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문제 정의
- oryzae NR 3-6의 glucoamylase(7)와 glucoamylase를 정제(8)하여 각각의 효소학적 특성을 검토한 연구만이 있을 뿐이다. 그러므로 전통주류의 품질 향상과 규격화, 산업화 기술 등을 개발하는 일환으로 본인의 연구가 중요한 역할을 담당할 것이라 생각하고, 한국 전통누룩으로부터 분리된 사상균에 관한 미생물학적, 효소학적 기초자료는 물론 산업적으로 이용할 수 있는 자료를 얻기 위해 본 실험을 실시하게 되었다.
- 정제하여 그 효소학적 특성을 살펴보았다. 또한 연구의 말미에는 정제된 효소를 이용하여 산업적으로 이용가치가 높은 oligosaccharide의 생성유무를 TLC를 통해 분석한 결과를 보고하여 누룩연구의 기초자료로 제시하고자 하였다.
- 본 연구에서는 전통누륵으로부터 분리된 신종누룩곰팡이인 Aspergillus coreanus NR 15-1이 생산하는 a-amylase를 분리 ·정제하여 그 효소학적 특성을 살펴보았다. 또한 연구의 말미에는 정제된 효소를 이용하여 산업적으로 이용가치가 높은 oligosaccharide의 생성유무를 TLC를 통해 분석한 결과를 보고하여 누룩연구의 기초자료로 제시하고자 하였다.
- 한국 전통누룩으로부터 분리한 신종 Aspergillus coreanus NR 15-1가 생산하는 a-amylase의 효소학적 특성을 조사했다. 공시균주가 생산하는 a-amylase는 황산암모늄을 이용한 분별 침전, CM-cellulose, DEAE-cellulose, Sephadex G-100, hydroxyapatite column chromatography를 통하여 8.
가설 설정
- A : The electrophoresis was performed in 15% PAG containing 0.1% SDS. Molecular weights of standard proteins were as follows A : phosphorylase (94 kDa) , B : bovin serum albumin (67 kDa), C : ovalbumin (43 kDa), D : carbonic anhydrase (30 kDa), E : soybean trypsin inhibitor (20.
- B : The enzyme activity was assayed under standard reaction conditions at various temperature.
제안 방법
- 1% soluble starch 2 ml에 정제 효소액 50 ㎕ 25 ㎕, 5 ㎕ 를 각각 가하여 40℃에서 반응시킨 후, 급냉각시켜 효소반응을 정지시키고, 그 반응액 4 ㎕와 표준당용액 (glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose) 2.5 ㎕를 함께 TLC plate (silica gel 60 aluminium sheet Merck, Co.) 에 점적시켜 nitromethane : 1-propanol : HO = 2 : 5 : 2의 용매로 상향법으로 전개시켰다. 전개한 후, TLC plate 를 건조시켜 발색시약으로 aniline-diphenylamine(14)을 분무하고 85 ℃ 에서 10분간 발색시켜 반응생성물을 확인하였다.
- CM-cellulose에서 얻은 효소액을 0.02 M Tris-HCl 완충액 (pH 8.0)으로 평형화시킨 DEAE-cellulose column (ø3.4 × 15 cm)에 충진시켜 시간당 20 ml 유속으로 5 ml씩 분획하였다. 먼저 동일 완중액으로 비결합 단백질을 씻어낸 후, 0~0.
- DEAE-cellulose에서 얻은 효소활성 분획을 0.02 M Na-acetate 완충액 (pH 5.0)으로 평형화시킨 Sephadex G-100 column(ø1.8 × 70 cm)에 충진시켜 동일 완충액으로 시간당 20 ml 유속으로 3 ml씩 분획하였다.
- a-Amylase 효소를 정제했다. 그 결과 Fig.
- 본 효소의 반응최적온도는 30~70℃까지의각기 다른 온도에서 효소를 반응시켜 효소활성을 측정하였다. 금속이온과 효소활성 저해제가 효소활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 각종 금속이온과 저해제의 농도가 1 mM되게효소액에 넣어 40℃ 에서 30분간 효소 반응시킨 후, 잔존효소활성을 측정하였다.
- 금속이온과 효소활성 저해제가 효소활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여, 금속이온과 효소활성 저해제를 효소 반응액에 첨가하여 효소반응을 시킨 후, 잔존활성도를 측정하였다. 본 실험에서 정제된 효소는 Table 2에서 보는 바와 같이, 실험에 사용한 모든 금속이온에 의한 효소활성은 거의 영향을 받지 않았다.
- 4 × 15 cm)에 충진시켜 시간당 20 ml 유속으로 5 ml씩 분획하였다. 먼저 동일 완중액으로 비결합 단백질을 씻어낸 후, 0~0.6 M 의 NaCl을 함유한 완충액을 이용하여 농도구배법으로 단백질을 용출시켜서 분획했다.
- 8)으로 평형화시킨 hydroxyapatite column (ø2 × 10 cm) 에 충진시킨 후, 시간당 20 ml 유속으로 3 ml씩 분획하였다. 먼저 동일 완충액으로 비결합 단백질을 씻어낸 후, 0.01 M, 0.02 M 인산 완충액 (pH 6.8)과 0.04 M 인산 완충액 (pH 6.8)을 사용하여 순차적으로 흡착된 효소단백질을 용출시켜서 분획했다.
- 4 × 15 cm)에 충진시켜시간당 20 ml 유속으로 5 ml씩 분획하였다. 먼저 동일 완충액으로 비결합 단백질을 씻어낸 후, 0~0.5 M의 NaCl을 함유한 완충액을 이용하여 농도구배법으로 단백질을 용출시켜서 분획했다.
- 반응최적 pH는 효소반응액의 pH를 2.0에서 10.0까지 달리하여 40℃에서 효소를 반응시켜 효소활성을 측정하였다. 실험에사용한 완충액은 pH 2.
- pH, 반응최적온도 등을 조사하였다. 본 효소의 pH 안정성을 검토하기 위해서 효소액을 pH 1.0에서 pH 12.0까지 pH가 다른 여러 종류의 완충액에 효소액을 4℃에서 24시간 투석한 후, 반응최적 pH로 조절하여 그 잔존효소 활성을 측정하였다. 사용한 완충액은 pH 1.
- 0까지는 glycine-NaOH 완충액을각각 사용하였다. 본 효소의 반응최적온도는 30~70℃까지의각기 다른 온도에서 효소를 반응시켜 효소활성을 측정하였다. 금속이온과 효소활성 저해제가 효소활성에 미치는 영향을 검토하기 위하여 각종 금속이온과 저해제의 농도가 1 mM되게효소액에 넣어 40℃ 에서 30분간 효소 반응시킨 후, 잔존효소활성을 측정하였다.
- 본 효소의 특성을 검토하기 위해 pH 안정성, 열 안정성, 반응최적 pH, 반응최적온도 등을 조사하였다. 본 효소의 pH 안정성을 검토하기 위해서 효소액을 pH 1.
- 본 효소의 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하기 워하여, 효소 반응액의 pH를 2.0에서 10.0까지 조절하여 40℃에서 30분간 효소 반응시켜 효소활성을 측정하였다. 정제된 a-amylase는 pH 5.
- 본 효소의 활성에 미치는 온도의 영향을 조사하기 위해 30℃에서 75℃까지 각 온도에서 효소 반응을 시켜 효소 활성을 측정하였다. 정제된 a-amylase는 45℃에서 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, 50℃에서도 90% 이상의 효소 활성을 나타내었다.
- 열 안정성은 효소액을 40℃에서 70℃까지 각 온도에서 20 분간 열처리하고 급냉각시켜 잔존효소활성을 측정하였다. 반응최적 pH는 효소반응액의 pH를 2.
- 살균하였다. 이 배지에 포자현탁액 (7 × 107 spores/ml) 4 ml를 접종한 후 배양일수별로 생성된 효소의 활성을 측정하였으며, 배양기간 중 균사증식에 의한 배지의 고형화를 방지하기 위하여 적당한 배양시간에 배지를 흔들어 주었다.
- ) 에 점적시켜 nitromethane : 1-propanol : HO = 2 : 5 : 2의 용매로 상향법으로 전개시켰다. 전개한 후, TLC plate 를 건조시켜 발색시약으로 aniline-diphenylamine(14)을 분무하고 85 ℃ 에서 10분간 발색시켜 반응생성물을 확인하였다.
- 8 × 60 cm)을 이용하여 gel 여과로 측정하였다. 정제효소의 순도 및 분자량을 측정하기 위하여 Laemtnli 방법(13)에 따라 15% SDS-polyactylamide gel을 사용하여 0.1% SDS 존재 하에서 Tris-glycine 완충액 (pH 8.3)을 사용하여 전기영동을 실시한 후, 0.1% Coomassie brilliant blue R-250 (methanol : acetic acid : water = 45 : 45 : 10)으로 염색하고, 탈색용액 (methanol : acetic acid : water = 10 : 10 : 80) 으로 탈색하였다.
- 포자현탁액을 10,000×g에서 10~15분간 원심분리하여 포자를 침전시킨다. 침전된 포자를 멸균수로 씻은 다음, 20% glycerol용액으로 포자수가 약 1.0 × 107 spores/ml되게 포자현탁액을 조제하였다. 포자 현탁액은 -70 ℃에서 보관하면서 사용했다.
대상 데이터
- N-bromosuccinimide, CM-cellulose, DEAE-cellulose, Sephadex G-100 (Sigma Co., USA) 제품을 사용하였다. SDS-Poly acrylamide gel 전기영동의 분자량 측정용 표준 단백질(Pharmacia Co.
- , USA) 제품을 사용하였다. SDS-Poly acrylamide gel 전기영동의 분자량 측정용 표준 단백질(Pharmacia Co., Sweden) 제품을 사용하였으며, 단백질 정량시약은 Bio-Rad Co. (USA) 제품을 사용하였다. YM broth, YM agar, Czapek solution agar (Difco Lab.
- (USA) 제품을 사용하였다. YM broth, YM agar, Czapek solution agar (Difco Lab., USA) 제품을 사용하였다.
- 본 실험에서는 전통누룩으로부터 분리하여 동정한 신종 누룩곰팡이인 Aspergillus coreanus NR 15-1(9)을 공시균주로 사용하였다.
이론/모형
- 단백질의 정량은 protein assay kit (Bio-Rad Co.)를 사용하여 Bradford 방법(11)에 준하여 측정했으며, 표준단백질로 bovine serum albumin (Sigma Co., USA)을 사용하였다. 정제과정 중의 단백질의 양은 280 nm의 홉광도로 측정하였다.
- 본 효소의 분자량은 Andrews 방법(12)에 따라 0.02 M Na-acetate 완충액 (pH 5.0)으로 평형화시킨 Sephadex G-100 column (ø1.8 × 60 cm)을 이용하여 gel 여과로 측정하였다. 정제효소의 순도 및 분자량을 측정하기 위하여 Laemtnli 방법(13)에 따라 15% SDS-polyactylamide gel을 사용하여 0.
-
분자량 즉정
정제된 a-amylase의 분자량을 측정하기 위하여 정제효소와 표준단백질을 Laemmli 방법(13)에 따라 15% SDS-poly acrylamide gel 전기영동하여 정제효소와 표준단백질의 전기영동거리를 이용하여 정제효소의 분자량을 측정한 결과, 정제효소의 분자량은 51 kDa 으로 계산되었다 (Fig. 3A). Andrews 방법(12)에 따라 Sephadex G-100에 의한 gel 여과법으로 정제효소의 분자량을 측정한 결과, 정제효소의 분자량은 49 kDa으로 나타났다(Fig.
성능/효과
- A. niger K-25(19)와 Schwannipmyces castellii(20) 효소의 반응 최적 온도는 두 균주 모두 40℃를 나타내어 본 효소와 비슷한 온도에서 반응 최적 온도를 나타내었다.
- Soluble starch에 대한 정제효소의 분해생성물을 TLC로 확인한 결과, 표준당인 glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, maltoheptaose의 Rf치는 0.56, 0.49, 0.42, 0.34, 0.27, 0.23, 0.19로 각각 나타났다. 일반적으로 a-amylase는 전분의 a-1, 4 glucoside 결합을 무작위로 절단하며, 그 분해 산물로 maltose 이상의 oligosaccharide 를 생성한다고 알려져 있다.
- 공시균주가 생산하는 a-amylase는 황산암모늄을 이용한 분별 침전, CM-cellulose, DEAE-cellulose, Sephadex G-100, hydroxyapatite column chromatography를 통하여 8.7%의 수율을 보이며, 78배로 정제되었다. 공시균주의 a-amylase의 분자량은 Sephadex G-100 겔 여과에 의해 49 kDa으로 나타났으며, SDS-PAGE에 의하여 51 kDa으로 측정되어 본 효소는 monomer로 추정할 수 있었다.
- 7%의 수율을 보이며, 78배로 정제되었다. 공시균주의 a-amylase의 분자량은 Sephadex G-100 겔 여과에 의해 49 kDa으로 나타났으며, SDS-PAGE에 의하여 51 kDa으로 측정되어 본 효소는 monomer로 추정할 수 있었다. 정제효소는 pH 4.
- a-Amylase 효소를 정제했다. 그 결과 Fig. 1에 나타난 바와 같이, hydroxyapatite column chromatography에 의한 효소활성은 0.01 M 인산 완충액 (pH 6.8)의 용출단계인 분획 No. 11~13에서 높게 나타났으며, 단백질의 용출 pattern과 효소활성의 용출pattern이 일치했으며, 정제효소를 SDS-poly acrylamide gel 전기영동을 한 결과, Fig. 2에 나타난 바와 같이 본 a-amylase는 단일 밴드의 단백질 밴드를 나타내어 본 효소는 단일 효소단백질로 정제되었다고 추정할 수 있었다.
- 6), 이상의 결과는 Bacillus circularise 효소반응 생성물과 매우 유사한 결과를 얻었다. 그리고 본 정제된 효소는 포도당은 생성시키지 않으나 maltose 이상의 분자량 정도의 당을 생성하여 정제된 효소가 Q-amylase임을 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서 정제된 효소는 Table 2에서 보는 바와 같이, 실험에 사용한 모든 금속이온에 의한 효소활성은 거의 영향을 받지 않았다. 효소활성 저해제인 p-chloromercuribenzoate (p-CMB), dithiothreitol과 pyridoxal 5'-phosphate는 본 효소활성에 아무런 영향을 미치지 않았다.
- Bacillus circulanes의 효소를 30분간 기질에 효소반응시켰을 때 반응초기에는 maltohexaose가 생성되었으나, 반응이 진행되면서 maltohexaose의 량은 서서히 감소하면서 maltose와 maltotetraose가 생성되었다(21). 본 정제된 a-amylase를 기질에 효소반응시켰을 때, 고분자 당인 maltohexaose와 maltopentaose로부터 저분자당인 maltotetraose와 maltotriose가 생성되는 것을 볼 수 있었다. 이 효소를 30분간 반응시키므로 maltotriose가 가장 많이 생성되었으며, maltose와 maltotetraose의 순으로 생성되었다.
- 본 효소의 안정성에 미치는 pH의 영향을 검토한 결과, 정제된 a-amylase는 pH 3.0에서 비교적 안정하여 50%의 효소 활성이 잔존했으며, pH 4.0에서부터 pH 11.0 사이까지 안정하여 알카리성의 넓은 영역까지 매우 안정한 효소였다(Fig. 4A). 이러한 효소의 pH 안정성은 공시균주와 같은 A.
- 본 효소의 안정성에 미치는 온도의 영향을 검토한 결과, 정제된 a-amylase는 50℃에서는 84%의 잔존효소활성을 나타내지만, 60℃에서는 효소활성이 급격히 저하되어 40%의 잔존효소활성을 나타내었다(Fig. 4B). 그리고 정제된 a -amylase 효소활성은 65℃에서 완전히 실활되었다.
- 신종 누룩시상균인 Aspergillus coreanus NR 15-1의 a-amylase는 50℃ 이하의 온도와 pH 4.0~11.0사이에서 안정하여 온도와 pH의 안정성이 우수하여 누룩제조용 사상균으로 사용이 가능함을 알 수 있었다.
- 4A). 이러한 효소의 pH 안정성은 공시균주와 같은 A. awamori(15)가 pH 3.5에서 6.5사이에서 안정함을 보인 것과 비교하면 비교적 높은 알카리성 영역까지 본 효소 활성이 안정함을 알 수 있었다.
- 그러나 tryptophan의 indol기에 특이적으로 작용하는 것으로 알려져 있는 N-bromosuccitiimide에 의해서는 본 효소의 활성이 완전히 저해되었다. 이상의 결과로부터 본 a-amylase효소의 활성부위에 tryptophan잔기의 아미노산이 관여한다고 추정할 수 있었다.
- 이상의 결과로부터 본 효소는 8.7%의 수율을 보이며, 78배로 정제되었음을 알 수 있었다(Table 1).
- 3B). 이상의 두 결과로부터 정제효소는 monomer로 추정되었다. A.
- 측정하였다. 정제된 a-amylase는 45℃에서 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, 50℃에서도 90% 이상의 효소 활성을 나타내었다. 그러나 60℃ 이상의 온도에서는 20% 이하의 낮은 효소활성을 나타내었다(Fig.
- 공시균주의 a-amylase의 분자량은 Sephadex G-100 겔 여과에 의해 49 kDa으로 나타났으며, SDS-PAGE에 의하여 51 kDa으로 측정되어 본 효소는 monomer로 추정할 수 있었다. 정제효소는 pH 4.0~11.0 사이에서 안정하였으며, 반응최적 pH는 5.0이었고, 50℃ 이하의 온도에서 비교적 안정하며, 반응최적온도는 45℃로 나타났다. 정제효소는 금속이온에 의해 효소활성에 영향을 받지않았으나, N-bromosuccinimide에 의해서는 효소활성이 완전히 저해되어 본 공시균주의 a-amylase의 활성부위에는 tryptophan 잔기가 관여한다고 추정할 수 있었다.
- 0이었고, 50℃ 이하의 온도에서 비교적 안정하며, 반응최적온도는 45℃로 나타났다. 정제효소는 금속이온에 의해 효소활성에 영향을 받지않았으나, N-bromosuccinimide에 의해서는 효소활성이 완전히 저해되어 본 공시균주의 a-amylase의 활성부위에는 tryptophan 잔기가 관여한다고 추정할 수 있었다. 정제효소의 전분분해물은 maltose, maltotriose 등의 oligosaccharide를 형성하므로 a-amylase임을 확인할 수 있었다.
- 정제효소는 금속이온에 의해 효소활성에 영향을 받지않았으나, N-bromosuccinimide에 의해서는 효소활성이 완전히 저해되어 본 공시균주의 a-amylase의 활성부위에는 tryptophan 잔기가 관여한다고 추정할 수 있었다. 정제효소의 전분분해물은 maltose, maltotriose 등의 oligosaccharide를 형성하므로 a-amylase임을 확인할 수 있었다.
- 이 효소를 30분간 반응시키므로 maltotriose가 가장 많이 생성되었으며, maltose와 maltotetraose의 순으로 생성되었다. 특히, 이 효소 반응계에서 본 Q-amylase는 maltopentaose를 약간 생성되었으나, maltohexaose 이상의 고분자 oligosaccharide는 생성되지 않았으며 (Fig. 6), 이상의 결과는 Bacillus circularise 효소반응 생성물과 매우 유사한 결과를 얻었다. 그리고 본 정제된 효소는 포도당은 생성시키지 않으나 maltose 이상의 분자량 정도의 당을 생성하여 정제된 효소가 Q-amylase임을 확인할 수 있었다.
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