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문제 정의
- 완전히 유도된 사부세포에서는 단당류 능동 수송계는 사라지고, sucrose 능동 수송계가 새로 유도되었다(Cho 1998). 유조직 세포로 분화하는 동안 어느 시기에 이당류 능동 수송계가 유도되는지 또는 어느 시점까지 두 종류의 당류 수송계가 서로 공존하는지를 알고자 하였다. 세포의 자유 공간에 있는 산성 invertase의 활성을 막기 위해서 유조직 원형질체와 사부 원형질체 및 사부세포 를 이용하여 당류들의 능동 수송을 측정하였다 (Table 2).
제안 방법
- 의 값을 즉정하였다. Km과 Vmax의 값은 당류 농도에 의존하는 능동 수송 속도를 측정하여 결정하였다. 측정 방법은 위에 설명한 당류의 능동 수송 속도 측정방법과 마찬가지로 당류를 준비하여 능동 수송을 측정하였다.
- 배추과 Streptanthus fatns의 조직배양세포는 자엽에서 유도하였다. MS (Murashige and Skoog 1962) 기본배지에다 4 mg/L의 2,4-D를 첨가한 배지를 사용하여 유도시켰고, 액체배지는 동일배지에 2 mg/L 2,4-D 를 첨가하여 사용하였다. 액체배양은 100 mL 삼각 플라스크를 이용하여 25℃ 암소에서 200 rpm으로 진탕배양 하였고, 특별한 언급이 없는 한 2주에 한번씩 5 mL를 취하여 새로운 배양액에 주입하여 계대배양 하였다.
- Streptanthus 조직배양 세포에서, D-glucose와 D-fructose는 같은 능동 수송계를 통해서 세포 내로 수송되는지 또는 각기 다른 수송계를 소유하는지를 알기 위해서 단당류의 능동 수송 kinetic을 분석하였다 (Table 1). 결과는 aldose형태인 D-glucose 와 kotose형태인 D-fructose는 각기 다른 고유한 능동 수송계를 소유하고 있음을 알 수 있었다.
- Komor로부터 제공받은 것으로 사용하였다. 능동 수송 실험은 0.2 μCi의 14C-U-sucrose, 0.14 μCi의 14c-D-glucose, 0.2 μCi의 14C-L-glucose와 0.2 μCi의 14c-mannose에다 실험 목적에 따라 표지 되지 않은 각각의 당류를 다양한 농도로 (0.05 mM~l mM) 잘 희석한 다음 세포에다 직접 첨가함으로서 측정하였다 (Cho 1987). 30초 간격으로 1 mL의 시료를 꺼내서 즉시 여과시키고, 각 시료를 냉각된 같은 당류로 씻은 다음 세포 내로 수송된 당류를 측정하였다.
- 당류 운반자의 kinetic을 알기 위해서 Km값과 Vmax의 값을 즉정하였다. Km과 Vmax의 값은 당류 농도에 의존하는 능동 수송 속도를 측정하여 결정하였다.
- 유조직 세포로 분화하는 동안 어느 시기에 이당류 능동 수송계가 유도되는지 또는 어느 시점까지 두 종류의 당류 수송계가 서로 공존하는지를 알고자 하였다. 세포의 자유 공간에 있는 산성 invertase의 활성을 막기 위해서 유조직 원형질체와 사부 원형질체 및 사부세포 를 이용하여 당류들의 능동 수송을 측정하였다 (Table 2). 유조직 세포에서 사부로 발달되는 동안에서, 초기에는 유조직 원형질체처럼 사부 원형질체가 둥근 모양이나 사부가 완전히 발달되면 사부 원형질체보다는 사부세포로 길게 존재하여 사부세포에 분리가 더 간결하였다 (Cho, 1998).
- 액체배양은 100 mL 삼각 플라스크를 이용하여 25℃ 암소에서 200 rpm으로 진탕배양 하였고, 특별한 언급이 없는 한 2주에 한번씩 5 mL를 취하여 새로운 배양액에 주입하여 계대배양 하였다. 유도된 캘러스 5 g을 MS 기본배지에다 2 mg/L의 2,4-D, 0.1 mg/L NAA와 1 mg/L의 kinetin이 함유된 사부분화 액체배지에서 사부를 유도시켰다.
- 그렇다면, 유조직 세포를 사부 유도 배지로 옮긴 후 어느 시점에서 단당류 능동 수송계가 사라지고, 이당류 능동 수송계가 유도되는 것일까? 또는 사부의 발달과 함께 이당류 능동 수송계가 유도되어 어느 시점까지는 단당류 능동 수송계와 이당류 능동 수송계가 동시에 공존하다가 사부가 완전히 분화되고 난 후에 단당류 능동 수송계는 그때에 사 라지는 것일까? 또는 같은 단당류 능동 수송계가 어느 시점에 이당류 능동 수송계로 전환되는 것일까? 이러한 질문의 해답을 얻기 위해서는 원형질체를 이용하여 산성 invertase로 기인된 설탕이 가수분해 되어 환원당으로 능동 수송되는 것을 차단한다면, 추적이 가능할 것이다. 유조직을 사부 분화배지로 계대배양 하기 전과 계대배양 후 초기에 사부의 분화 동안과 사부의 발달 시기에 원형질체를 분리하여 단당류와 이당류의 능동 수송계를 추적하여, 사부분화 단계에서 단당류의 능동 수송계와 이당류 능동 수송계를 분석하여, 사부분화과정에서 새로운 당류의 수송계의 합성 시기를 알고자 하였다.
- 조직배양 세포 1 g을 소독된 0.9 M sorbitol과 mannitol로 1시간 동안 전 처리한 다음 해리용 배지 [0.9 M sorbitol과 mannitol, 2 mM CaCh, 0.5 mg/mL BSA, 5 mM 인산나트륨 완충액, (pH 6.0)] 10 mg] 0.2% macerase (Cal Biochem), 0.03% cellulase (Cooper), 0.02% pectinase (Cooper), 0.02% rohadmet (Rdehm GmbH)와 proteinase inhibitor로 2 pg/mL가 들어있는 배지에서 3시간 해리시킨 다음 200 μm 나일론 망을 통과시켜서 망 위에 있는 해리 되지 않은 세포들을 제거하였다. 망을 통과한 세포는 다시 70 μm 나일론 망을 통과시킨 다음 효소가 제거된 해리용 용액으로 3회 세척하였다.
- Km과 Vmax의 값은 당류 농도에 의존하는 능동 수송 속도를 측정하여 결정하였다. 측정 방법은 위에 설명한 당류의 능동 수송 속도 측정방법과 마찬가지로 당류를 준비하여 능동 수송을 측정하였다. 측정에 사용한 농도 범위는 0.
대상 데이터
- 0) 10 mL에 현탁한 다음 25℃에서 안정화 시켜 주었다. 사용한 방사선 동위원소은 독일 바이로이트 대학 Dr. Prof. Komor로부터 제공받은 것으로 사용하였다. 능동 수송 실험은 0.
데이터처리
- 05 mM~l mM이다. 능동 수송 속도를 측정한 결과로부터 double-reciprocal plot에서 Km과 Vmax의 값을 구하였다 (Cho 1987).
성능/효과
- 대개의 생명체는 glucose을 fiuctose보다는 우선적으로 선호하는 경향이 있는 것으로 알고 있다. D-glucose와 D-manmose의 Km 값은 각각 0.28 mM 과 0.44 mM로 매우 유사한 친화도를 나타내어서 두 화합물은 같은 능동 수송계를 통하여 생체 내로 수송될 것으로 추정되었다. 살아 있는 생명체, 특히 고등 생체는, 자연 상태에서 주로 D-form의 당류를 선호한다는 것은 이미 알려져 있다.
- 그러나 Streptanthus 조직배양세포는 L-form의 glucose도 그들의 고유한 수송계를 소유하고 있었다. L-form glucose의 고유 능동 수송계에 대한 친화도는 Km값이 8.33 mM로 D-form glucose의 당류 수송계보다는 수송계에 대한 친화도가 매우 낮았으나, 같은 D-form의 당류인 fhictose보다는 수송계에 대한 친화도가 훨씬 더 높음을 알 수 있었다. 그러나 왜 생체가 L-form의 당류를 생체 내로 수송하는지는 의문이고, L-form의 대사 과정에 대한 생화학적인 회로는 아직 설명되지 않은 것으로 알고 있다.
- 같은 단당류임에도 불구하고, glucose보다는 fhictose의 능동 수송이 각각의 능동 수송계에 대하여 매우 낮은 친화도를 지님을 알 수 있었다. 대개의 생명체는 glucose을 fiuctose보다는 우선적으로 선호하는 경향이 있는 것으로 알고 있다.
- Streptanthus 조직배양 세포에서, D-glucose와 D-fructose는 같은 능동 수송계를 통해서 세포 내로 수송되는지 또는 각기 다른 수송계를 소유하는지를 알기 위해서 단당류의 능동 수송 kinetic을 분석하였다 (Table 1). 결과는 aldose형태인 D-glucose 와 kotose형태인 D-fructose는 각기 다른 고유한 능동 수송계를 소유하고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 사부가 유도된 후 사부 원형질체와 유조직 원형질체를 순수 분리하여 단당류와 이당류의 능동 수송계를 분석한 결과에서는 유조직 원형질체에는 단당류 능동 수송계가 존재하고, 사부 원형질체는 단당류 능동 수송계는 사라지고, sucrose 능동 수송계가 새로이 유도되었다(Cho 1998). 그렇다면, 유조직 세포를 사부 유도 배지로 옮긴 후 어느 시점에서 단당류 능동 수송계가 사라지고, 이당류 능동 수송계가 유도되는 것일까? 또는 사부의 발달과 함께 이당류 능동 수송계가 유도되어 어느 시점까지는 단당류 능동 수송계와 이당류 능동 수송계가 동시에 공존하다가 사부가 완전히 분화되고 난 후에 단당류 능동 수송계는 그때에 사 라지는 것일까? 또는 같은 단당류 능동 수송계가 어느 시점에 이당류 능동 수송계로 전환되는 것일까? 이러한 질문의 해답을 얻기 위해서는 원형질체를 이용하여 산성 invertase로 기인된 설탕이 가수분해 되어 환원당으로 능동 수송되는 것을 차단한다면, 추적이 가능할 것이다. 유조직을 사부 분화배지로 계대배양 하기 전과 계대배양 후 초기에 사부의 분화 동안과 사부의 발달 시기에 원형질체를 분리하여 단당류와 이당류의 능동 수송계를 추적하여, 사부분화 단계에서 단당류의 능동 수송계와 이당류 능동 수송계를 분석하여, 사부분화과정에서 새로운 당류의 수송계의 합성 시기를 알고자 하였다.
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