선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 실험은 NgrobacterZi/m을 이용하여 고추 잎에서 GUS 유전자의 일시적인 발현율을 높일 수 있는 박테리아 농도 박테리아 감염 시간, acetosyringone 농도 등의 적정 조건을 구명하여 이를 고추 형질전환에 이용하고자 실시하였다. 또한 이런 transient expressione 형질전환의 적정 조건 규명 뿐 아니라 유전자 분석에도 이용하고 있는데 이는 외부 유전자를 형질전환시키지 않고도 일시적으로 발현시켜 빠르게 분석할 수 있는 장점이 있기 때문이다 (Bustos et al.
- 이 연구는 자생식물 이용기술개발 사업단(PDRC) 및 작물 유전체 기능 연구 사업단 (CFGC)의 연구비 지원으로 수행하였으므로 이에 사의를 표함.
제안 방법
- GUS staininge 일반적으로 응용되는 제퍼슨 방법을 이용하였다 (Jefferson 1987). Agrobacterium으로 감염된 잎 부위를 가위로 절단한 절편체를 1 mM 5-bromo-4-chloro3-indolylgulcuronide (X-gluc)과 50 mM phosphate (ph 7.0)가 첨가된 염색용액에 넣고 37℃ 암상태에서 하룻동안 방치한 다음 destaining 용액(75% absolute EtOH + 1% glacial acetic acid)을 처리한 후 GUS spot을 관찰하였다.
- 식물체의 일시적인 발현을 위한 binary vector는 T-DNA 내부에 선발 표지로서 항생제 저항성 유전자인 kanamycin 과 intron을 지닌 GUS를 포함하고 있는 pGUSINT를 이용하였다 (Vancanneyt et al 1990). pGUSINT로 형질전환된 Agrobacterium LBA 4404를 YEP 배지에 접종하여 28℃에서 적정농도가 eoomn 0.3, 0.5, 0.8, 1.0, 1.3 이 될 때까지 배양한 후 원심분리하였다. 이렇게 얻어진 각 농도의 박테리아 세포를 SIM 배지(5.
- 또한 Agrobacterium고추 잎에 infiltration 한 시간대별로 GUS 유전자의 발현율을 조사하였다 (Figure 4). Agrobacterium으로 infilhation 한지 1일째되는 고추잎의 GUS 유전자 발현율은 43% 정도로 나타났으나 발현된 모든 잎의 GUS 유전자의 발현 정도가 약하였다.
- Bukang을 연구재료로 이용하였다. 상토와 펄라이트를 1：1로 섞은 후 멸균시켜서 핀셋을 이용해 종자를 파종한 다음, 25℃ 배양실에서 4 주간 자란 식물체를 이용하였다.
- 3 이 될 때까지 배양한 후 원심분리하였다. 이렇게 얻어진 각 농도의 박테리아 세포를 SIM 배지(5.88 g/L citric acid, 20 g/L sucrose, pH 5.2)에 최종 접종 농도를 Agoonm 0.3, 0.5, 0.8, 1.0, 1.3으로 되게 희석하여 0, 50, 100, 150, 200, 400, 800 pM acetosyringone1 mM proline을 첨가한 후 20℃에서 최소 4시간 이상 현탁배양하였다 (Seong et al. 2003). 준비된 Agrobacterium을 1 mL 주사기에 담아서 고추의 완전히 전개된 잎의 세포사이에 있는 공간에 infiltratiori한 다음 (Yang et al.
- 2003). 준비된 Agrobacterium을 1 mL 주사기에 담아서 고추의 완전히 전개된 잎의 세포사이에 있는 공간에 infiltratiori한 다음 (Yang et al. 2000) 배양실에 방치한 후 감염시간별로 고추 잎을 채취하여 GUS 유전자의 발현을 확인하는데 이용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에는 Capsicum annuum cv. Bukang을 연구재료로 이용하였다. 상토와 펄라이트를 1：1로 섞은 후 멸균시켜서 핀셋을 이용해 종자를 파종한 다음, 25℃ 배양실에서 4 주간 자란 식물체를 이용하였다.
이론/모형
- GUS staininge 일반적으로 응용되는 제퍼슨 방법을 이용하였다 (Jefferson 1987). Agrobacterium으로 감염된 잎 부위를 가위로 절단한 절편체를 1 mM 5-bromo-4-chloro3-indolylgulcuronide (X-gluc)과 50 mM phosphate (ph 7.
- 식물체의 일시적인 발현을 위한 binary vector는 T-DNA 내부에 선발 표지로서 항생제 저항성 유전자인 kanamycin 과 intron을 지닌 GUS를 포함하고 있는 pGUSINT를 이용하였다 (Vancanneyt et al 1990). pGUSINT로 형질전환된 Agrobacterium LBA 4404를 YEP 배지에 접종하여 28℃에서 적정농도가 eoomn 0.
성능/효과
- Agrobacterium을 이용한 고추의 GUS 유전자 발현에 있어서 병원성 유도 배지내에 첨가되는 acetosyringone (AS)의 영향을 조사한 바 (Figure 2), AS이 첨가되지 않은 것과 50 pM AS를 처리한 실험구에서는 GUS 유전자가 발현되는 절편체를 얻을 수 없었으나, 100 J1M 이상의 AS를 병원성 유도 배지에 첨가하였을 경우 GUS 유전자 발현율이 60-95%로 나타났다. 100 pM 의 AS를 병원성 유도 배지에 첨가했을 경우는 GUS 유전자 발현율이 61%로 나타났고 200 pM AS처리했을 때는 95%로 가장 높게 나타났다. 그러나 200 pM 보다 높은 농도의 AS처리에서는 GUS 유전자 발현 효율은 떨어지는 양상을 나타내었다.
- 또한 Agrobacterium고추 잎에 infiltration 한 시간대별로 GUS 유전자의 발현율을 조사하였다 (Figure 4). Agrobacterium으로 infilhation 한지 1일째되는 고추잎의 GUS 유전자 발현율은 43% 정도로 나타났으나 발현된 모든 잎의 GUS 유전자의 발현 정도가 약하였다. 하지만 Agrobacterium으로 infiltration 한지 2일째된 고추잎의 GUS 유전자 발현율은 60%로 가장 높게 나타났고 infiltration 한 지 3일 지난후 부터는 10% 이하로 급격히 감소하였다.
- Agrobacterium을 고추 잎에 감염시킨지 1일 간격으로 조사 하여 (Figure 3) 잎의 감염 정도를 조사한 결과, Agrobacterium 으로 infiltration 한지 3일 지난후 부터는 잎에 나타나는 균의 병징이 심해져서 외부 유전자의 발현 정도를 연구하기에는 좋지 않은 것으로 생각된다. Agrobacterium으로 감염시킨 시간별로 GUS 유전자의 발현 양상을 조사한 결과 (Figure 3), 고추 잎을 Agrobacterium infiltration 방법으로 감염시킨지 2일 되었을 때 가장 강한 GUS 유전자의 발현 양상을 보이다가 감염시킨지 3일이 지나면서 GUS 유전자의 발현이 다시 약해지는 경향을 보였다. 이 결과는 위의 결과와 일치하는 면을 보여준다.
- Agrobacterium을 이용한 고추의 GUS 유전자 발현에 있어서 병원성 유도 배지내에 첨가되는 acetosyringone (AS)의 영향을 조사한 바 (Figure 2), AS이 첨가되지 않은 것과 50 pM AS를 처리한 실험구에서는 GUS 유전자가 발현되는 절편체를 얻을 수 없었으나, 100 J1M 이상의 AS를 병원성 유도 배지에 첨가하였을 경우 GUS 유전자 발현율이 60-95%로 나타났다. 100 pM 의 AS를 병원성 유도 배지에 첨가했을 경우는 GUS 유전자 발현율이 61%로 나타났고 200 pM AS처리했을 때는 95%로 가장 높게 나타났다.
- grobacterium이용한 고추의 GUS 유전자 발현 효율에 영향을 미치는 요인중 먼저 박테리아 농도를 조사한 바 (Figure 1), 박테리아의 전처리 배양 농도와 최종 접종 농도가 다음과 같은 차이를 나타냈다. 균의 전처리 배양 농도 Aeoonm 0.3에서 최종 접종 농도를 Af100nm 0.8로 희석하여 접종한 조건에서 GUS 유전자 발현율이 55%로 가장 높게 나타났다. 균의 전처리 배양 농도 Af100nm 0.
- 8로 희석하여 접종한 조건에서 GUS 유전자 발현율이 55%로 가장 높게 나타났다. 균의 전처리 배양 농도 Af100nm 0.5, 0.8, 1.0을 최종 접종 농도 Aioomn 0.5, 0.8, 1.0으로 맞춘 조건에서는 상호간에 GUS 유전자 발현율이 20-30%로 나타나 유효차이가 없었다. 하지만 균의 전처리 배양 농도 A600nm 1.
- 8로 하여 이용해야 한다는 결론을 얻었다. 따라서 Agrobacterhim을 이용한 고추의 transient expression 효율성은 박테리아의 전처리 배양 농도와 최종 접종 농도가 모두 중요하게 작용하는 것으로 나타났다.
- 그러나 200 pM 보다 높은 농도의 AS처리에서는 GUS 유전자 발현 효율은 떨어지는 양상을 나타내었다. 따라서 고추의 완전한 잎을 이용한 transient assay 연구시 AS 적정농도는 200 UM로 처리해야 효율적임을 알 수 있었다. 아마도 유엽을 이용한 고추의 형질전환 연구에서는 AS의 적정농도가 배양 효율에 아주 중요한 역할을 할 것이라 사료 된다.
- GUS 유전자 발현율도 2일째에 63 %로 가장 높았고 3일이 지나면서 10 % 이하로 급격히 감소하였다 (Figure 4). 또한 3일이 지나면서, Agrobacterium으로 형질전환시키면 감염시킨 대부분 고추 잎의 세포들이 HR을 일으키면서 죽는 부위가 많아지는 것으로 나타났다. 이 결과로 유추해 볼 때, 고추의 경우 Agrobacterium으로 상처낸지 2일 되었을 때 외부 유전자 전환율도 높아지고 재분화율에도 영향을 미칠 것이라 생각된다.
- 고추의 경우에서는 이러한 박테리아 농도에 따른 외래 유전자나GUS 유전자의 발현에 대한 보고가 아직 없다. 본 연구에서 나온 결과로 볼 때 식물의 종류 및 품종에 따라 박테리아 농도가 미치는 영향은 현저하게 차이가 나는 것으로 보아, Agrobacterium 의 농도도 최적의 농도를 구명해야 형질전환율을 높일 수 있다고 보여진다. 따라서 본 실험에서 밝힌 박테리아 최적의 농도는 앞으로 유엽을 이용한 고추 형질전환 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 0으로 맞춘 조건에서는 GUS 유전자 발현율이 10% 이하로 나타나 저조한 transient expression 율을 보여 주었다. 앞의 결과에 따라 고추의 transient expression 효율을 높이려면 균의 전처리 배양 농도 Af100nm 0.3으로 하고 AfiOOmn 0.8로 하여 이용해야 한다는 결론을 얻었다. 따라서 Agrobacterhim을 이용한 고추의 transient expression 효율성은 박테리아의 전처리 배양 농도와 최종 접종 농도가 모두 중요하게 작용하는 것으로 나타났다.
- 또한 3일이 지나면서, Agrobacterium으로 형질전환시키면 감염시킨 대부분 고추 잎의 세포들이 HR을 일으키면서 죽는 부위가 많아지는 것으로 나타났다. 이 결과로 유추해 볼 때, 고추의 경우 Agrobacterium으로 상처낸지 2일 되었을 때 외부 유전자 전환율도 높아지고 재분화율에도 영향을 미칠 것이라 생각된다. 또한 같은 조건이었음에도 불구하고 Figure 2의 90% GUS유전자 발현율과 Figure 1과 Figure 4의 55-63% GUS 유전자 발현율이 차이가 나는 것은 해당식물의 자라난 stage와도 밀접한 관련이 있다고 사료된다.
- 1997). 하지만 고추의 경우는 Agrobacterium으로 infiltration 한지 2일째 샘플이 3일 처리한 것보다 GUS staining정도도 더 강한 것으로 나타났다. GUS 유전자 발현율도 2일째에 63 %로 가장 높았고 3일이 지나면서 10 % 이하로 급격히 감소하였다 (Figure 4).
- 0으로 맞춘 조건에서는 상호간에 GUS 유전자 발현율이 20-30%로 나타나 유효차이가 없었다. 하지만 균의 전처리 배양 농도 A600nm 1.3을 최종 접 종 농도 Aeoonm 0.5, 0.8, 1.0으로 맞추어 infiltration 했을 때의 조건에서는 Af100nm 1.3을 접종농도 Af100nm 0.8로 맞췄을 때 GUS 유전자 발현율이 20%로 나타났고 접종농도 Af100nm 0.5와 1.0으로 맞춘 조건에서는 GUS 유전자 발현율이 10% 이하로 나타나 저조한 transient expression 율을 보여 주었다. 앞의 결과에 따라 고추의 transient expression 효율을 높이려면 균의 전처리 배양 농도 Af100nm 0.
후속연구
- 그러므로 식물의 종과 품종에 따라서 식물조직에 상처를 가했을 때 분비되는 페놀물질의 양과 조성에 있어서의 차이가 공동배 양단계에서의 식물체 내로의 유전자전이와도 관계되는 것으로 보아진다. 그러나 이러한 것이 종의 병원성 유도 식물 세포내로의 유전자전이, 세포의 염색체내 삽입 등의 어떤 과정에서 구체적으로 작용을 미치는지는 분명치 않으며, 이 에 대한 상세한 연구가 필요하다고 여겨진다.
- 본 연구에서 나온 결과로 볼 때 식물의 종류 및 품종에 따라 박테리아 농도가 미치는 영향은 현저하게 차이가 나는 것으로 보아, Agrobacterium 의 농도도 최적의 농도를 구명해야 형질전환율을 높일 수 있다고 보여진다. 따라서 본 실험에서 밝힌 박테리아 최적의 농도는 앞으로 유엽을 이용한 고추 형질전환 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 2000), 공동배양단 계에서 AS 첨가가 형질전환율을 증가시키는데 필수요인임을 나타낸다. 본 연구에서도 AS이 첨가되지 않은 배지에서 GUS 유전자가 발현된 고추 잎을 얻을 수 없었으므로 200 pM AS 첨가는 고추 유전자 전환 연구에 필수적이라 사료된다. ASe 식물조직이 상해를 입었을 때 분비되어 나오는 페놀물질의 일종으로 Agrobacterium의 Ti-plasmid 내의 병원성 유도에 관여하는 유전자(vir)의 발현 유도에 가장 중요하게 작용하는 요인중의 하나로 알려져 있다.
- 1996). 본 연구에서도 실험결과에 나타내진 않았지만 배양실에서 키운지 4주된 식물체를 이용하였을 때 안정한 GUS 유전자의 발현을 나타냈으므로 형질전환 기법을 이용한 고추 품종 육종시 4주된 식물체의 유엽을 이용하는 것이 매우 유용하게 작용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 따라서 고추잎에 4grobacterium으로 infiltration 하는데 GUS 유전자 발현율을 높이는 최적의 공동배양기간은 2일인 것으로 사료된다. 이는 고추 절편체를 이용한 형질전환 연구에도 공동배양기간의 적정농도 구명에 이용될 수 있을 것으로 보여진다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.