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- 1)ND: not detected.
- A: Effect of temperature on P-mannanaset B: Effect of pH on P-mannanase.
제안 방법
- 안정성의 성질을 규명하였다. 최적 pH는 정제효소를 이용하여 pH 2~8, 50℃에서, 최적 온도는 상기 에서 사용한 동일 효소를 이용하여 pH 6, 20~80℃에서 효소활성을 측정하였 匸" pH 안정성은 동일효소를 pH 2~8의 Mcllvaine buffer solution을 이용하여 최적 온도에서 1시간 preincubation 후, 온도 안정 성은 상기 에서 사용한 동일효소를 최적 pH의 Me- Ilvaine buffer solution을 이용중卜여 20~80℃의 범위로 ]시간 preincubation 후, pH 6, 50℃에서 활성을 측정하였다.
- 1st activated carbon column chromatography# 이용한 분리 : 효소액 300 mL(10 units)에 대해 0.5% konjac glucomannan을 50℃, 24시간 가수분해 후 TLC로 pattern을 검토한 후 activated carbon column chromatography를 이용해 당을 분리 하였다. 즉 activated carbon powder를 100℃ 1시 간 가열한 후 column(4 x 90 cm)에 충진시 키고, 증류수를이 용하여 24시간 평 형 화시 킨 후 당용액 을 주입 하고, 250 mL/ hr 유속으로 tube당 50 mL씩 ethanol 0~30%의 linear gra- dient법으로 당올 분리하였다.
- 2nd sephadex G-25 g니 filtration를 이용한 분리 : Activated carbon column chromatography에서 분리한 당중 phenol-sulfuric acid법(17)에 의해서 총당함량을 측정한 후 TLC 및 FACE를 이용하여 중합도를 비교하였다. 주요 생성물인 중합도별 fraction을 다시 회수하여 sephadex G-25를 이용하여 분리하였다.
- Bifidobacteriume 균주0 longum, B. bifidum, B. irfiin- tis, B. adolescentis, B. animalis, B. b厂四明에 대한 생육 촉진 활성을 측정하기 위해 MRS media에서 탄소원을 dextrose 대신에 조제된 중합도별 glucomannooligosaccharide 를 각각 첨가한 후 측정하였다. 중합도별 glucomannooligo- saccharide를 회수하여 진공농축시 킨 후 121℃, 15분간 Auto- 이ave후 DNS법을 이용하여 동일한 환원당량으로 조절한 후 modified MRS media를 조제하여, 10응으로 희석한 후 혐기척 조건하에서 37℃, 48 hi■ 평 판배양한 후 colony수를 비교하였다.
- 효소액 300 mL에 대 홍!] 0.5% konjac glucomannan'®- 24시간 가수분해하여 250 mL/hr 유속으로 tube당 50 mL씩 ethanol 0—30% linear gradient법으로 activated carbon column chromatography을 수행하여 당을 분리 하였다. Activated carbon column chromatography의해 분리 된 당용액 0.
- 4). 분리도를 확인하기 위하여 TLC(Fig. 5) 와 FACE(Fig. 6)를 병 행하여 pattern을 검토한 결과 fraction No. 32~35에서 중합도 5의 glucomannooligosaccharide 를, fraction No. 25~26에서 중합도 7의 glucomannooligosac-charide가 분리 되 었음올 Rf value상으로 확인하여 중합 도별 가수분해물을 회수하였다. 정확한 분리여부를 확인하기 위하여 Bio-LC를 이용하여 측정 했을때 4.
- 0 mL를 혼합하여 5분간 탈기 한다. 여 기 에 10% APS 20 虬와 TEMED 7.5 虬를첨 가하여 시료 well comb를 설 치 하고 stacking g시을 제 조한다. 영동용 완충액으로 Buffer C(1 L 증류수에 30.
- 본 연구에서는 Bacillus sp. 유래 p-mannanasee] 정제를 수행하여 konjac glucomannan 가수분해물을 분리 .조제 회수하고 TLC 및 FACE에 의해 확인된 당가수분해물의 중합도를 결정하여, Bifidobacterium속(B.
- 정제효소를 이용하여 최적 pH, 최적 온도, pH 안정성, 온도 안정성의 성질을 규명하였다. 최적 pH는 정제효소를 이용하여 pH 2~8, 50℃에서, 최적 온도는 상기 에서 사용한 동일 효소를 이용하여 pH 6, 20~80℃에서 효소활성을 측정하였 匸" pH 안정성은 동일효소를 pH 2~8의 Mcllvaine buffer solution을 이용하여 최적 온도에서 1시간 preincubation 후, 온도 안정 성은 상기 에서 사용한 동일효소를 최적 pH의 Me- Ilvaine buffer solution을 이용중卜여 20~80℃의 범위로 ]시간 preincubation 후, pH 6, 50℃에서 활성을 측정하였다.
- 유래 p-mannanasee] 정제를 수행하여 konjac glucomannan 가수분해물을 분리 .조제 회수하고 TLC 및 FACE에 의해 확인된 당가수분해물의 중합도를 결정하여, Bifidobacterium속(B. Iceigum, B. bifidum, B. irtfantis, B. adolescentis, B. animalis, B. 切njc)에 대한 미생물의 대사활성을 비교하였다.
- b厂四明에 대한 생육 촉진 활성을 측정하기 위해 MRS media에서 탄소원을 dextrose 대신에 조제된 중합도별 glucomannooligosaccharide 를 각각 첨가한 후 측정하였다. 중합도별 glucomannooligo- saccharide를 회수하여 진공농축시 킨 후 121℃, 15분간 Auto- 이ave후 DNS법을 이용하여 동일한 환원당량으로 조절한 후 modified MRS media를 조제하여, 10응으로 희석한 후 혐기척 조건하에서 37℃, 48 hi■ 평 판배양한 후 colony수를 비교하였다.
- 수행하였다. 즉, 0.5 mL의 1% locust bean gum, 0.4 mL 의 Mcllvaine buffer(pH 6.0)와 0.1 in丄의 균체가 제거된 배양액을 섞어 50℃에서 30분간 반응시킨 후 생성된 mannose 를 희석하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 D-mannose를 0.
- 따근+ 30 ~ 40%의 polyacrylamide gel을 사용한다. 즉, Acrylamide ACacrylamide-t- 53.33%와 Bis를 1.41% 함유) 5.625 mL오+ Buffer A(1.5 M Tris-HCl buffer, pH 8.8) 1.875 mL를 혼합하여 5분간 탈기 하고, Acrylamide B(acrylamide를 26.67 %와 Bis를 0.89% 함유) 2.8125 mL오+ Buffer A 1.875 mL를 혼합하여 탈기 하여 각각 10% APS 18 J1L와 TEMED 611L를 첨 가한 후 Pasteur pipetted 사용하여 separating gel를 제조한다. 다음은 Acrylamide A 0.
대상 데이터
- Bacillus 균주는 일본 Tsukuba대학 웅용생물화학전공 연구실로 부터 분양받았으며 효소생산 배지 조성 은 locust bean gum 2.5%, peptone 1.2%, yeast extract 0.5%, KH2PO41.0%, MgSO4 -7H2O 0.05%를 함유하는 액체배지 150 mL에 접종하여 35℃, 170 rpm, 24시간 배양하여 4℃, 11,000 rpm, 15 min 원심 분리 (Beckman, rotor 14) 후 상층액을 효소액으로 사용하였다.
- 3 g의 Tris 와 144 g의 glycinee- 함유)를 10배 희석한 액을 사용한다. 영동은 sta아【in官 gele 100 V, separating gele 400 V의 정 전압에서 영동완료 후 365 nm의 자외선파장에서 사진을 촬영하였다.
이론/모형
- ANTS에 유도화한 당의 전기 영동은 Jackson의 방법 (18) 에 따근+ 30 ~ 40%의 polyacrylamide gel을 사용한다. 즉, Acrylamide ACacrylamide-t- 53.
- DEAE sephadex ion exchange column chromatography 법 에 의한 효소정제는 저자가 보고한 방법(16)에 따라 수행하였다.
- DEAE sephadex ion exchange column chromatography 법에 의한 효소정제는 저자가 보고한 방법(16)에 따라 수행하여 SDS 전기영동법 에 의한 순도확인 후 정제효소로서 사용하였다.
- DNS 환원당 정 량법 에 의하여 온도와 pH의 영향을 검토하였다. Fig.
- P-Mannanase-S] 생산량은 DNS 환원당 정 량법 (15)에 의하여 수행하였다. 즉, 0.
- TLC는 McCleary법 (17) 에 따라 다음과 같은 조건하에서 전개 후 UV조사 및 spray reagent로 분무하여 140℃에서 5 분간 가열하여 당을 분석하였다.
- 단백질 량(280 nm)과 핵산량(260 nm)의 홉광도를 UV- spectrophotometer(Shimadzu Model 1201)에서 측정 해 L5 XA280-0.75XA260의 식을 이용한 결과를 단백질 농도로 사용하였고, 정 제 step중에는 Lowry의 방법(14)을 사용하여 단백질농도를 확인하였다.
- 5% konjac glucomannan을 50℃, 24시간 가수분해 후 TLC로 pattern을 검토한 후 activated carbon column chromatography를 이용해 당을 분리 하였다. 즉 activated carbon powder를 100℃ 1시 간 가열한 후 column(4 x 90 cm)에 충진시 키고, 증류수를이 용하여 24시간 평 형 화시 킨 후 당용액 을 주입 하고, 250 mL/ hr 유속으로 tube당 50 mL씩 ethanol 0~30%의 linear gra- dient법으로 당올 분리하였다.
성능/효과
- 55에서 70까지 중합도 5와 7의 가수 분해 올리 고당이 혼재 하고 있어 중합도 5와 7 hetero type glucomannooligosaccharide# 정제분리중};기 위중!] sephadex G- 25(2 X100 cm)를 이용한 용이 filtration을 수행하였다. 250 mL/ hr유속으로 tube당 8 mL씩 ethanol 0 ~ 30% linear gradient 로 당을 용출시 킨 후 동일한 방법으로 흡광도를 측정한 결과 fraction No. 20, 22, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 34, 35에서 peak를 나타내었다(Fig. 4). 분리도를 확인하기 위하여 TLC(Fig.
- 정 제효소에 의 해 konjac glucomarman올 가수분해하여 1차 activated carbon column chromatography와 2 犬卜 sephadex G-25 gel filtration 에 의해 당가수분해물을 분리 회수하여 TLC 및 FACE에 의해 주요 당가수분해물은 중합도 5와 7로 확인되었다. B. Iongum, B. bifidum, B. ireantis, B. adolescentis, B. animalis, B., 仑服의 생육활성에 대한 중합도 5와 7의 영향을 검토하기 위하여 modified-MRS배지 상에 탄소원으로 중합도 5와 7올 대체하여 생육활성을 비교한 결과 B. 就gum의 경우 륵징적으로 각각 467, 5.33배의 상대활성을 나타내어 우수한 생육활성을 나타내었다. 또한 B.
- Btfidobact仑rium속 균주(B. longum, B. bifidum, B. in- fantis, B. adolescentis, B. animalis, B. breve)^ 대한 생육촉진활성능을 측정하기 위해 MRS media에서 탄소원을dex- trose 대신에 조제된 중합도 5와 7 glucomannooligosaccha- rides를 첨 가후 측정한 결과 B. Zcngum의 경우 특징 적 으로 각각 4.67, 5.33배의 우수한 생육활성을 나타내었다. 또한 B.
- 2). 각각의 fraction을 TLC pattern 을 검토한 결과 fraction No. 51에서 55까지는 주요 가수분해 올리고당은 중합도 5가 주축을 이루고 있으며 fraction No. 61에서 70까지는 중합도 7의 가수분해올리고당으로 구성되어 있음이 standard Rf value상으로 확인되 었다(Fig. 3). 그러나 fraction No.
- 33배의 우수한 생육활성을 나타내었다. 또한 B. b厂cue에 대해서는 중합도 5 glucomannooligosaccharide를 처리시 2.42배의 생육활성을 나타내었으나 B. irrfantis와 B. adolescenfis에 대해서는 중합도 5와 7의 올리고당을 탄소 원으로 대체시 오히려 생육활성이 현저히 감소되었다(Table 2). 저자는 galactomannan가수분해 올리고당을 이용하여 Bifidobacterium spp.
- 25~26에서 중합도 7의 glucomannooligosac-charide가 분리 되 었음올 Rf value상으로 확인하여 중합 도별 가수분해물을 회수하였다. 정확한 분리여부를 확인하기 위하여 Bio-LC를 이용하여 측정 했을때 4.65와 6.65의 RT 값을 갖는 각각의 peak를 확인할 수 있었다(data not shown).
- 최 적 온도는 50℃, 최적 pH는 6.0이 며, 온도 안정 성 에서 는 30~50℃에서는 90%이상의 잔존활성을 나타내었고, 70-80 ℃에서는 30%이하의 잔존활성을 나타내었다. pH 안정성에서 는 pH 5.
- 78겁H 를 나타내 었다. 최적 온도는 50℃, 최적 pH는 6.0이며, 온도 안정성에서는 30~50℃에서는 90%이상의 잔존활성을 나타내었고, 70~80 ℃에서는 30%이하의 잔존활성올 나타내었다. pH 안정성에서는 pH 5.
- 74보다 높은 수치로 DEAE-sephadex가 f-mannanasee] 정 제용 수지 로서 보다 적합한 것으로 나타났다. 특히 DEAE sephadex ion exchange chromatography(2.5 x 42 cm) 에 의한 정제법은 평 형 화된 column에 효소를 처리 하여 30 mL/hr 유속으로 tube당 5 mL씩 용출하였으며 0~1 M NaCl linear gradient 농도구배법에 의해 정제를 진행한 결과로서 정제효소는 SDS- PXGE에 의해 단일밴드를 나타내었으며, P-mannanasee) 분자량은 38.9 kDa으로 추정 되었다. Penicillium purpuro- genum No.
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