목적: 생체 내로 이식한 신경 줄기 세포의 이동과 증식을 비침습적으로 추적하는 것은 기초와 임상에서 중요한 것으로 알려져 있다. 신경줄기 세포주(F3)를 생체내로 이식 후, 비침습적으로 추적하기 위해 사람의 hNIS 유전자를 F3 세포에 안정적으로 형질 도입하여 세포 배양 시간 및 조건에 따른 F3-NIS 세포 내에서 hNIS 유전자의 발현 변화를 알아보았다. 방법: HB1.F3는 태아 종뇌에서 신경 줄기 세포를 분리한 후 v-myc유전자로 불멸화한 신경줄기 세포주이다. CMV프로모터 조절 받도록 hNIS와 하이그로마이신 저항 유전자를 IRES(internal ribosomal entry site)를 이용하여 재조합하였다(pIRES-NIS/Hyg). pIRES-NIS/Hyg를 리포좀을 이용하여 HB1.F3 세포를 형질전환 하였다. 탈메틸화시약(5-Azacytidine)와 히스톤탈아실화효소저해제(trichostatin; TSA)을 세포주에 24시간 처리한 후, hNIS 발현을 I-125 섭취율과 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR)으고 측정하였다. 결과: pIRES-NIS/Hyg 재조합 유전자를 HB1.F3에 형질도입 후, 2주 동안 하이그로마이신 B를 처리해 hNIS 유전자를 안정적으로 발현하는 HB1.F3 세포를 얻었다(F3-NIS III). I-125 섭취율은 HB1.F3에 비해 F3-NIS가 12.9배 높았으며, $KClO_4$를 처리 했을 때 F3-NIS의 I-125 섭취가 완전히 저해되었다. F3-NIS를 계대 배양하면 hNIS 유전자의 발현이 1.9배 까지 서서히 감소하였다. 5-Azacytidine과 TSA를 F3-NIS에 24시간 처리한 결과, I-125 섭취율이 5-Azacytidine과 TSA 농도에 따라 증가되었다. 또한 같은 방법으로 F3-NIS 세포에 5-Azacytidine과 TSA를 처리한 후 hNIS 프라이머로 RT-PCR을 수행한 결과 hNIS mRNA가 농도에 따라 증가 되었다. 결론: hNIS 유전자 이입된 F3 세포는 계대 배양하는 동안 생물학적인 특성이 변화되는 것으로 관찰되었으며, 이는 줄기 세포에 이입된 외래 유전자의 발현이 DNA 탈메틸화나 히스혼아세틸화를 통한 에피지네틱 조율 때문이라고 생각한다.
목적: 생체 내로 이식한 신경 줄기 세포의 이동과 증식을 비침습적으로 추적하는 것은 기초와 임상에서 중요한 것으로 알려져 있다. 신경줄기 세포주(F3)를 생체내로 이식 후, 비침습적으로 추적하기 위해 사람의 hNIS 유전자를 F3 세포에 안정적으로 형질 도입하여 세포 배양 시간 및 조건에 따른 F3-NIS 세포 내에서 hNIS 유전자의 발현 변화를 알아보았다. 방법: HB1.F3는 태아 종뇌에서 신경 줄기 세포를 분리한 후 v-myc유전자로 불멸화한 신경줄기 세포주이다. CMV 프로모터 조절 받도록 hNIS와 하이그로마이신 저항 유전자를 IRES(internal ribosomal entry site)를 이용하여 재조합하였다(pIRES-NIS/Hyg). pIRES-NIS/Hyg를 리포좀을 이용하여 HB1.F3 세포를 형질전환 하였다. 탈메틸화시약(5-Azacytidine)와 히스톤탈아실화효소저해제(trichostatin; TSA)을 세포주에 24시간 처리한 후, hNIS 발현을 I-125 섭취율과 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR)으고 측정하였다. 결과: pIRES-NIS/Hyg 재조합 유전자를 HB1.F3에 형질도입 후, 2주 동안 하이그로마이신 B를 처리해 hNIS 유전자를 안정적으로 발현하는 HB1.F3 세포를 얻었다(F3-NIS III). I-125 섭취율은 HB1.F3에 비해 F3-NIS가 12.9배 높았으며, $KClO_4$를 처리 했을 때 F3-NIS의 I-125 섭취가 완전히 저해되었다. F3-NIS를 계대 배양하면 hNIS 유전자의 발현이 1.9배 까지 서서히 감소하였다. 5-Azacytidine과 TSA를 F3-NIS에 24시간 처리한 결과, I-125 섭취율이 5-Azacytidine과 TSA 농도에 따라 증가되었다. 또한 같은 방법으로 F3-NIS 세포에 5-Azacytidine과 TSA를 처리한 후 hNIS 프라이머로 RT-PCR을 수행한 결과 hNIS mRNA가 농도에 따라 증가 되었다. 결론: hNIS 유전자 이입된 F3 세포는 계대 배양하는 동안 생물학적인 특성이 변화되는 것으로 관찰되었으며, 이는 줄기 세포에 이입된 외래 유전자의 발현이 DNA 탈메틸화나 히스혼아세틸화를 통한 에피지네틱 조율 때문이라고 생각한다.
Purpose: The ability to noninvasively track the migration of neural progenitor cells would have significant clinical and research implications. We generated stably transfected F3 human neural progenitor cells with human sodium/iodide symporter (hNIS) for noninvasively tracking F3. In this study, the...
Purpose: The ability to noninvasively track the migration of neural progenitor cells would have significant clinical and research implications. We generated stably transfected F3 human neural progenitor cells with human sodium/iodide symporter (hNIS) for noninvasively tracking F3. In this study, the expression patterns of hNIS gene in F3-NIS were examined according to the cultured time and the epigenetic modulation. Materials and Methods: F3 human neural stem cells had been obtained from Dr. Seung U. Kim (Ajou University, Suwon, Korea). hNIS and hygromycin resistance gene were linked with IRES (Internal Ribosome Entry Site) under control of CMV promoter. This construct was transfected to F3 with Liposome. To investigate the restoration of hNIS gene expression in F3-NIS, cells were treated with demethylating agent (5-Azacytidine) and Histone deacetylase inhibitor (Trichostatin A: TSA). The expression of hNIS was measured by I-125 uptake assay and RT-PCR analysis. Results: The iodide uptake of the F3-NIS was higher 12.86 times than F3 cell line. According to the cell passage number, hNIS expression in F3-NIS gradually diminished. After treatment of 5-Azacytidine and TSA with serial doses (up to $20{\mu}M$, up to 62.5nM, respectively) for 24 hours, I-125 uptake and mRNA of hNIS in F3-NIS were increased. Conclusion: These results suggest that hNIS transfected F3 might undergo a change in its biological characters by cell passage. Therefore, the gene ex[ressopm of exogenous gene transferred human stem cell might be affected to the epigenetic modulation such as promoter methylation and Histone deacetylation and to the cell culture conditions.
Purpose: The ability to noninvasively track the migration of neural progenitor cells would have significant clinical and research implications. We generated stably transfected F3 human neural progenitor cells with human sodium/iodide symporter (hNIS) for noninvasively tracking F3. In this study, the expression patterns of hNIS gene in F3-NIS were examined according to the cultured time and the epigenetic modulation. Materials and Methods: F3 human neural stem cells had been obtained from Dr. Seung U. Kim (Ajou University, Suwon, Korea). hNIS and hygromycin resistance gene were linked with IRES (Internal Ribosome Entry Site) under control of CMV promoter. This construct was transfected to F3 with Liposome. To investigate the restoration of hNIS gene expression in F3-NIS, cells were treated with demethylating agent (5-Azacytidine) and Histone deacetylase inhibitor (Trichostatin A: TSA). The expression of hNIS was measured by I-125 uptake assay and RT-PCR analysis. Results: The iodide uptake of the F3-NIS was higher 12.86 times than F3 cell line. According to the cell passage number, hNIS expression in F3-NIS gradually diminished. After treatment of 5-Azacytidine and TSA with serial doses (up to $20{\mu}M$, up to 62.5nM, respectively) for 24 hours, I-125 uptake and mRNA of hNIS in F3-NIS were increased. Conclusion: These results suggest that hNIS transfected F3 might undergo a change in its biological characters by cell passage. Therefore, the gene ex[ressopm of exogenous gene transferred human stem cell might be affected to the epigenetic modulation such as promoter methylation and Histone deacetylation and to the cell culture conditions.
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제안 방법
0.5% 소혈청 알부민과 0.2의 방사성옥소(1-125) 그리고 10 J1M의 Nal가 들어있는 HBSS 에 50 J1M KC1CU를 첨가하여 30분 동안 배양 한 후 방사성옥소 섭취율을 측정하여 이입 hNIS의작용이 저해되는지 보았다.
5-Azacytidine과 TSA를 처리 하고 24시간 배양한 우물에 0.5% 소혈청 알부민과 0.2 uCi/ml의 방사성옥소(1-125) 그리고 10 uM의 Nal가 들어 있는 Hanks balanced salt solution (HBSS)에 30분 동안 배양하였다. 차가운 HBSS로 두 번 씻어낸 후 0.
HB1.F3 세포에 pIRES-hNIS/HYG 벡터를 리포좀을 이용해 형질 도입하여 하이그로마이신 B로 2주간 선별하여 3개의 콜로니를 얻었다. 이 콜로니 세포는 HBLF3세포(34.
TSA로 히스톤탈아세틸화를 저해하였더니 세배이상 GFP 발현이 증가하였기 때문이다. GFP 대신에 이 연구에서 사용한 hNIS는 생물학적 활성을 측정하는데 막 이온 수송체인 나트륨/옥소 수송체를 사용하여 옥소의 세포내 이입을 조사한다. 따라서 이종 형광단백질인 GFP의 세배 증가와 hNIS 활성의 36배 증가가 단순 비교 대상이라 할 수는 없지만, 분자영상을 얻으려할 때는 hNIS의 신호가 훨씬 유리할 것이라 추정된다.
Superscript!! RNase H#역전사효소 (GibcoBRL Co., USA)를 사용해 cDNA를 만들었다. 이 cDNA를 주형으로 삼아 hNIS 프라이머로 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행 한 후 1.
5 [1M까지 처리하였다. TSA는 0,25, 37.5, 50, 62.5 nM로 처리하였다. 각 시약을 처리한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO, 세포배양기에서 배양하였다
F3)에 hNIS 유전자를 도입하고 계대 배양할 때 방사성 옥소 섭취가 여러번 계대되면서 방사성옥소 섭취율이 감소하는 이유와 감소를 복구할 방법을 조사하였다. hNIS 유전자를 도입한 신경줄기세포의 hNIS 유전자 발현에 DNA 메틸화와 히스톤 아세틸화를 통하여 에피지네틱 조율 기전이 작동한다 가정하고 탈메틸화 약품인 5-Azacytidine과 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제인 Trichostatin A (TSA)를 처리하였을 때, hNIS 도입유전자 발현 양상을 조사하였다.
pIRES 버]터 (Clontech Co., USA)의 MCS A 부분에 제한효소인 EcoRI과 Xhol을 이용하여 hNIS 유전자를 삽입하고, MCS B부분에 하이그로마이신 저항 유전자를 Xbal 과 Notl 으로 삽입하여 pIRES-hNIS/HYG 벡터를 제작하였다.
5% agarose gel에서 전기영동한 후 브롬화에티듐(Et Br)으로 염색해 PCR 산물을 확인하였다. 양성 대조군으로는 베타액틴 프라이머로 PCR을 수행하였다.
, USA)를 사용해 cDNA를 만들었다. 이 cDNA를 주형으로 삼아 hNIS 프라이머로 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행 한 후 1.5% agarose gel에서 전기영동한 후 브롬화에티듐(Et Br)으로 염색해 PCR 산물을 확인하였다. 양성 대조군으로는 베타액틴 프라이머로 PCR을 수행하였다.
이 실험은 5-Azacytidine과 TSA 각각 5번씩 처리하여 수행하였다.
이 연구에서는 신경줄기세포 이식 후 체내분포를 추적하기 위해 신경 줄기세포(HB1.F3)에 hNIS 유전자를 도입하고 계대 배양할 때 방사성 옥소 섭취가 여러번 계대되면서 방사성옥소 섭취율이 감소하는 이유와 감소를 복구할 방법을 조사하였다. hNIS 유전자를 도입한 신경줄기세포의 hNIS 유전자 발현에 DNA 메틸화와 히스톤 아세틸화를 통하여 에피지네틱 조율 기전이 작동한다 가정하고 탈메틸화 약품인 5-Azacytidine과 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제인 Trichostatin A (TSA)를 처리하였을 때, hNIS 도입유전자 발현 양상을 조사하였다.
2 uCi/ml의 방사성옥소(1-125) 그리고 10 uM의 Nal가 들어 있는 Hanks balanced salt solution (HBSS)에 30분 동안 배양하였다. 차가운 HBSS로 두 번 씻어낸 후 0.2% SDS 용액으로 세포를 떼어내어 감마 카운터로 방사능을 측정하고 세포의 단백질 양은 BCA 단백질 정량 키트(Bio-RAD Co., USA)로 정량하였다.
대상 데이터
21,24) 이 연구에서 우리는 유전자를 이입한 후 8번 계대한, 유전자이입전 신경줄기세포 (F3) 에 비해 2배정도의 hNIS 활성 즉 방사성옥소섭취율을 보이는 세포 (F3-NISHI)를 실험에 사용하였다. 8회 보다 더 많은 횟수 계대하면 혹시 DNA메틸화가 진전되어 탈메틸화가 이입유전자 발현에 더 큰 효과를 보일지 모른다.
24 우물배양용기의 한 우물에 8-10번 계대배양한 F3NISIU 세포를 lx lb 개/우물로 24시간 동안 배양하였다. 새로운 배양액으로 교체한 후5-Azacytidine (Sigma Co.
신경줄기세포로 HB1.F3 세포를 아주대학교 김승업 박사께 분양 받아 사용하였다. 이 세포는 15 주째 태아 종뇌 뇌실부분에서 분리하여 v-myc으로 불멸화한 세포주이다.
, US A) 를 200 ㎍/ml 처리하여 pIRES-hNIS/HYG 벡터를 도입한 HB1.F3세포를 선별하였다. 선별세포주를 F3-NIS 세포주라 하였다.
성능/효과
100 nM의 TSA와 0, 2.5, 5, 10, 20 μM의 5-Azacytidine을 함께 F3-NISUI 세포에 24시간 동안 처리 후에는 5-Azacytidine 처리 농도에 따라 처리 하지 않은 군(685.0±14.2 pmole/mg 단백질) 에비해 1.01 (725.8+1.6 pmole/mg 단백질), 1.05 (727.9±42.5 pmole/mg 단백질), 1.10 (766.9+13.0 pmole/mg 단백질), 1.12 (794.0±19.5 pmole/mg 단백질) 배 씩 방사성옥소 섭취율이 증가하였다(Fig. 4).
생체 내에 이식한 줄기세포 추적을 위한 분자영상법에 자기 공명 영상(MRI), 핵의학 영상, 광학 영상이 있다.3) MRI는 해상력이 좋고 같은 개체 내에서 반복적으로 영상을 획득할 수 있으나 다양한 분자 리포터 유전자가 없다. 광학 영상은 싸고 반복 영상이 쉽지만 쥐나 랫트 같은 작은 동물에서만 영상획득이 가능하다.
F3-NIS HI 세포에 5-Azacytidine을 처리하면 5-Azacytidine의 농도가 40 J1M일 때 5-Azacytidine 을 처리하지 않은 F3-NISHI 세포(56.1±2.7 pmole/mg 단백질)에 비해 방사성옥소를 최대 1.8 (99.5±6.5 pmole/mg 단백질)배 더 많이 섭취되었으며, NIS의 억제제인 KC1O4를 처리하면 방사성옥소 섭취율이 완전히 저해되었다(Fig. 3a).
F3-NIS1 세포에 TSA를 처리하면 TSA의 농도가 62.5 nM일 때 TSA처리하지 않은 F3-NISUI 세포(47.8±3.5 pmole/mg 단백질)에 비해 최대 36.2 (1, 727.7±85.8 pmole/mg 단백질)배 더 많이 섭취되었으며, NIS의 억제제인 KC1O4를 처리하면 방사성옥소 섭취율이 완전히 저해되었다 (Fig. 3b). TSA (62.
세포가 처음에는 HB1.F3세포에 비해 최대 12.9배이었던 방사성옥소 섭취율이 계대할수록 감소하여 8번째 계대 때에는 1.9배로 감소하였다(Fig. 2).
Fig. 5와 같은 방법으로 각각 5-Azacytidine과 TSA를 처리한 F3-NISBI 세포에서 총 RNA를 분리 한 후 hNIS와 베타액틴 프라이머로 수행한 RT-PCR 결과 처리한 시약의 농도에 따라 hNIS mRNA의 양이 5-Azacytidine은 1.9배, TSA는 1.9배까지 각각 증가하였다(Fig. 5).
또는 반대로 계대 횟수가 적었다면 DNA 탈메틸화의 효과가 달리(더 크거]) 나타났을 수도 있다. 그러나 이 가상 실험 결과는 추측하기 어려우며 이 연구결과로는 오로지 hNIS 활성이 거의 사라진 그러나 hNIS가 신경줄기세포에 아직 남아있는 침 묵유도된 신경 줄기 세포에서 히스톤탈아세틸화효소저해로 hNIS 활성을 다시 충분히 끌어올릴 수 있었음을 알 수 있다.
GFP 대신에 이 연구에서 사용한 hNIS는 생물학적 활성을 측정하는데 막 이온 수송체인 나트륨/옥소 수송체를 사용하여 옥소의 세포내 이입을 조사한다. 따라서 이종 형광단백질인 GFP의 세배 증가와 hNIS 활성의 36배 증가가 단순 비교 대상이라 할 수는 없지만, 분자영상을 얻으려할 때는 hNIS의 신호가 훨씬 유리할 것이라 추정된다.
이 이입 hNIS 유전자는 발현단계에서주로 DNA 메틸화와 히스톤탈아세틸화에 의해 침묵유도된 것이라생각한다. 우리는 이 연구에서 신경줄기세포에 이입한 hNIS 유전자가 계대도중 발현되지 않는데 DNA 메틸화와 히스톤탈아세틸화 저해로 유전자 발현을 복구하였으므로 침묵유도에 위의 두 가지 기전이 관여함을 밝혔다. 다만 양적으로 보아서 계대도중 침묵유도되는 데에 DNA 메틸화보다는 히스톤탈아세틸화가 더 크게 기여하는 것 같다.
이 연구에서 히스톤탈아세틸화저 해제와 DNA탈메틸화 약제를 처리하면 신경줄기세포에 이입한 유전자를 발현하도록 조율할 수 있다는 사실을 밝혔다. 생체 내에서 이런 조율이 작동할지 밝히는 연구가 이어져야 한다.
후속연구
이 연구에서는 DNA 탈메틸화와 히스톤탈아세틸화 저해의 상승작용을 입증하지 못하였다. 100 nM의 TSA와 0-20 μM의 5-Azacytidine을 F3-NISDI세포에 24시간 동안 처리 후 측정한 방사성옥소 섭취율이 5-Azacytidine 처리 농도에 따라 1.
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