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문제 정의
- 따라서, 본 실험의 목적은 본 연구소가 보유하고 있는 미국 NIH에 등록된 MB03 배아줄기세포주에 다양한 신경성장촉진 인자들을 처리하여 신경세포로의 분화경향을 조사하고, 이들 처리방법에 따른 도파민 신경세포 형성율을 조사하는데에 있다.
- 본 연구는 인간 배아줄기세포로부터 체외에서 bFGF나 RA와 같은 분화유도제를 이용하여 신경세포로의 분화가 용이하게 이루어질 수 있음을 나타내며, 특히 파킨슨병 질환치료에 유용하게 이용될 수 있는 도파민성 신경세포의 형성에 BDNF와 TGF-α 같은 신경성장 촉진 인자가 효과적으로 이용될 수 있음을 나타낸다.
제안 방법
- M, Sigma)가 포함된 20% SR 배양액에서 4일동안 추가 부유배양하여 신경 전구세포 형성을 유도하였다. 신경세포로의 분화를 위해서는 RA를 제거하고 laminin이 코팅된 glass coverslip에 부착하여 7일, 14일 또는 21일동안 N2-배양액 내에서 배양하였다.
- 신경분화의 정도는 신경세포에서 발현되는 것으로 알려진 단백질에 대한 항체를 사용한 면역세포화학염색 방법을 이용하여 조사하였다. 세포형태의 고정은 4% paraformaldehyde (Sigma)로 10분간 상온처리 하였고, 항체의 세포막 투과를 높이기 위해 0.02% Triton X-100 (Sigma)을 10분간 처리하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위하여 5% normal goat serum (Vector)으로 1시간 동안 상온에서 반응시켰고, 1차 항체의 처리는 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다.
- 한편, 기능성 신경세포에 대한 표지 항체로는 도파민 신경세포에 대한 anti-tyrosine hydroxylase (TH; monoclonal antibody, 1:1,000, Chemicon)와 GABAergic 신경세포에 대한 anti-glutamic acid decarboxylase (GAD; 1:4,000, Chemicon, Figure 1F)가 사용되었다. 형광현미경을 이용한 관찰을 위해 2차항체로는 TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanate) conjugated goat anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG (1:800, Jackson Immunoresearch)와 FITC (fluorescein isothiocyanate) conjugated goat anti rabbit IgG (1:200, Jackson Immunoresearch)을 처리하였다. 그리고 마지막으로 모든 시료의 염색 빈도를 좀 더 정확하게 조사하기 위하여 DAPI (4', 6-diamidine-2'phenylindole dihydrochloride, 1:2,000, Roche)염색을 상온에서 1시간 동안 추가적으로 실시하였다.
- 염색이 끝난 각각의 시료들은 포매하여 그 결과를 Nikon 형광 현미경을 이용하여, FITC의 경우 520 nm, TRITC의 경우 630 nm 발광필터에서 관찰하였다. 200배율의 현미경에서 분석 필드는 20군데 이상 조사하였고, 조사된 총 세포수는 대략 1000개 이상이었으며, 실험의 재현성을 높이기 위하여 각각의 처리군에서 6회 반복 실시하였다.
- 신경분화 시스템에서 최종적으로 획득된 신경세포가 퇴행성 뇌질환 세포치료에 접근가능한지의 여부를 알아보기 위하여 면역세포화학적 염색 방법을 이용해 도파민성 신경세포로의 분화정도를 TH 발현세포의 빈도로 확인하였다. 그 결과 두 분화 유도방법에서 공통적으로 BDNF또는 TGF-α를 처리하는 것이 유의하게 TH발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있었으며 (p<0.
- 일반적으로, 배아줄기세포의 체외분화 유도는 미분화상태를 유지하는 환경을 제거하고 직접적으로 분화유도제를 첨가해주거나 일반적으로 사용하는 방법인 3배엽성의 특성을 나타내는 embryoid body를 이용하는 것이다. 본 연구에서는 4일령의 embryoid body에 두가지의 신경분화유도제인 bFGF와 RA를 첨가하여 신경전구세포를 형성시켰다. 신경전구세포를 형성시키는 기간까지 소요되는 기간은 bFGF의 경우 18일, RA의 경우 8일이 걸리므로 최종 분화단계인 21일을 합하면 배아줄기세포로부터 신경세포로의 분화가 이루어지는데 걸리는 기간은 대략 39일과 29일이 된다.
- 1 mM β-mercaptoethanol, 1% ribonucleosides, 1% non-essential amino acids과 4 ng/ml bFGF를 첨가하였다. 또한, 생쥐세포와의 공동배양에 따른 종간 오염을 줄이기 위해 STO 세포없이 5% Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA)이 코팅된 배양접시에서 영양화배양액 (conditioned medium)으로 10회 추가 계대 배양하였다. 영양화 배양액은 STO 세포가 들어있는 배양용기 (4 × 106 cells/75 cm2)에 20% FBS를 대신하여 20% serum replacement (SR; Gibco)가 첨가된 줄기세포 배양액을 사용하여 2일부터 일주일간 매일 배양액을 교체해주면서 수거하였으며, 0.
- 또한, 생쥐세포와의 공동배양에 따른 종간 오염을 줄이기 위해 STO 세포없이 5% Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA)이 코팅된 배양접시에서 영양화배양액 (conditioned medium)으로 10회 추가 계대 배양하였다. 영양화 배양액은 STO 세포가 들어있는 배양용기 (4 × 106 cells/75 cm2)에 20% FBS를 대신하여 20% serum replacement (SR; Gibco)가 첨가된 줄기세포 배양액을 사용하여 2일부터 일주일간 매일 배양액을 교체해주면서 수거하였으며, 0.22 µl 필터로 여과한 뒤 줄기세포 배양에 사용하였다.
- 인간 배아줄기세포의 신경세포 분화 유도제는 bFGF와 RA를 이용하였다. 또한, 신경세포분화를 더 증진시키고자 brain derived neurotrophic factor (BDNF)나 transforming growth factor (TGF)-α와 같은 신경성장 촉진인자를 첨가하여 그 효과를 조사하였다. 분화 유도를 위해 배아줄기세포는 1차적으로 0.
- Korea)가 포함된 N2-배양액에서 6일 동안 배양되었다. 그리고 최종적으로 신경세포로의 분화를 위해 bFGF가 제거된 N2-배양액에서 7일, 14일 또는 21일 동안 배양되었다. N2-배양액은 DMEM/F12 배양액에 혈청대신 insulin (5 mg/L, Sigma), putrescine (100 µM, Sigma), sodium selenite (30 nM, Sigma), apo-transferrin (100 μg/ml, Sigma), progesterone (20 nM, Sigma) 이 첨가된 신경분화용 배양액이다.
-
3) 신경성장 촉진인자의 첨가에 따른 신경분화
분화유도제가 제거되고 신경세포로의 분화를 유도하는 N2-배양액만이 처리되는 21일동안에 10 ng/ml BDNF (Chemicon) 또는 10 ng/ml TGF-α (R&D systems Inc)의 첨가가 신경세포의 분화와 기능성 신경세포의 형성에 미치는 영향을 조사하였다.
- 형광현미경을 이용한 관찰을 위해 2차항체로는 TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanate) conjugated goat anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG (1:800, Jackson Immunoresearch)와 FITC (fluorescein isothiocyanate) conjugated goat anti rabbit IgG (1:200, Jackson Immunoresearch)을 처리하였다. 그리고 마지막으로 모든 시료의 염색 빈도를 좀 더 정확하게 조사하기 위하여 DAPI (4', 6-diamidine-2'phenylindole dihydrochloride, 1:2,000, Roche)염색을 상온에서 1시간 동안 추가적으로 실시하였다. 염색이 끝난 각각의 시료들은 포매하여 그 결과를 Nikon 형광 현미경을 이용하여, FITC의 경우 520 nm, TRITC의 경우 630 nm 발광필터에서 관찰하였다.
- 그리고 마지막으로 모든 시료의 염색 빈도를 좀 더 정확하게 조사하기 위하여 DAPI (4', 6-diamidine-2'phenylindole dihydrochloride, 1:2,000, Roche)염색을 상온에서 1시간 동안 추가적으로 실시하였다. 염색이 끝난 각각의 시료들은 포매하여 그 결과를 Nikon 형광 현미경을 이용하여, FITC의 경우 520 nm, TRITC의 경우 630 nm 발광필터에서 관찰하였다. 200배율의 현미경에서 분석 필드는 20군데 이상 조사하였고, 조사된 총 세포수는 대략 1000개 이상이었으며, 실험의 재현성을 높이기 위하여 각각의 처리군에서 6회 반복 실시하였다.
- 배아 줄기세포에서 얻어진 신경세포 내 dopamine양을 측정하기 위하여 HPLC방법을 사용하였다. 시료는 bFGF 분화유도계의 대조군과, BDNF첨가군 그리고 TGF-α 첨가군으로 나누어 조사하였다. 분화 최종단계인 21일 배양일에 대략 5 × 106 세포를 PBS buffer에 한번 세척한 뒤, 원심분리하여 세포괴를 얻고 0.
- 시료는 bFGF 분화유도계의 대조군과, BDNF첨가군 그리고 TGF-α 첨가군으로 나누어 조사하였다. 분화 최종단계인 21일 배양일에 대략 5 × 106 세포를 PBS buffer에 한번 세척한 뒤, 원심분리하여 세포괴를 얻고 0.1 mM EDTA 항산화제가 첨가된 0.1M perchloric acid (Sigma-Aldrich, Switzerland)를 첨가하여 초음파 마쇄기 (sonicator)로 세포를 융해시켜 균등액을 제조한 후, 다시 12,000 g에서 10분 원심분리하여 그 상층액을 수획하였다. 상층액은 니트로셀룰로스 막 여과지 (nitrocellulose membrane filter, 0.
- 4 µm)로 여과한 뒤 HPLC (Gilson)에 10 µl의 시료를 주입하였다. HPLC에서 분리된 물질들은 전기화학검출기 (electrochemical detector)로 확인하였다. HPLC 분리조건은 Shiseido C18 column을 사용하고 이동상 (mobile phase)은 0.
- 7 ml/min으로 사용하였다. 실험수행에 따른 오차범위를 확인하고 도파민 결과수치를 보정하기 위해 균등액 제조시 일정량의 2 µM dihydroxybenzylamine (DHBA; Sigma)를 첨가하여 내부기준 (internal standard)으로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 MB03 세포 (Figure 1A) 는 인간의 불임시술 과정에서 사용되고 남은 잉여 배아를 5년 이상 동결 보존한 뒤, 환자의 동의를 받고 사용하여 확립되어진 미국 국립보건원에 등록된 인간 배아줄기세포주이다.11 이들 세포의 초기배양은 미국 ATCC사에서 구입한 STO (immortalized mouse embryonic fibroblast, CRL-1503) 세포를 250,000 cells/1.
- 4일령의 EB를 RA (10-6M, Sigma)가 포함된 20% SR 배양액에서 4일동안 추가 부유배양하여 신경 전구세포 형성을 유도하였다. 신경세포로의 분화를 위해서는 RA를 제거하고 laminin이 코팅된 glass coverslip에 부착하여 7일, 14일 또는 21일동안 N2-배양액 내에서 배양하였다.
- 11 이들 세포의 초기배양은 미국 ATCC사에서 구입한 STO (immortalized mouse embryonic fibroblast, CRL-1503) 세포를 250,000 cells/1.77cm2로 준비한 뒤, 그 위에서 10회 계대 배양되었으며, 이때 사용된 줄기세포배양액은 Knockout-Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco, Grand Island, NY)에 20% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT), 1 mM glutamine, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1% ribonucleosides, 1% non-essential amino acids과 4 ng/ml bFGF를 첨가하였다. 또한, 생쥐세포와의 공동배양에 따른 종간 오염을 줄이기 위해 STO 세포없이 5% Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA)이 코팅된 배양접시에서 영양화배양액 (conditioned medium)으로 10회 추가 계대 배양하였다.
- 인간 배아줄기세포의 신경세포 분화 유도제는 bFGF와 RA를 이용하였다. 또한, 신경세포분화를 더 증진시키고자 brain derived neurotrophic factor (BDNF)나 transforming growth factor (TGF)-α와 같은 신경성장 촉진인자를 첨가하여 그 효과를 조사하였다.
- 비특이적 결합을 방지하기 위하여 5% normal goat serum (Vector)으로 1시간 동안 상온에서 반응시켰고, 1차 항체의 처리는 4℃에서 하룻밤동안 반응시켰다. 분화단계에 따른 1차 항체로는 신경세포의 미성숙 단계에서 발현하는 물질에 대한 항체로서 anti-neurofilament 160 (NF 160; monoclonal antibody, 1:4,000, Sigma, Figure 1C), 신경세포의 성숙 단계에서 발현하는 물질에 대한 항체로서 anti-neurofilament 200 (NF200; monoclonal antibody, 1:4,000, Sigma, Figure 1D), 신경 보조세포로 알려져 있는 성상교세포 (astrocyte)에 대한 표지 항체로 anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP;polyclonal antibody, 1:500, DAKO, Figure 1E)을 사용하였다. 한편, 기능성 신경세포에 대한 표지 항체로는 도파민 신경세포에 대한 anti-tyrosine hydroxylase (TH; monoclonal antibody, 1:1,000, Chemicon)와 GABAergic 신경세포에 대한 anti-glutamic acid decarboxylase (GAD; 1:4,000, Chemicon, Figure 1F)가 사용되었다.
데이터처리
- 형광발현율 결과의 통계학적 분석은 SAS release 8.02 (TS level 02M0)으로 조사하였고, HPLC 결과는 one-way ANOVA test 후 Mann-Whitney U test를 시행하여 p값이 0.05이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 신경분화의 정도는 신경세포에서 발현되는 것으로 알려진 단백질에 대한 항체를 사용한 면역세포화학염색 방법을 이용하여 조사하였다. 세포형태의 고정은 4% paraformaldehyde (Sigma)로 10분간 상온처리 하였고, 항체의 세포막 투과를 높이기 위해 0.
- 배아 줄기세포에서 얻어진 신경세포 내 dopamine양을 측정하기 위하여 HPLC방법을 사용하였다. 시료는 bFGF 분화유도계의 대조군과, BDNF첨가군 그리고 TGF-α 첨가군으로 나누어 조사하였다.
성능/효과
- 3% (D21)로 감소되는 유사한 경향을 나타내어 두 방법 모두 신경세포의 분화에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다 (Figure 2). 또한, 신경보조세포로의 발현 정도를 확인하기 위하여 성상교세포에만 특이적으로 발현하는 중간 미세섬 유인 GFAP를 조사하였던 바, 배양 7일에는 30~34%, 배양 14일에는 16~22%, 그리고 배양 21일에는 9~ 12%로 두 처리군 모두 유사하게 발현율이 감소한다는 것이 확인되어 본 실험에 사용된 분화방법은 신경보조세포로의 분화는 억제되고 신경세포로의 분화가 더 많이 유도된다는 것을 알 수 있었다.
- 신경성장 촉진인자인 BDNF 또는 TGF-α 를 신경세포로 분화시키는 21일 동안에 첨가하여 NF-200을 기준으로 비교 조사하였던 결과, 최종단계인 21일째 bFGF 유도군에서 78.1 ± 2.7%과 78.4 ± 3.3%을 나타내고 RA 유도군에서 70.3 ± 1.2%와 76.1 ± 2.7%를 각각 나타내어 비 첨가군과 (bFGF; 76.2 ± 2.3%, TGF-α; 74.2 ± 2.0%) 유의한 차이 없는 유사한 NF-200의 증가를 확인하였다 (Figure 3). 그러나 분화 7일째 bFGF 유도군 중 TGF-α를 처리한 군(53.
- 따라서 RA유도방법을 사용하게 되면 신경세포 분화기간을 단축시킬 수 있지만 RA처리가 세포증식을 저해하는 영향을 주므로 세포회수율이 떨어지는 단점이 있는 반면, bFGF방법은 처리기간은 길지만 세포증식을 증진시키는 특성을 갖고 있어 세포회수율이 높은 장점이 있다. 본 실험결과에 따르면 배아줄기세포 유래 신경 전구세포를 두가지 (bFGF와 RA) 유도방법으로 획득한 후 21일 동안 장기간 분화시켰을때, 신경세포 관련 표지 물질이 모두 다량으로 유사하게 발현되는 것이 확인되어 신경세포로의 분화가 두 방법으로 모두 용이하게 이루어질 수 있음을 확인하였다.
- 18,19 TGF-α는 외배엽 그리고 중배 엽기원의 세포분열에 기여하고 축색의 생장과 중추신경계 유래 미성숙 및 성숙 신경세포의 분화과정 대사에 관여한다고 보고되었다.14,20 본 실험에서 bFGF나 RA를 제거하고 분화 21일 동안 신경분 화용 배양액인 N2-배양액에 신경성장 촉진인자를 첨가하였을 때에도 신경세포로의 분화는 대조군과 유사한 분화빈도를 나타낸다는 것이 NF-200 양성 세포의 빈도수조사를 통해 확인되었다. 그러나 bFGF 분화유도군 중 TGF-α 처리군의 신경분화는 다른 처리군에 비해 유의하게 빠르게 이루어짐을 알 수있었으며, 이러한 경향은 TH 발현빈도조사에서도 증명되었다.
- 14,20 본 실험에서 bFGF나 RA를 제거하고 분화 21일 동안 신경분 화용 배양액인 N2-배양액에 신경성장 촉진인자를 첨가하였을 때에도 신경세포로의 분화는 대조군과 유사한 분화빈도를 나타낸다는 것이 NF-200 양성 세포의 빈도수조사를 통해 확인되었다. 그러나 bFGF 분화유도군 중 TGF-α 처리군의 신경분화는 다른 처리군에 비해 유의하게 빠르게 이루어짐을 알 수있었으며, 이러한 경향은 TH 발현빈도조사에서도 증명되었다. 각 분화유도군 그리고 신경성장촉진 인자 처리군을 포함한 총 6군의 TH 발현율을 조사하였던 결과, RA 유도군보다는 bFGF 유도군에서 발현율이 높으며 신경성장촉진인자 처리군이 대조 군보다 유의하게 TH 발현율이 높게 나타났다.
- 따라서, 본 실험에서 인간 배아줄기세포유래 신경세포 분화는 bFGF 분화유도제를 사용하고 TGFα 신경성장촉진인자를 첨가시키는 분화방법에 의해 파킨슨병 질환치료에 도움이 되는 TH를 발현하는 기능성 도파민 신경세포의 생성율을 높일 수 있다는 것을 알 수 있었다.
- 인간 배아줄기세포를 bFGF 와 RA를 첨가하여 신경전구세포로 유도한 뒤 신경분화용 배양액에서 21일까지 장기간 분화시켰을 때, 분화기간이 길어질수록 성숙 신경세포골격의 중간 미세섬유에서 확인되는 표지 물질인 NF200 양성세포수는 bFGF 처리군의 경우 26.2 ± 2.7% (D0)에서 75.1 ± 4.0% (D21)로, RA처리군의 경우 21.4 ± 2.0% (D0)에서 75.3 ± 2.7% (D21)로 증가되는 반면, 미성숙 신경세포의 성장 단계에서 나타나는 표지인자인 NF160은 bFGF처리군의 경우 33.1 ± 1.3% (D7)에서 18.2 ± 4.2% (D21)로 RA처리군의 경우 43.3 ± 2.2% (D7)에서 19.4 ± 1.3% (D21)로 감소되는 유사한 경향을 나타내어 두 방법 모두 신경세포의 분화에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다 (Figure 2). 또한, 신경보조세포로의 발현 정도를 확인하기 위하여 성상교세포에만 특이적으로 발현하는 중간 미세섬 유인 GFAP를 조사하였던 바, 배양 7일에는 30~34%, 배양 14일에는 16~22%, 그리고 배양 21일에는 9~ 12%로 두 처리군 모두 유사하게 발현율이 감소한다는 것이 확인되어 본 실험에 사용된 분화방법은 신경보조세포로의 분화는 억제되고 신경세포로의 분화가 더 많이 유도된다는 것을 알 수 있었다.
- 0%) 유의한 차이 없는 유사한 NF-200의 증가를 확인하였다 (Figure 3). 그러나 분화 7일째 bFGF 유도군 중 TGF-α를 처리한 군(53.4 ± 5.5%)의 결과가 다른 군들 (26.2 ± 2.7%~ 34.3 ± 1.7%)보다 유의하게 높게 나타나 (p<0.05), bFGF로 신경분화를 유도하고 TGF-α를 추가적으로 처리하는 것이 신경세포로의 분화가 좀 더 빠르게 진행됨을 알 수 있었다.
- 신경분화 시스템에서 최종적으로 획득된 신경세포가 퇴행성 뇌질환 세포치료에 접근가능한지의 여부를 알아보기 위하여 면역세포화학적 염색 방법을 이용해 도파민성 신경세포로의 분화정도를 TH 발현세포의 빈도로 확인하였다. 그 결과 두 분화 유도방법에서 공통적으로 BDNF또는 TGF-α를 처리하는 것이 유의하게 TH발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있었으며 (p<0.05) 두 분화 유도군 간에 있어서는 유의한 차이는 나타나지 않으나, bFGF 유도군이 RA 유도군 보다 분화 유도되는 기간 내내 지속적으로 TH 발현율이 높다는 것을 알 수 있었다 (Figure 4). 특히 bFGF 유도군 안에서도 TGF-α 처리군 (D7; 14.
- 05) 두 분화 유도군 간에 있어서는 유의한 차이는 나타나지 않으나, bFGF 유도군이 RA 유도군 보다 분화 유도되는 기간 내내 지속적으로 TH 발현율이 높다는 것을 알 수 있었다 (Figure 4). 특히 bFGF 유도군 안에서도 TGF-α 처리군 (D7; 14.0 ± 2.7%, D14; 16.2 ± 2.7%, D21; 20.4 ± 2.3%)이 BDNF 처리군 (D7; 9.2 ± 2.2%, D14; 11.3 ± 3.2%, D21; 16.2 ± 2.3%)과 대조군 (D7; 3.4 ± 1.7%, D14; 5.2 ± 1.8%, D21; 9.3 ± 2.3%) 보다 TH 발현세포의 빈도가 높다는 것을 알 수 있었다. 한편, GABAergic 신경세포의 표지인자인 GAD 발현율은 배양 21일째 26~30%로 유사하게 나타나 BDNF나 TGF-α의 첨가에 의해 크게 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.
- 3%) 보다 TH 발현세포의 빈도가 높다는 것을 알 수 있었다. 한편, GABAergic 신경세포의 표지인자인 GAD 발현율은 배양 21일째 26~30%로 유사하게 나타나 BDNF나 TGF-α의 첨가에 의해 크게 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.
- TH발현율이 높은 bFGF유도군의 dopamine 생성을 HPLC 방법으로 확인하였던 바, BDNF (151.4 ± 36.5 pmol/mg)와 TGF-α (265.5 ± 62.8 pmol/mg)를 처리한 군의 결과가 대조군의 결과 (52.3 ± 8.4 pmol/mg) 에 비해 유의하게 높게 나타나는 것을 확인하였다(p<0.05).
- 그러나 bFGF 분화유도군 중 TGF-α 처리군의 신경분화는 다른 처리군에 비해 유의하게 빠르게 이루어짐을 알 수있었으며, 이러한 경향은 TH 발현빈도조사에서도 증명되었다. 각 분화유도군 그리고 신경성장촉진 인자 처리군을 포함한 총 6군의 TH 발현율을 조사하였던 결과, RA 유도군보다는 bFGF 유도군에서 발현율이 높으며 신경성장촉진인자 처리군이 대조 군보다 유의하게 TH 발현율이 높게 나타났다. 그리고 신경성장촉진 인자중에서도 TGF-α 처리군의 결과가 BDNF 처리군의 결과보다 높게 나타나, 본실험에서 인간 배아줄기세포유래 신경세포분화는 bFGF방법으로 신경분화를 유도하고, 분화단계 21일동안 TGF-α를 N2-배양액에 첨가하였을 때 대조군에 비해 2배 이상의 (20%) 의 도파민 신경세포를 형성시킬 수 있다는 것을 TH발현율을 통해 확인하였다.
- 각 분화유도군 그리고 신경성장촉진 인자 처리군을 포함한 총 6군의 TH 발현율을 조사하였던 결과, RA 유도군보다는 bFGF 유도군에서 발현율이 높으며 신경성장촉진인자 처리군이 대조 군보다 유의하게 TH 발현율이 높게 나타났다. 그리고 신경성장촉진 인자중에서도 TGF-α 처리군의 결과가 BDNF 처리군의 결과보다 높게 나타나, 본실험에서 인간 배아줄기세포유래 신경세포분화는 bFGF방법으로 신경분화를 유도하고, 분화단계 21일동안 TGF-α를 N2-배양액에 첨가하였을 때 대조군에 비해 2배 이상의 (20%) 의 도파민 신경세포를 형성시킬 수 있다는 것을 TH발현율을 통해 확인하였다. 또한, 세포내 도파민양을 HPLC방법을 통해 조사하였던 바, 앞선 내용과 일치하게 bFGF로 유도하고 TGF-α를 처리한 군에서 유의하게 높은 것을 알 수 있었다.
- 그리고 신경성장촉진 인자중에서도 TGF-α 처리군의 결과가 BDNF 처리군의 결과보다 높게 나타나, 본실험에서 인간 배아줄기세포유래 신경세포분화는 bFGF방법으로 신경분화를 유도하고, 분화단계 21일동안 TGF-α를 N2-배양액에 첨가하였을 때 대조군에 비해 2배 이상의 (20%) 의 도파민 신경세포를 형성시킬 수 있다는 것을 TH발현율을 통해 확인하였다. 또한, 세포내 도파민양을 HPLC방법을 통해 조사하였던 바, 앞선 내용과 일치하게 bFGF로 유도하고 TGF-α를 처리한 군에서 유의하게 높은 것을 알 수 있었다.
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