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문제 정의
- 본 실험은 도축장에서 손쉽게 구할 수 있는 난소를 이용하여 한우 체외 수정란을 다량 생산하고, 한우 체외수정란을 Holstein 암소에 이식한 후 수태율에 미치는 영향을 조사하고, 수정란이 식기법을 확립하여 수정란이식 기술을 실용화하 고자 실시하였다.
제안 방법
- 체외배양 6~9일째의 체외수정란을 vitrification 방법을 이용하여 동결을 실시하였다(Saito 등, 1994). 기본 동결액으로 D.PBS를 이용하여 A 동 결액은 기본동결액에 10% Glycerol(GL), 0.125 M Sucrose, 0.125 M Glucose, 20%의 Calf serum (CS)을 첨가, B 동결액은 10% GL, 10% Ethylene Glyc이(EG), 0.25 M Sucrose, 0.25 M Glucose, 20% CS를 첨가하였고, C 동결액은 20% GL, 20% EG, 0.375 M Sucrose, 20% CS를 첨가하여 만들었다.
- 동결된 수정란의 융해는 20C 항온수조에서 10 ~15초간 융해 후 D-PBS에 0.5M, 0.25M Sucrose융해액을 만들어 각각 5분씩 침적 후 회복되는 수정란을 수정란 이식에 이용하였다.
- 발정일(0일에 hCG 1500IU(Chorulon, Intervert) 를 근육주사한 후, 다음 날(1 일)에 GnRH (Recep- tal, Intervert)를 5 ml 근육주사하여 황체의 기능을 원활하게 한 후 수정란을 이식하여 임신율을 증대 시켰다.
- 5xi06 정자/ml가 되도록 정자부유액을 준비하였다. 준비된 정자부유액 50 ul를 난포란이 있는 소적내에 첨가하여 체외수정을 실시하였다.
- 도축장에서 회수한 소의 난소를 2시간 이내에 멸균 생리식염수에 침적하여 실험실로 운반한 후 미성숙난자를 채취하였다. 채취된 난포란의 성숙 배양을 위하여 성숙배양액 (TCM-199) 에 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Gibco)과 호르몬(FSH 0.5 ug/ml, LH 5 jtzg/ml 및 Estradiol 1 ug/ml, Sig ma) 이첨가된 성숙 배양액에서 20~22시간 동안 성숙배양시 켰다.
- 체외 수정란의 동결은 실온(22~28C에서 수정란을 D-PBS로 2~3회 세척후 A 및 B 동결액에서 5분, C 동결액에서 1분간 침지시킨 후 0.25 ml straw에 주입하여 1분 이내에 액체질소에 침적하여 동결을 실시하였다.
- 체외성숙 후 체외수정액은 Brackett와 Oliphant 배양액 (BO 배양액, Brackett와 Oliphant, 1975)에 20 /zg/ml heparin과 20 mg/ml bovine serum al bumin (BSA ; Sig ma)을 첨가한 배양액으로 50 ul의 소적을 만들고 체외 성숙된 난포란(10~15개)을 소적배양액에 옮겼다. 체외 수정용 정자의 준비는 동결정액을 이용하여 융해후 BO 배양액에 10 mM Caffeineo] 함유된 배양액과 흔합하여 2회 원심분리(1,500 rprn, 10분)하여 정자농도가 2.
- 5 mM taurine을 첨가하여 이용하였다. 체외수정 6~8시간 후에 CRiaa 배양액으로 4~5회 세척한 후 40~44시간 동안 체외배양을 실시하여 2~8세포기로 발육이 진행된 수정란만을 선별하여 15개씩 100 ul 소적에 옮긴 후 48시간마다 배양액을 교환하면서 6~9일 동안의 체외배양을 실시한 후 생산된 상실배 이상의 체외수정란을 수정란 이식 실험에 이용하였다.
대상 데이터
- 도축장에서 회수한 소의 난소를 2시간 이내에 멸균 생리식염수에 침적하여 실험실로 운반한 후 미성숙난자를 채취하였다. 채취된 난포란의 성숙 배양을 위하여 성숙배양액 (TCM-199) 에 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Gibco)과 호르몬(FSH 0.
성능/효과
- Table 2에 요약한 것과 같이 발육단계에 따른 수태성적은 상실배, 초기 거반포, 배반포 및 확장배반포 수정란에서 각각 20.0%, 61.1%, 64.7% 및69.5%로서 확장 배반포기 수정란이 가장 좋은 수태 성적을 나타냈다.
- Table 3에 나타난 바와 같이 황체가 형성된 자궁각에 수정란을 이식한 결과 수태율이 70.1% (61/87)로서 황체가 형성된 반대편 자궁각에 이식한 수태율 62.5%(55/88)보다 우수한 성적을 나타 냈다.
- Table 4에서 나타난 바와 같이 황체의 직경이 1.5 cm 이상이고, 명확한 crown을 형성하고 있는 것(Good)이 이식 후 수태율이 73.6%로서 황체의 직경이 1.5 cm 이하이고 crown이 확인되지 않은 것 (Fair)의 수태율 62.9%와 황체가 낭종식으로 촉진되어 있지 않는 것(Poor)의 수태율 50.0%보다 우수한 수태성적을 나타냈다.
- Table 5에 나타난 바와 같이 공란우와 수란우의 발정이 일치하는 경우(0일) 이식 후 수태율이 72.6 %였으며, 발정동기화의 1일 차이가 나는 경우는 수태율이 66.3%(55/83), 2일 차이가 나는 경우는 수태율이 42.1%( 8/19)로서, 공란우와 수란우의 발정이 일치할 경우 수태성적이 향상되는 것으로 나타났다.
- 그러나 본 실험의 결과 경산우 70.6% 및 미경산 우 59.1%의 수태성적을 얻어, 경산우가 미경산우 보다 수태율이 높은 것으로 나타났다. 이러한 성적은 Broadbent 등(1991)이 보고한 경산우보다 미경 산우가 수태율이 높았다고 보고한 결과와는 상반된 결과를 나타냈다.
- 또한 수정란 발육단계에 따른 수태율은 확장배 반포기 수정 란이 69.5%로서 가장 높은 수태성적을 나타냈다. 이러한 결과는 Hasler 등(2003)이 보고한 확장배반포기 수정란이식이 여타 발육단계보다 높은 성적을 얻었다는 보고와 일치하는 경향을 나타냈으나, Wurth 등(1994)은 체외수정란을 수란우에 이식하여 상실배기 수정란이 79%의 수태율을 나타내어 초기배반포(38%), 배반포(40%), 확장배 반포(34%)기 수정란에 비하여 높은 수태성적을 나타냈다는 보고와는 상반된 결과를 나타냈다.
- 또한 황체상태 A, B 및 C등급을 각각 수란우에 이식한 결과, 73.6%, 62.9% 및 50.0%를 나타냈다. 이상의 결과는 석 등(1983)이 보고한 양질의 황체 형성이 이식 후 수태율을 증진시킨다는 연구 결과와 일치하는 경향을 나타냈으나, Niemann 등 (1985)은 황체상태 A, B 및 C등급에서 각각 54.
- 본 실험에서 체외수정란의 체외 배양일수에 따른 수태율은 발육단계에 관계없이 체외배양 7일째 생산된 수정란이 68.2%의 수태성적을 나타내어 6 일(59.4%), 8일(66.0%) 및 9일(100%)보다 높은 결과를 나타냈다. 이상의 성적은 체외배양 7일에 생산된 체외수정란의 이식 후 수태성적이 좋았다는Wurth 등(1994)과 Hasler 등(2003)의 성적과 일치하는 경향을 나타냈다.
- 본 실험에서는 수란우에 수정란을 이식하기 전에 hCG와 GnRH Hormone을 투여한 결과 Hor- mone처리구의 수태율이 69.9%으로서 무처리구의 수태율 63.0%보다 다소 높은 성적을 얻었다. 이상의 결과는 수정란 이식 전 hCG 1500 IU을 근육주 사한 경우 수태율이 51.
- 본 실험에서는 수란우에 신선란과 동결란을 이식하여 각각 70.6%와 36.4%의 수태성적을 보여, Hasler 등(2003)이 보고한 동결란을 이식하여 42% 의 수태율과 Wurth 등(1994)이 보고한 동결란 수태율 24%와 비슷한 수태율을 나타냈다. 이와 같은 성적을 얻은 것은 동결란이 동결융해 과정에서 손상을 입어 수태율이 저하되고 또한 동결융해에 따른 수정란 세포의 감소로 신선란에 비하여 embryonic signal이 적어서 수태율이 떨어지는 것으로 생각된다.
- 본 실험의 인공수정 후 황체반대측에 체외수정란 1개를 추가 이식한 수태율은 90%로서 Lu와 Rolge(1991)가 보고한 수태율 75%와 Suzuki 등 (1994)이 보고한 69.6%의 수태율보다는 높은 성적을 얻었으나, 이식두수가 적어 본 실험의 결과만을 볼 때 단태 유기법과 쌍태 유기법의 수태 성적을 비교하기에는 다소 무리가 있는 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 공란우와 수란우의 발정이 일치 하는 경우(0일) 이식 후 수태율이 72.6%로서, 공란 우와 수란우의 발정이 일치할 경우 수태성적이 향상되는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 New- comb(1979)와 Sreenan 등(1979)이 수란우와 공란우의 발정동기화가 일치할수록 수태성적이 좋았다고 보고한 결과와 일치하는 경향을 보였으나, Putney 등(1988)이 보고한 수란우와 이식한 수정 란 사이의 발정동기 T일 때 가장 높은 수태율을 얻었다는 결과와는 상이한 결과를 보였다.
- 본 연구에서는 황체가 형성된 자궁각에 수정란을 이식한 결과 수태율이 70.1%로서 황체가 형성된 반대편 자궁각에 이식한 수태율 62.5%보다 높은 성적을 나타냈다. 이상의 결과는 황체가 형성된 쪽에 수정란을 이식하였을 때 수태율이 좋았다고 보고한 Sreenan 등(1976), Tervit 등(1977) 및 New- comb(1979)의 결과와 유사한 경향을 나타냈다.
- 2, 42 및 60%의 수태율을 나타냈다고 보고하여 본 실험과는 상이한 결과를 나타냈다. 본 연구의 결과로 볼 때 황체가 뚜렷하게 형성되는 것은 progesterone 분비가 왕성하여 수태율을 향상시키는 것으로 생각된다.
- 0%보다 다소 높은 성적을 얻었다. 이상의 결과는 수정란 이식 전 hCG 1500 IU을 근육주 사한 경우 수태율이 51.7%로서 무처리구 34.5% 보다 우수하였다는 Nishgai 등(2002)의 결과와 유사한 경향을 보였다.
후속연구
- 수정란 이식 기술에 의한 수태율 향상을 위하여는 건강한 종빈우를 이용한 양질의 체내 수정란 확보, progesterone, hCG, GnRH 또는 intra- vaginal progesterone releasing device(PRID 또는 CIDR)와 같은 hormone 투여에 의한 수란우와 공란우의 발정 동기화 및 정확한 발정유도에 의한 수정 적기 판정 등으로 수태율 향상을 도모하고있으나(Walton 등, 1986 ; Elliington 등 1991 ; Looney 등, 1999), 괄목할 성적을 거두지 못하고 앞 으로 더욱 연구되어야 할 과제로 남아있다. 수정란 이식 기술을 이용하여 한우사육 두수를 증가시키고 유전적으로 우수한 한우을 대량 생산할 수 있는 기술이 확립된다면, 한우 가격의 불안정과 사료가격의 상승으로 불안해 있는 양축가의 사기증진과 농가 소득 증대에 기여할 것이다.
- 수정란 이식 기술에 의한 수태율 향상을 위하여는 건강한 종빈우를 이용한 양질의 체내 수정란 확보, progesterone, hCG, GnRH 또는 intra- vaginal progesterone releasing device(PRID 또는 CIDR)와 같은 hormone 투여에 의한 수란우와 공란우의 발정 동기화 및 정확한 발정유도에 의한 수정 적기 판정 등으로 수태율 향상을 도모하고있으나(Walton 등, 1986 ; Elliington 등 1991 ; Looney 등, 1999), 괄목할 성적을 거두지 못하고 앞 으로 더욱 연구되어야 할 과제로 남아있다. 수정란 이식 기술을 이용하여 한우사육 두수를 증가시키고 유전적으로 우수한 한우을 대량 생산할 수 있는 기술이 확립된다면, 한우 가격의 불안정과 사료가격의 상승으로 불안해 있는 양축가의 사기증진과 농가 소득 증대에 기여할 것이다.
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