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문제 정의
- 15 이러한 증거들은 Id 유전자가 생리주기 및 임신, 착상과정과 같은 자궁의 다양한 생리학적 또는 형태학적인 변화에 있어서 중요한 역할을 할 것임을 시사한다. 따라서, 본 연구에서는 난자 및 착상 전 배아를 대상으로 Id 전령체와 단백질의 발현양상을 조사하여 착상시기에 있어서 자궁과의 상호작용시 Id 유전자의 기능을 유추할 수 있는 자료를 제시하고자 수행하였다.
- 16 그러나, 아직 착상 전 배아단계에서 Id 유전자의 발현에 대한 결과는 보고된 바 없으며, 배아에서의 Id 유전자의 발현은 초기배아 발생과정에서의 분화에 대한 기작과 착상과정중 배아와 자궁의 생리학적 또는 형태학적인 변화에 대한 기초적인 정보를 제공할 것으로 추측된다. 따라서, 본 연구에서는 생쥐의 착상 전 배아에서의 Id 전령체와 단백질의 발현양상을 역전사 중합효소 연쇄반응 및 면역 형광염색분석법을 이용하여 조사하였다.
제안 방법
- 5 ml 미세원심분리용 튜브에 넣었다. RNA 추출 전 RNA 회수율을 높이기 위해 carrier RNA (Takara, Shiga, Japan)를 튜브당 1 µl (2×105 copies/µl)씩 첨가하였고, 50 µl chloroform (Sigma)을 첨가하여 5분간 정치한 후 14,000 rpm, 4℃, 15분간 원심분리하였다. 이의 상등액을 수거하여 동량의 isopropanol (Sigma)을 첨가하여 혼합하였다.
- 성숙난자 (MII oocyte)를 획득하기 위해 8주령의 암컷 생쥐에 5 IU PMSG을 복강주사하고, 48시간 후 5 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG; Sigma)을 주사하여 과배란을 유도하였다. hCG 주사 후 14시간에 수란관을 적출하여 난자-난구 복합체를 획득하였고, hyaluronidase (Sigma)를 이용하여 난구세포를 제거한 후 제 1극체가 보이는 성숙난자를 실험에 사용하였다. 착상 전 초기배아를 획득하기 위해 8주령의 암컷 생쥐에 PMSG와 hCG를 이용하여 과배란을 유도한 후 수컷 생쥐와 교배하였으며, 다음날 아침 질전이 확인된 생쥐를 각각 post-hCG 20, 48, 56, 65, 72, 96시간에 경추파괴로 도살하여 수정란, 2-세포기, 4-세포기, 8-세포기, 상실기배아, 포배기배아를 수획하였다.
- 면역형광염색분석법을 시행하기 위한 난자와 배아들은 10% sucrose가 첨가된 2% paraformaldehyde에서 15분간 고정한 후, PBS로 3회 세척하였다. 고정된 난자와 배아들은 3% BSA가 포함된 0.4% (v/v) Triton X-100 용액에서 10분간 permeabilization을 유도하고, 1차항체의 비특이적인 결합을 억제하기 위해 2% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, Rockville, MD, USA)이 첨가된 PBS에서 30분간 반응시켰다. 이들은 각각 1:200의 비율로 희석된 Id-1, Id-2, Id-3 (Santa Cruz biothechnology, Santa Cruz, CA, USA)에 대한 1차항체와 상온에서 2시간 동안 반응시키고, PBS로 3회 세척한 후 FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz)와 상온에서 2시간 동안 암반응시켰다.
- 이들은 각각 1:200의 비율로 희석된 Id-1, Id-2, Id-3 (Santa Cruz biothechnology, Santa Cruz, CA, USA)에 대한 1차항체와 상온에서 2시간 동안 반응시키고, PBS로 3회 세척한 후 FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz)와 상온에서 2시간 동안 암반응시켰다. 반응이 끝난 난자와 배아들은 PBS로 2회 세척하고 Hoechst33342 (Sigma)로 counterstaining한 후, 형광현미경 (Olympus BX-40, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
- 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction)은 정확도가 검증된 시발체를 사용하였으며 (Table 1), 기본적인 반응과정은 94℃에서 30초간 변성 (denaturation), 60℃에서 30초간 부착 (annealing), 72℃에서 30초간 신장 (extension)을 한 주기로 수행하였다. 반응이 끝난 생성물은 1.2% 아가로스젤에 전기영동한 후, UV하에서 발현량을 관찰하였다. 중합효소 연쇄 반응에서 cDNA의 존재를 확인하고, 동량의 RNA로부터 상대적인 양을 비교하기 위해 β-actin의 발현을 positive control로 사용하였다.
- 본 실험에서는 난자와 배아에서 Id 전령체의 발생단계적 발현양상을 관찰하기 위해 역전사 중합 효소 연쇄반응을 이용하였다 (Figure 1). Id-1과 Id-3전령체는 미성숙난자에서 발현하였지만, 성숙난자와 수정란에서는 발현하지 않았다.
- 1시간 정치한 후 다시 14,000 rpm, 4℃, 30분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후 75% ethanol 1 ml를 첨가하여 14,000 rpm, 4℃, 15분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 건조시킨 후 튜브에 0.1% DEPC 처리된 증류수 24 µl를 첨가하여 75℃에서 10분간 반응 후, 역전사반응 (reverse transcription)을 수행하였다. 역전사반응은 30개의 배아로부터 추출한 RNA를 이용하여 수행하였다.
- Louis, MO, USA)을 복강주사한 후 46시간에 난소를 적출하였으며, 19 gauge 주사바늘을 이용하여 미성숙난자를 획득하였다. 성숙난자 (MII oocyte)를 획득하기 위해 8주령의 암컷 생쥐에 5 IU PMSG을 복강주사하고, 48시간 후 5 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG; Sigma)을 주사하여 과배란을 유도하였다. hCG 주사 후 14시간에 수란관을 적출하여 난자-난구 복합체를 획득하였고, hyaluronidase (Sigma)를 이용하여 난구세포를 제거한 후 제 1극체가 보이는 성숙난자를 실험에 사용하였다.
- 1% DEPC 처리된 증류수 24 µl를 첨가하여 75℃에서 10분간 반응 후, 역전사반응 (reverse transcription)을 수행하였다. 역전사반응은 30개의 배아로부터 추출한 RNA를 이용하여 수행하였다.
- 2% 아가로스젤에 전기영동한 후, UV하에서 발현량을 관찰하였다. 중합효소 연쇄 반응에서 cDNA의 존재를 확인하고, 동량의 RNA로부터 상대적인 양을 비교하기 위해 β-actin의 발현을 positive control로 사용하였다.
- 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction)은 정확도가 검증된 시발체를 사용하였으며 (Table 1), 기본적인 반응과정은 94℃에서 30초간 변성 (denaturation), 60℃에서 30초간 부착 (annealing), 72℃에서 30초간 신장 (extension)을 한 주기로 수행하였다. 반응이 끝난 생성물은 1.
- hCG 주사 후 14시간에 수란관을 적출하여 난자-난구 복합체를 획득하였고, hyaluronidase (Sigma)를 이용하여 난구세포를 제거한 후 제 1극체가 보이는 성숙난자를 실험에 사용하였다. 착상 전 초기배아를 획득하기 위해 8주령의 암컷 생쥐에 PMSG와 hCG를 이용하여 과배란을 유도한 후 수컷 생쥐와 교배하였으며, 다음날 아침 질전이 확인된 생쥐를 각각 post-hCG 20, 48, 56, 65, 72, 96시간에 경추파괴로 도살하여 수정란, 2-세포기, 4-세포기, 8-세포기, 상실기배아, 포배기배아를 수획하였다.
대상 데이터
- 미성숙난자부터 포배기배아까지의 발생단계에서 Id 단백질의 발현을 면역형광염색분석법에 의해 관찰하였다 (Figure 2). 3회 반복실험을 통해 Id 단백질의 발현을 관찰하였으며, 각 실험의 발생단계마다 10~15개의 난자 및 배아를 사용하였다. Id-1 단백질은 미성숙난자부터 포배기배아 시기까지 주로 핵을 제외한 세포질부분에서 염색되었으며, 특히, 포배기배아에서는 세포막 주변으로 강하게 염색되었다 (Figure 2A1-2A6).
- 암컷은 생후 6~8주, 수컷은 10주 이상 된 것을 사용하였다. 미성숙난자 (germinal vesicle oocyte)를 획득하기 위해 6주령의 암컷 생쥐에 5 IU pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG; Sigma, St. Louis, MO, USA)을 복강주사한 후 46시간에 난소를 적출하였으며, 19 gauge 주사바늘을 이용하여 미성숙난자를 획득하였다. 성숙난자 (MII oocyte)를 획득하기 위해 8주령의 암컷 생쥐에 5 IU PMSG을 복강주사하고, 48시간 후 5 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG; Sigma)을 주사하여 과배란을 유도하였다.
- 반응에 사용한 모든 기구는 0.1% diethyl-pyrocarbonate (DEPC; Sigma)가 함유된 3차 증류수로 수세, 멸균하여 사용하였다. 과배란을 통하여 수획한 난자와 배아는 Ca2+, Mg2+-free phosphate buffered saline(PBS)에 수세하고, 다시 0.
- 본 실험에서는 명 12시간, 암 12시간으로 광주기가 조절되고, 물과 먹이가 충분히 공급되는 상태의 실험동물실에서 사육한 ICR계 생쥐를 사용하였다. 암컷은 생후 6~8주, 수컷은 10주 이상 된 것을 사용하였다.
- 본 실험에서는 명 12시간, 암 12시간으로 광주기가 조절되고, 물과 먹이가 충분히 공급되는 상태의 실험동물실에서 사육한 ICR계 생쥐를 사용하였다. 암컷은 생후 6~8주, 수컷은 10주 이상 된 것을 사용하였다. 미성숙난자 (germinal vesicle oocyte)를 획득하기 위해 6주령의 암컷 생쥐에 5 IU pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG; Sigma, St.
데이터처리
- Temporal expression patterns of Id family genes during oocyte growth and preimplantation development in mouse. The experiment was performed twice and the data, which are expressed relative to the amount present in the GV oocyte, are expressed as the mean ± range. GV, germinal vesicle oocyte; MII, metaphase II oocyte; PN, pronuclear stage embryo; 2C, 4C, 8C, M and BL represent two-cell, four-cell, eight-cell, morula, and blastocyst stage embryos, respectively.
이론/모형
- 미성숙난자부터 포배기배아까지의 발생단계에서 Id 단백질의 발현을 면역형광염색분석법에 의해 관찰하였다 (Figure 2). 3회 반복실험을 통해 Id 단백질의 발현을 관찰하였으며, 각 실험의 발생단계마다 10~15개의 난자 및 배아를 사용하였다.
성능/효과
- 그러나, 2-세포기 배아에서 다시 발현하기 시작하며, 상실기배아와 포배기배아 시기에 가장 높은 발현량을 보였다. Id-2 전령체는 미성숙난자부터 포배기배아 시기까지 모든 착상 전 배아발생단계에서 발현하였으며, Id-1, Id-3와 동일하게 포배기배아 시기에서 가장 높은 발현량이 관찰되었다. 그러나, 예외적으로 Id-4 전령체는 모든 발생단계에서 발현되지 않았다.
- Id-1과 Id-3전령체는 미성숙난자에서 발현하였지만, 성숙난자와 수정란에서는 발현하지 않았다. 그러나, 2-세포기 배아에서 다시 발현하기 시작하며, 상실기배아와 포배기배아 시기에 가장 높은 발현량을 보였다. Id-2 전령체는 미성숙난자부터 포배기배아 시기까지 모든 착상 전 배아발생단계에서 발현하였으며, Id-1, Id-3와 동일하게 포배기배아 시기에서 가장 높은 발현량이 관찰되었다.
- 본 실험의 연구결과에서 Id-1, Id-2, Id-3 전령체는 미성숙난자에서 모두 발현하였으며, 이것은 이들 유전자가 모계유래 유전자임을 나타낸다. 또한 첫번째 zygotic gene activation이 일어나는 2-세포기배아 시기부터 서서히 발현량이 증가하여 포배기배아 시기에 가장 높은 발현량을 보였다. 그러나, Id-4 전령체는 전혀 발현되지 않았다.
- 그러나, Id-4 전령체는 전혀 발현되지 않았다. 면역형광염색법을 이용한 단백질의 발현양상에서는 Id-1과 Id-2가 강한 발현을 보였으며, 핵을 제외한 세포막과 핵막주변에서 강하게 발현됨을 관찰할 수 있었다. 반면, Id-3 단백질의 형광염색 정도는 전령체의 발현량과는 달리 약하게 관찰되었다.
- 본 실험의 연구결과에서 Id-1, Id-2, Id-3 전령체는 미성숙난자에서 모두 발현하였으며, 이것은 이들 유전자가 모계유래 유전자임을 나타낸다. 또한 첫번째 zygotic gene activation이 일어나는 2-세포기배아 시기부터 서서히 발현량이 증가하여 포배기배아 시기에 가장 높은 발현량을 보였다.
- 본 연구에서는 착상 전 배아에서의 Id 유전자의 유무 및 발현양상을 관찰함으로써 포배기배아의 착상시 배아와 모체의 자궁간의 상호신호전달기작, 생리주기에 따른 자궁에서의 Id 유전자의 변화 및 착상 후 배아의 발생조절에 있어서의 Id 유전자가 중요한 작용할 것임을 간접적으로 증명하였다. 따라서, 포배기배아의 착상시기에 있어서 착상부위에서의 변화, 난소내 스테로이드 호르몬에 의한 조절 등에 대한 실험을 통해 착상 및 배아발생에 있어서의 Id 유전자의 정확한 분자생물학적 기작을 밝혀내는 것이 중요할 것으로 사료된다.
- 첫째, 포배기배아가 자궁에 착상하는 시기에 가장 큰 자궁의 형태학적인 변화는 착상부위에서의 혈관생성 (angiogenesis)이다. 실제로 최근 연구결과들은 Id 유전자가 혈관생성에 중요한 역할을 한다고 보고하고 있다.
후속연구
- 16 또한, Nah 등은 laser capture microdissection 기법을 이용하여 Id1 전령체가 에스트로젠에 의해 생쥐 자궁의 자궁내막세포 (luminal epithelial cells)에서만 발현이 유도된다는 것을 증명하였다.15 이러한 증거들은 Id 유전자가 생리주기 및 임신, 착상과정과 같은 자궁의 다양한 생리학적 또는 형태학적인 변화에 있어서 중요한 역할을 할 것임을 시사한다. 따라서, 본 연구에서는 난자 및 착상 전 배아를 대상으로 Id 전령체와 단백질의 발현양상을 조사하여 착상시기에 있어서 자궁과의 상호작용시 Id 유전자의 기능을 유추할 수 있는 자료를 제시하고자 수행하였다.
- 둘째, Id 유전자는 대표적인 dnHLH 단백질로서 HLH와 이종중합체 형성을 통해 발생단계에서의 세포분열 및 분화를 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 착상 전 배아에서의 Id 유전자의 발현은 착상 후 배아의 다양한 세포로의 분열 및 분화를 조절하는 기능을 할 것으로 추측된다. 실제로 현재 포유류에서는 Id-1, Id-2, Id-3, Id-4의 4 종류의 Id family 유전자가 동정되었으며5,6,7, 근세포형성 (myogenesis),8 골수세포형성 (myelopoiesis),9 림파구형성 (lymphopoiesis),10 골형성 (bone morphogenesis),11 사구체간질 세포발생 (kidney glomerular mesangial cell development)12 등의 다양한 발생과정 동안에 Id 유전자가 bHLH 단백질의 활성을 억제하는 것으로 보고되었다.
- 본 연구에서는 착상 전 배아에서의 Id 유전자의 유무 및 발현양상을 관찰함으로써 포배기배아의 착상시 배아와 모체의 자궁간의 상호신호전달기작, 생리주기에 따른 자궁에서의 Id 유전자의 변화 및 착상 후 배아의 발생조절에 있어서의 Id 유전자가 중요한 작용할 것임을 간접적으로 증명하였다. 따라서, 포배기배아의 착상시기에 있어서 착상부위에서의 변화, 난소내 스테로이드 호르몬에 의한 조절 등에 대한 실험을 통해 착상 및 배아발생에 있어서의 Id 유전자의 정확한 분자생물학적 기작을 밝혀내는 것이 중요할 것으로 사료된다.
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