[논문]다양한 생물반응기 형태가 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 부정근의 생장과 Ginsenoside 생산에 미치는 영향

김윤수; 한은주; 백기엽

doi:10.5010/jpb.2004.31.3.249

다양한 생물반응기 형태가 인삼(Panax ginseng C.A. Meyer) 부정근의 생장과 Ginsenoside 생산에 미치는 영향
Effects of Various Bioreactors on Growth and Ginsenoside Accumulation in Ginseng Adventitious Root Cultures(Panax ginseng C.A. Meyer) 원문보기

식물생명공학회지 = Korean journal of plant biotechnology, v.31 no.3, 2004년, pp.249 - 253

김윤수 (중앙대학교 인삼산업연구센터) , 한은주 (충북대학교 첨단원예기술개발연구센터) , 백기엽 (충북대학교 첨단원예기술개발연구센터)

초록
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생물반응기의 형태에 따른 인삼부정근의 생장과 ginsen-side의 생산능력에 대하여 조사한 결과, 원형의 상부와 하부에 5 cm의 bubble column을 가진 bulb type bubble bioreactor (BU)에서 건물중은 41.92 g으로 가장 많이 증가하였으며, cylindric tube bioreactor (CT)에서 건물중이 38.55g으로 가장 낮게 나타났다. 이들 두 생물반응기의 초기 kLa 값은 BU 생물반응기에서 6.98 h$^{-1}$로 가장 높게 측정되었고, 반대로 bubble column이 없는 CT 생물반응기에서 5.25 h$^{-1}$으로 가장 낮게 측정되었다. 그러나 이와 같은 초기 kLa값의 차이는 부정근내의 이차대사산물인 ginsenoside의 함량에는 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 또한 BU 생물반응기에서 bubble column의 길이를 기존의 5 cm에서 10 cm로 연장시켰을 때, 초기 kLa값이 6.52 h$^{-1}$에서 7.80 h$^{-1}$로 증가하면서 인삼부정근의 생장을 42.13 g에서 50.30 g으로 약 16% 증가시킨 것으로 나타났다.

Abstract ▼ AI-Helper

The type of air lift bioreactor affected the root growth in ginseng adventitious root cultures. Among bioreactors used in this experiment, bulb type bubble bioreactor (BU) was the best to increase root growth (41.92 g dry weight). The kLa value representing the oxygen transfer capacity from medium to explants (6.98 h$^{-1}$ ) in BU with 5 cm bubble column was higher than other bioreactors. On the other hand, cylindric tube bioreactor (CT) without bubble column resulted in minimum root growth (38.55 g dry weight) and kLa value (5.25 h$^{-1}$ ). Furthermore, the root growth (50.30 g dry weight) in BU with 10 cm bubble column more increased than 5 cm bubble column. However, the kLa value do not affected the secondary metabolite such as ginsenosides. These results show that the bubble column in air lift bioreactor increase kLa value and increased kLa value stimulate the growth of ginseng adventitious roots.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

1994). 따라서 본 연구에서는 인삼 부정근을 대량생산할 목적으로 다양한 공기부양식 생물반응기를 고안하여 생장이 가장 우수한 반응기의 형태를 선택하고자 하였으며, 또한 각 형태의 생물반응기에서 기체-액체간의 물질전달 계수 (k_La)를 즉정하여 더욱 개선된 생물반응기를 개발하고자 하였다.
따라서 우리는 본 실험에서 bubble column의 길이를 기존의 생물반응기보다 2배 (10 cm)연장시켜 부정근의 생장과 ginsenoside의 함량을 조사 하였다. 또한 배양과정 중에 정체영역이 부정근의 생장에 미치는 영향에 대해서도 조사하고자 하였다.
2000). 본 연구에서는 인삼 부정 근을 배양하는데 있어서 배양기의 형태에 따라서 다르게 측정되는 lea을 조사하고 측정된 초기 k_La값이 부정근의 생 장과 이차대사산물인 ginsenoside의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. Figure 1에서와 같이 공기부양식 생물반응기 의 형태를 4가지로 제작하여 초기 kLa를 측정한 결과, 원형의 상부와 하부에 5 cm의 bubble column을 가진 bulb type bubble bioreactor (BU)에서 6.

제안 방법

1996). Ginsenoside 정량은 photodiode array (Water 966, USA) 검출기로 수행하였으며, column은 Altec Platinum C18 column (1.5 ㎛, 33×7 mm), 용매는 acetonitrile과 물을 이용하여 처음 10분은 75:25로 후반부 15분은 63:37의 구배로 조절하였고, flow rate는 1.0 ml/min로 하여 분석하였다. 총 ginsenoside 함량은 Rbl, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rgl (Karl Roth,Germany)의 표준품에 의하여 검량선을 작성하고 환산하여 얻어진 각각의 ginsenoside를 합하여 나타내었다.
2000)에 NAA 2 mgJ와 sucrose 5% (w/v)를 첨가하여 22±1℃ 암조건에서 40일간 실시하였다. 각 생물반응기 당 20 g의 부정근을 접종하였으며 3회 반복하여 시행하였다.
건조시킨 분말시료 1.0 g을 취하여 80℃ 온수욕조에서 80% 메탄올 50 mL로 2회 추출하여 여과, 농축 후 에틸 에테르 (ethyl ether)로 재추출하여 탈지시킨 다음, 수포화 n-부탄올로 3회 추출하여 n-부탄올층만을 모두 합하여 증류수로 1회 세척한 후 수층을 버리고 n-부탄올층만을 감압 농축시켰다. 완전히 농축되어 건조된 분말을 HPLC용 메탄올5 ml에 녹여 0.
앞서 수행한 생물반응기 형태의 결정 실험에서 부정근의 생장이 가장 양호했던 BU 생물반응기는 다른 3개의 생물반 응기에 비하여 형태상 크게 차이를 나타내는 부분은 원형 의 상부에 bubble column이 부착되어 있다는 것과 column이 연결되는 부분에 세포배양에서 치명적이라고 할 수 있 는 정체영역이 있다는 것이다. 따라서 우리는 본 실험에서 bubble column의 길이를 기존의 생물반응기보다 2배 (10 cm)연장시켜 부정근의 생장과 ginsenoside의 함량을 조사 하였다. 또한 배양과정 중에 정체영역이 부정근의 생장에 미치는 영향에 대해서도 조사하고자 하였다.
또한 BU 생물반응기의 하부에 있는 bubble column의 길이를 5 cm (short length)와 10 (long length) cm로 각각 조절하여 부정근의 생장과 ginsenoside 함량에 미치는 영향을 조사하였다. 모든 배양기는 총 배양부피가 5 L로 제작되었으며, 배지는 4 L씩 첨가하여 배양을 실시하였다.
모든 배양기는 총 배양부피가 5 L로 제작되었으며, 배지는 4 L씩 첨가하여 배양을 실시하였다. 생물반응기 배양은 NH₄NO₃을 제거한 MS 기본배지 (Yu et al. 2000)에 NAA 2 mgJ와 sucrose 5% (w/v)를 첨가하여 22±1℃ 암조건에서 40일간 실시하였다. 각 생물반응기 당 20 g의 부정근을 접종하였으며 3회 반복하여 시행하였다.
생물반응기 형태에 따른 인삼 부정근의 생장 및 ginsenoside 생산능력을 조사하기 위하여, 공기부양식 생물반응기를 채택하여 반응기의 형태를 cylindric tube bioreactor (CT), balloon type bubble bioreactor (BB), cone type bioreactor (CN), bulb type bubble bioreactor (BU)으로 각각 다르게 제작하여 실험을 실시하였다 (Table 1과 Figure 1). 또한 BU 생물반응기의 하부에 있는 bubble column의 길이를 5 cm (short length)와 10 (long length) cm로 각각 조절하여 부정근의 생장과 ginsenoside 함량에 미치는 영향을 조사하였다.
0 g을 취하여 80℃ 온수욕조에서 80% 메탄올 50 mL로 2회 추출하여 여과, 농축 후 에틸 에테르 (ethyl ether)로 재추출하여 탈지시킨 다음, 수포화 n-부탄올로 3회 추출하여 n-부탄올층만을 모두 합하여 증류수로 1회 세척한 후 수층을 버리고 n-부탄올층만을 감압 농축시켰다. 완전히 농축되어 건조된 분말을 HPLC용 메탄올5 ml에 녹여 0.45 ㎛ millipore syringe filter (Gelman, USA)로 여과한 후 HPLC (Waters 2690 separation module, USA)로 분석하였다 (William et al. 1996). Ginsenoside 정량은 photodiode array (Water 966, USA) 검출기로 수행하였으며, column은 Altec Platinum C18 column (1.

대상 데이터

2003). 상기한 방법에 의하여 유도된 20 g의 부정근은 증식배지 4 L가 포함된 5 L 생물반응기에서 30일간 배양하여 본 실험의 재료로 이용하였다.

이론/모형

초기 k_La는 질소가스에 의해 탈산소화하는 동역학적 방법(Taguchi and Humphrey 1966)에 의하여 결정하였으며 부정근이 접종되지 않은 배지상태에서 초기 k_La은 측정되었다. 어느 한 시점에서 배지내 질소를 분사하여 탈산소화 시켜 용존산소를 최소화 시킨 후, 공기를 일정한 유속으로 배지 내에 재공급하여 용존산소의 농도를 증가시켰다.

성능/효과

그리고 BU 생물반응기에서 a부분이 배양과정 중 정체영역 (dead zone)으로 작용하여 생장에 나쁜 영향을 줄 것으로 예상했으나, 정체현상에 따 른 생장 억제 현상은 발생되지 않았다. 결과적으로 초기 k_La값의 증가는 대부분의 식물세포 및 조직에서 생장을 증가시키는 것으로 보고된 바와 같이 (Zhong et al. 1993; Pan et al. 2000), 인삼 부정근의 생장도 초기 k_La값이 증가와 더불어 증가하는 것으로 나타났다. 본 실험에서 부정근 생 에 가장 적절한 생물반응기의 형태는 bubble column이 부 착된 bulb type의 생물반응기 (BU)이나 cone type 생물반 응기 (CN) 역시 양호한 것으로 생각된다.
한편, BU 생물반응기에 비하여 부정근의 생장이 조금 작게 나타난 cone type bioreactor (CN)도 생장에 대한 ginsenoside의 생산성으로 나타내었을 경우 BU와 유의적인 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다 (data not shown). 그리고 BU 생물반응기에서 a부분이 배양과정 중 정체영역 (dead zone)으로 작용하여 생장에 나쁜 영향을 줄 것으로 예상했으나, 정체현상에 따 른 생장 억제 현상은 발생되지 않았다. 결과적으로 초기 k_La값의 증가는 대부분의 식물세포 및 조직에서 생장을 증가시키는 것으로 보고된 바와 같이 (Zhong et al.
이와 같은 column 길이의 연장은 기체-액체간의 물질 전달에 영향을 미치는 것으로 나타났으며 이는 분사장치 (sparger)로부터 발생한 공기가 연장된 column을 통과하는 동안 큰 기포들로 되기보다는 많은 작은 기포들로 분사되어 세포들이 산소를 이용할 수 있는 계면의 면적을 증가시킨 것으로 설명할 수 있다(Heijnen and Van't Riet 1984). 또한 BU 생물반응기에서 정체영역에 대한 생장의 억제작용은 소형 생물반응기에서는 발생하지 않은 것으로 나타났다. 하지만 이러한 정체 영역은 대량배양을 위하여 생물반응기를 대규모화할 경우, 부정근의 생장이 증가하면서 하중에 의하여 침적현상이 발생하면서 문제가 될 것으로 예상된다.
하지만 초기 k_La값의 차이는 부정근내의 이차대사산물인 ginsenoside의 함량에는 영향을 주지 않는 것으로 보여진다. 모든 형태의 생물반응기에서 ginsenoside의 함량은 6.4~6.6 mg g^-1 dry wt으로 큰 차이를 나타내지는 않았다.
배양 40일후, 초기 k_La값이 가장 큰 BU 생물반응기에서 건물 중은 41.92 g으로 가장 많이 증가하였으며 초기 k_La값과 마찬가지로 가장 낮았던 CT 생물반응기에서 건물중이 38.55 g으로 가장 낮게 나타났다. 하지만 초기 k_La값의 차이는 부정근내의 이차대사산물인 ginsenoside의 함량에는 영향을 주지 않는 것으로 보여진다.
2000), 인삼 부정근의 생장도 초기 k_La값이 증가와 더불어 증가하는 것으로 나타났다. 본 실험에서 부정근 생 에 가장 적절한 생물반응기의 형태는 bubble column이 부 착된 bulb type의 생물반응기 (BU)이나 cone type 생물반 응기 (CN) 역시 양호한 것으로 생각된다.
하지만 이러한 정체 영역은 대량배양을 위하여 생물반응기를 대규모화할 경우, 부정근의 생장이 증가하면서 하중에 의하여 침적현상이 발생하면서 문제가 될 것으로 예상된다. 본 연구소에서는 이러한 문제점을 해결하고자 1톤 규모이상의 BU 생물반응기를 제작할 때, 정체부분으로 예상되는 하부에 추가로 공기 분사 노즐을 설치하여 산소를 균일하게 공급함으로써 정체영역으로 인한 부정근의 생장억제현상을 방지할 수 있었다.

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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