[논문]Babesia equi ema-l 5' intergenic 뉴클레오타이드의 프로모터 위치 확인: I. PCR 증폭 및 제한효소지도

곽동미

문제 정의

B equi ema~l 5, IG 뉴클레오타이드에서 프로모터 기능이 있는지를 확인하기 위한 목적의 기초단계로, 이 연구에서는 IG 뉴클레오타이드를 PCR 증폭하여 sequencing's 한 후 어떤 제한효소에 의해 절단되는지 그리고 그 위치는 어디인지를 확인하였던 바다음과 같은 결과를 얻었다.
그러나, 최근 말라리아 연구로 주혈원충에서도 유전자 조작을 통한 세포 내 유전자의 기능을 밝힐 수 있는 가능성을 보여주었다. P falciparum 자신의 프로모터와 외부유전자(예, luciferase)로 기생충을 transfection 하였을 때 기생충체 내에서 luciferase의 활성이확인되었으며6), 더 나아가 특정 유전자의 대체나 변형도 발견하였다고 보고하였다 *9) 이 연구는 기생충의 프로모터를 이용하여 기생충의 특정 유전자 조작을 유도하고 나아가 세포 내에서의 기능도 밝힐 수 있는 가능성을 보여준 것이기 때문에 바베시아에서도 이 방법이 가능한지를 확인해보고자 수행되었다.
PCR 증폭산물이 실제로 제한 효소에 의해 예상되는 위치에서 절단되는지를 조사하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다. 배양은 200ng의 PCR 증폭산물이 10U의 Bgll(Promega), Hindlll, IQjnl 및 BamHl(이상 Invitrogen)과 37°C에서 3시간 동안 실행하였다.
이 연구는 프로모터로 예측되는 뉴클레오타이드를 클로닝하고 형질전환하기에 앞서 IG 뉴클레오타이드에서 제한효소 위치를 확인하였다. 이것은 IG 뉴클레오타이드를 벡터에 클로닝할 단계에서 어느 제한효소를 선택할지를 결정해야 하기 때문이다.

제안 방법

B equi erm~l 5' IG 뉴클레오타이드를 증폭하기 위하여 10 ng B. equi genomic DNA가 각 1uM의 forward 와 reverse primer와 함께 45u1의 PCR supermix high fidelity (Invitrogen, USA)에서 다음의 PCR 조건으로 실행하였다. 요약하면, preamplification de- naturation으로 95°C에서 4분 동안 처치한 후, denaturation 과정으로 95 30초, an nealing 과정으로 58 °C에서 30초 그리고 ex tension 과정으로 720에서 1분 30초를 설정하여 35 cycle을 거친 다음 마지막으로 72°C 에서 7분 동안 더반응시킨 후 4℃에서 보관하였다.
PCR 증폭산물을 확인하기 위하여 1ul의 PCR 증폭산물을 ethidium bromide(500 ng/ml) 가 함유된 1%의 agarose 겔에서 전기영동 하였다. 전기영동은 100 V에서 40분간 TAE buffer (40 mM tris-acetate, 1 mM EDTA)에서 실행하였고 증폭 유무는 자외선광으로 판단하였다.
PCR 증폭산물의 sequence가 어떤 제한효소에 의해 절단되는지를 조사하기 위하여 컴퓨터 프로그램을 이용하여 분석하였던 바, 34종의 제한효소에 의해 절단될 수 있었으며 그 위치들은 Fig 2에 표시하였다. 그 제한효소들은 Acc65, Apal, Asel, Baela, Baelb, BciVl, BfrBl, Bgll, Blpl, BmgBl, Bmrl, Bpml, BpuEl, BsaXa, BsaXb, BseRl, Bsml, BspLU, BsrDl, BsrGl, BstZl, Eco57, EcoNl, Hindffl, Kpnl, Ncol, Ndel, Nsil, PflMl, PspOM, Sacl, SanDl, Sphl 및 Xcml이었다.
PCR 증폭산물이 Fig 2에서 예상된 것과 같은 위치에서 제한효소에 의해 절단되는지를 확인하기 위하여 4종의 제한효소(BamHl, Bgll, HindlH 및 Kpnl) 로 절단하였다 (Fig 3). BamHl은 절단위치를 지니고 있지 않았으며 음성 대 조군으로 사용하였다.
PCR 증폭산물인 1268 bp 뉴클레오타이드가 컴퓨터 프로그램으로 예상한 것과 같은 위치에서 절단되는지를 확인하기 위하여 BamHl, Bgll, Hindffl 및 Kpnl로 처치한 결과 예상한 위치에서 절단되었다. 특이한 것은 Hindlll는 뉴클레오타이드 364와 498 두 절단위치를 지니고 있어 134, 364와 770 bp의 DNA 단편이 생성될 것을 예상하였지만 결과는 총 5개의 DNA 단편(134, 364, 498, 770 및 904 bp) 이 확인되었다.
Sequencing 을 위하여 PCR 증폭산물은 pCR2.1 벡터를 함유한 TOPO TA cloning kit(Invitrogen) 을 사용하였다. Sequencing 은 M13 forward와 reverse primer로 하였다.
이 1268 bp는 기생충 genomic DNA를 primer없이 처치하였을 때는 확인되지 않았기 때문에 B equi ema-1 5, IG 뉴클레오타이 드 특이 primer에 의한 증폭이었음을 나타내었다. 또한, 이 결과에서는 나타내지 않았지만 PCR 증폭산물이 ema-1 의 IG nucleotide인지를 증명하기 위하여 ema-1 특이 reverse primer와 여기서 사용된 forward primer를 이용하여 PCR 증폭하였을 때 IG 뉴클레오타이드와 일부의 ema-1 뉴클레오타이드도 확인하였다. 이것은 PCR 증폭 산물이 B equi 특이이고 ema-1 특이임을 나타내는 것이다.
생각되었다. 또한, 특정의 DNA 부분을 클로닝하기 앞서 IG 뉴클레오타이드에서 어떤 제한 위치가 존재하며 그 위치는 어디인지를 조사하는 것이 제한효소를 선정하는 단계에서 필요하기 때문에 이 연구에서는 B. equi ema-1 5' IG 뉴클레오타이드를 PCR로 증폭한 후 뉴클레오타이드를 확인하였으며 이어 제한효소 지도를 구축하였다.
다음의 실험을 수행하였다. 배양은 200ng의 PCR 증폭산물이 10U의 Bgll(Promega), Hindlll, IQjnl 및 BamHl(이상 Invitrogen)과 37°C에서 3시간 동안 실행하였다. 배양 후 각 반응은 위에서 언급한 것처럼 agarose 겔에서 전기영 동하였다.
전기영동은 100 V에서 40분간 TAE buffer (40 mM tris-acetate, 1 mM EDTA)에서 실행하였고 증폭 유무는 자외선광으로 판단하였다. 증폭산물의 크기를 측정하기 위하여 1 kbp plus DNA ladder( 12, OCX)-100 bp, Invitrogen)를사용하였다.

대상 데이터

display(http://pga. mgh.harvard.edu/web_apps/web_map/starO 를이용하여 분석하였다.

이론/모형

바베시아 DNA 분리는.시판되는 kit(Puregene, Gentra Systems, USA)을 사용하여 지시된 방법으로 하였다.

성능/효과

2.이 1268 bp 증폭산물을 컴퓨터 프로그램으로 제한 위치를 분석하였던 바, 총 34종의 제한효소가 절단 위치를 지니고 있었으며 그중 26종은 하나의 제한 위치, 나머지 8종은 둘 이상의 제한 위치를 지니고 있었다.
3. BamHl, Bgll, HindlH 및 Kpnl이 컴퓨터의 예측대로 절단을 하는지를 확인하기 위하여 실제로 처치를 하였던 바, 컴퓨터예측과 동일한 결과를 나타내었다.
Kpnl을 처치하였을 때 480과 788 bp의 분해된 DNA 단편들과 분해되지 않은 1268 bp DNA가 확인되었다. 음성 대조군으로 절단 위치가 없는 BamHl을 처치하였을 때 제한효소를 처치하지 않은 반응과 같이 1268 bp DNA만 확인되었다.
그 제한효소들은 Acc65, Apal, Asel, Baela, Baelb, BciVl, BfrBl, Bgll, Blpl, BmgBl, Bmrl, Bpml, BpuEl, BsaXa, BsaXb, BseRl, Bsml, BspLU, BsrDl, BsrGl, BstZl, Eco57, EcoNl, Hindffl, Kpnl, Ncol, Ndel, Nsil, PflMl, PspOM, Sacl, SanDl, Sphl 및 Xcml이었다. 이들 가운데 한 곳에서 절단하는 제한효소는 Acc65,Apal, Asel, Baela, Baelb, BciVl, BfrBl, Bgll, Blpl, BmgBl, Bmrl, Bpml, BpuEl, Bsml, BspLU, BsrDl, BsrGl, BstZl, Eco57, EcoNl, Kpnl, Ncol, Nsil, PspOM, Sacl과 Sarll로 모두 26종이 확인되었다. 나머지 8종의 제한효소들은 하나보다 많은 절단 위치를 지니고 있었다.
절단되었다. 특이한 것은 Hindlll는 뉴클레오타이드 364와 498 두 절단위치를 지니고 있어 134, 364와 770 bp의 DNA 단편이 생성될 것을 예상하였지만 결과는 총 5개의 DNA 단편(134, 364, 498, 770 및 904 bp) 이 확인되었다. 498(364+134)과 904(134+770) bp DNA 단편이 확인된 것은 사용된 10 U의 HindHI가 37 oC에서 3시간 동안 배양되었을 때 1268 bp 뉴 클레오타이드를 완전히 절단하지 못하고 부분적으로 절단하였기 때문이었다.

후속연구

4.이 연구에서 확인된 제한효소 정보는 클로닝 단계에서 제한효소와 그 위치를 설정할 때 이용될 것이다.
498(364+134)과 904(134+770) bp DNA 단편이 확인된 것은 사용된 10 U의 HindHI가 37 oC에서 3시간 동안 배양되었을 때 1268 bp 뉴 클레오타이드를 완전히 절단하지 못하고 부분적으로 절단하였기 때문이었다. 네 BamHl, Bgll, Hindin 및 Kpnl 제한효소를 사용하여 확인한 결과 PCR 증폭산물인 1268 bp nucleotide의 제한 위치는 컴퓨터 프로그램을 통해 예측한 것과 동일한 결과를 나타내었으므로 이 결과는 클로닝 단계에서 어느 제한효소를 사용할지에 대하여 믿을 만한 예측을 할 것으로 기대된다.
예를 들면, 1268 bp 모두를 클로닝하고 자 하면 34종의 제한효소 외의 다른 제한효소를 사용하여야 할 것이고 두 부분으로 나뉘어 클로닝 하고자 하면 하나의 제한 위치를 지니고 있는 제한효소 가운데 선택할 것이다. 또한, 하나의 절단 위치를 지니고 있는 26종의 제한효소 가운데 벡터로 이용할 plasmid에서 절단 위치를 갖고 있지 않는 제한효소가 선택될 것이다.

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