법이라는 사실을 확인할 수 있었다.
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