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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 효율적인 난자의 냉동보존 방법을 확립하기 위하여 냉동 방법에 따른 난자 생존률을 비교하였으며, 특히 초자화동결 기구에 따른 생존률 spindle의 재회복 정도를 비교하고자 동결 융해 후 생존 난자를 배양한 뒤 spindle과 염색체 (chromosome)의 재배열 상태를 비교, 분석하였다.
제안 방법
- 10% FBS-dPBS를 기본배양액으로 10% (v/v) ethylene glycol (EG, Sigma) 동결액에 난자를 5분간 노출시켜 탈수화 평형 (dehydration equilibration)을 유도한 후 40% (v/v) EG+0.6M sucrose 동결액에 옮긴 즉시 electron microscope grid (EM grid, 400 mesh; Gilder, USA) 또는 cryo loop (Hampton, USA)에 적재하여 액체질소에 넣었다. 이때 EM grid 또는 cryo loop를 액체 질소 내로 침지하기까지 걸리는 시간은 60초를 넘기지 않았다.
- 염색된 난자는 PBS로 세척하여 슬라이드에 고정시킨 후 400배 형광 현미경 하에서 관찰하였다. Spindle의 형태는 정상(barrel-shaped), 부분 비정상 또는 비정상(multipolar or absent shaped)으로 구분하였다.
- 과배란 유도를 위하여 의 5 IU pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG, Sigma)을 생쥐 암컷에 복강 주사하고 시간 후 의 48 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG, Sigma) . 을 복강 주사하였다 성숙 난자를 얻기 위하여 주사 시간 후 수란 hCG 14관을 적출하여 배란된 난자를 분리하였다.
- 02% sodium azide가 함유된 PBS에서 냉장 보관하였다. 냉장 보관된 난자의 spindle을 염색하기 위하여 0.1 mM glycine, 0.01% Triton X-100, 1% powdered milk, 0.5% BSA, 0.02% sodium azide가 첨가된 PBS에 30분간 처리한 후 fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated monoclonal anti-β-tubulin clone (1:100, Sigma, F-2043)으로 8시간 이상 처리하였다. 다시 염색체를 염색하기 위하여, blocking solution에 30분간 처리한 후 5 µg/ml propidium iodide (PI, Sigma, P-4170) 로 90분간 처리하였다.
- 다시 염색체를 염색하기 위하여, blocking solution에 30분간 처리한 후 5 µg/ml propidium iodide (PI, Sigma, P-4170) 로 90분간 처리하였다. 염색된 난자는 PBS로 세척하여 슬라이드에 고정시킨 후 400배 형광 현미경 하에서 관찰하였다. Spindle의 형태는 정상(barrel-shaped), 부분 비정상 또는 비정상(multipolar or absent shaped)으로 구분하였다.
- 과배란 유도를 위하여 의 5 IU pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG, Sigma)을 생쥐 암컷에 복강 주사하고 시간 후 의 48 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG, Sigma) . 을 복강 주사하였다 성숙 난자를 얻기 위하여 주사 시간 후 수란 hCG 14관을 적출하여 배란된 난자를 분리하였다. Hyaluronidase (Sigma)를 이용하여 구 세포를 제거하고 제 극체 가 관찰되는 성숙된 1 (first polar body) 난자만을 선별하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 20% fetal bovine serum (FBS)이 포함된 Dulbecco s′ phosphate-buffered saline (dPBS, GIBCO BRL)을 기본배양액으로, 1.5 M 1,2-propanediol (PROH, Sigma)와 0.1 M sucrose (Sigma)를 동결보호제로 사용하였다. 기본배양액에서 5분, 상온에서 1.
- 을 복강 주사하였다 성숙 난자를 얻기 위하여 주사 시간 후 수란 hCG 14관을 적출하여 배란된 난자를 분리하였다. Hyaluronidase (Sigma)를 이용하여 구 세포를 제거하고 제 극체 가 관찰되는 성숙된 1 (first polar body) 난자만을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에서는 생후 5~6주 된 암컷과 생식력이 확인된 수컷 ICR 생쥐를 사용하였다.
데이터처리
- 통계적 분석은 ABstat (rel 6.54, Anderson-Bell Co.)의 chi-square test를 이용하였고, p값이 0.05이하인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 융해는 급속 융해 방법을 이용하였다. 액체 질소통에서 꺼낸 straw를 상온에서 40초간, 37℃ 항온 수조에서 1분간 수평을 유지한 채 완전히 융해시켰다.
성능/효과
- Cryo loop와 EM grid를 각각 사용한 초자화동결 실험에서 두 실험군 간의 정상적인 spindle의 비율은 cryo loop를 사용한 실험군에서 약간 높게 나타났으나 통계적 차이는 없었다 (69.3% vs. 60.6%). 또한, 두 실험군의 정상 염색체의 비율도 cryo loop를 사용한 실험군에서 높게 나타났으나 (65.
- 또한 본 실험에서는 두 초자화동결 방법에서 spindle과 염색체의 정상비율이 69.3% 대 60.6%과 65.3% 대 57.5%로서 cryo loop 군에서 약간 높으나 통계적 차이는 나타나지 않았다. Park 등은24 EM grid를 사용하여 생쥐 성숙난자를 초자화동결 하였을 때 본 실험 결과와 유사한 60.
- 4%로 두 논문과는 다른 결과를 보였다. 또한 완만 동결 방법의 난자 생존률보다 초자화동결 융해 방법의 생존률이 유의하게 높게 나타났다 (24.4% vs. 62.7%, p<0.01). 초자화동결 융해 방법의 경우 같은 동결보호제와 시간으로 동결하되 동결기구를 달리했을 때 cryo loop군이 EM grid군보다 높은 생존률을 나타내었다.
- 본 실험에서는 생쥐 난자의 동결시 초자화동결 방법이 완만 동결법보다 높은 생존률을 나타내었다. 그러나 초자화동결시 사용되는 두 기구 모두 액화 질소 내에서 저장하는 동안 액화 질소에 직접 노출되므로 액화질소에 의한 오염 가능성이 제기되고 있다.
- 생쥐의 성숙 난자를 냉동보존 방법인 완만 동결 방법과 초자화동결 방법으로 동결한 비교 실험에서 난자의 생존률은 완만 동결 방법을 사용한 실험군의 생존률(24.4%)보다 초자화동결 방법을 사용한 실험군의 생존률(62.7%)이 유의하게 높게 나타났다 (p<0.01). 한편 같은 초자화동결 과정에서도 각각 cryo loop와 EM grid의 결과를 비교하였을 때 cryo loop를 사용한 실험군에서 더 높은 생존률이 나타났으며 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 (67.
- 01). 한편 같은 초자화동결 과정에서도 각각 cryo loop와 EM grid의 결과를 비교하였을 때 cryo loop를 사용한 실험군에서 더 높은 생존률이 나타났으며 통계적으로 유의한 차이가 나타났다 (67.7% vs 53.5%, p<0.05) (Table 1).
후속연구
- 그러나 초자화동결시 사용되는 두 기구 모두 액화 질소 내에서 저장하는 동안 액화 질소에 직접 노출되므로 액화질소에 의한 오염 가능성이 제기되고 있다. 따라서 앞으로 동결 융해한 난자의 생존률을 배아의 동결융해 후 생존률과 같은 수준으로 높이기 위한 초자화동결 방법을 적용하기 위해서는 액체 질소의 오염 가능성 문제를 극복하여야 한다. 또한 최근 소개되고 있는 동결액의 조성 물질 중 sodium을 choline solution으로 대체시켜 effect를 감소시키는 방법26 등 다양한 부분에서 연구가 이루어져야 하고, 이러한 결과들을 인간 난자에 적용하기 위해서는 spindle 손상에 대한 안정성을 증명할 수 있는 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 따라서 앞으로 동결 융해한 난자의 생존률을 배아의 동결융해 후 생존률과 같은 수준으로 높이기 위한 초자화동결 방법을 적용하기 위해서는 액체 질소의 오염 가능성 문제를 극복하여야 한다. 또한 최근 소개되고 있는 동결액의 조성 물질 중 sodium을 choline solution으로 대체시켜 effect를 감소시키는 방법26 등 다양한 부분에서 연구가 이루어져야 하고, 이러한 결과들을 인간 난자에 적용하기 위해서는 spindle 손상에 대한 안정성을 증명할 수 있는 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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