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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 구제역 바이러스의 구조단백질인 VP1 단백질을 식물체에서 생산함으로써, 종전까지 숙주로 사용하고 있는 대장균 또는 효모에서 보다 생산성 및 유용성을 증가시키며, 백신 개발에 있어 재료의 안전성을 높이고 또한 edible vaccine 으로의 가능성을 타진해보고자 시도되었다. VP1 의 고 유단백질을 생산할 유전자를, 대만에서 발생된 FMDVTaiwan O type (GenBank accession no.
- FMDV는 동물에서 구제역을 일으키는 병원체이며, VP1은 이 바이러스의 주요 capsid 단백질이므로 구제역의 진단과 단백질 백신의 개발에 가장 많이 사용되는 재료 중 하나이다. 본 연구는 FMDV taiwan O형과 베트남에서 분리된 FMDV의 VP1 sequence를 기반으로 식물에서 VP1 유전자의 발현을 위하여 633 bp의 VP1 유전자로 재편집하였으며, 이를 long-nucleotide를 사용한 multiple fragment extension 방법을 사용하여 인공적인 DNA 단편을 합성하였다. 또한 새로운 식물형질전환 벡터로 pBI121과 pCAMBIA1390의 장점을 수용하여, hygromycin 저항성과 CaMV 35S promotor 를 포함하는 pCAMBIA II를 제작하였다.
제안 방법
- 본 연구를 통하여 새로이 제작된 범용 식물 형질 전환용 pCAMBIA II vector는 target gene의 삽입을 위한 유전자 재조합에서 5' 말단에., 3' 말단에 SacI의 제한효소를 사용하여 간단히 치환되게 하였으며, 이를 위한 대장균에서의 선별은 kanamycin을 사용하고, 형질 전환된 식물체에서의 선별은 T-border 내부에 존재하는 hygromycin 저항성을 이용하게 하였다. 또한 본래 존재하는 유전자와 치환된 target genee CaMV 35S promoter로 발현이 조절되게 하였다.
- 5 U Taq polymerase로 구성되었다.GFP와 VP1 유전자의 삽입 여부를 각각 확인하기 위하여, 유전자 증폭을 위해 사용했던 동일한 primer를 사용하였다. 사용된 primer는 GFP- forward- BamHI 5'-GGATCCCCG GGTGGTCAGTCCCTTATGAGTAAAGGAGAAGAA-3', GFP- reverse- SacI 5'-GAGCTCTTTGTATAGTTCATCCAT GCCATGTC-3', VP1- forward-BamHI 5'-GGATCCCCGG GTGGTCAGTCCCTTATGACCACCTCTGCGGGT-3, , VP1 -reverse-SacI (5'-GAGCTCCTGTTTTGCGGGTGCCACAATCCTCT-3'이며, PCR 조건은 GFP의 경우 94℃ 에서 3 분간 변성 후 denaturatione 94℃에서 30초, annealinge 58 ℃ 에서 30초, extensione 72℃ 에서 30초로 하여 30 회수 행하고 충분한 PCR 산 물을 얻기 위해 마지막에 72℃ 에서 5 분간 extension을 수행하였다.
- Hygromycin 저항성 유전자를 이용하기 위해서 pCAMBIA1390 벡터에 제한 효소 HindⅢ, EcoRI를 사용하여 유전자 재조합을 수행하였고, 이를 각각 pCAMBIA II-KP7, pCAMBIA n-GFP 라 명명하였다 (Figure 3, 4). 이 식물 형질 전환용 벡터는 5' 말단의l, 3' 말단의 제한효소로 수식된 어떠한 새로운 유전자도 손쉽게 유전자의 재조합이 가능하게 하였다.
- VP1 유전자의 검출을 위한 PCR 조건은 나머지 조건은 동일하게 하고, annealinge 63 ℃ 에서 30초로 하였다. PCR 수행 후 산물을 1.5% agarose gel에 전기영동 하여 확인하였다. 대조군으로, 대장균에 있는 VP1과 GFP 유전자를 갖고 있는 plasmid DNA> 동일한 primer 를 사용해 동시에 PCR을 수행하여 전체 길이가 삽입된 PCR product band를 확인하였으며, 각기 적절한 제한효소 절단으로 올바른 PCR product가 형성되었음을 재확인하였다.
- 이를 T-vector인 pBX에 클론화하여 pBX-VPl,pBX-GFP plasmid DNA를 제작하였다. PCR 조성은 15 mM MgCh, 100 pmol primers, 2.5 mM dNTPs 그리고 1 x PCR buffer (100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 500 mM KC1, 15 mM MgCl2, 1% Triton X-100)의 혼합액 98 ul를 첨가하고 94 ℃ 에서 3분 동안 denaturation을 하고, 5 unit의 Taq polymerase (GeneClone Co., Korea)를 첨가한 후 94 ℃ 30초 63 ℃ 30초, 72℃ 1 분을 30회 수행하고, 마지막으로 72℃ 에서 5 분간 final elongation을 주어 증폭하였다. 모든 PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, U.
- 형광 시약은 2x SYBR Green supermix (Bio-Rad)를 사용하였으며, Bio-Rad사의 Real-Time MY-IQ machine을 사용하였다. PCR의 조건은 94 ℃ 에서 5분간 변성 후 denaturatione 94℃ 에서 30초, annealinge 63℃ 에서 30초 extensione 72℃ 에서 30초로 하여 35 회수행하였고, Real-Time PCR의 조건은 excitatione 490nm, emissione 530nm, exposure timee 500 msec, 필터 당측정시간은 3초로 하였으며, Ct (Threshold cycle) value는 3-12 cycle에서 보여준 형광강도의 표준편차에 10 배에 해당되는 형광강도를 나타내는 cycle로 결정하였다. 또한 PCR 과정의 종료 후 melting point analysis는 55 ℃ 에서 시작하여 10초당 0.
- VP1 의 고 유단백질을 생산할 유전자를, 대만에서 발생된 FMDVTaiwan O type (GenBank accession no. AF308157) 및 베트남 현지에서 확보한 strain Vietnam의 VP1 염기서열 등을 기초로 하여, 다양한 FMDV strain들에 대한 적용 가능성을 높이기 위하여 재편집을 수행하였고, 담배의 codon usage도 고려하여 인공적으로 합성하였다. 또한, 발현을 보다 강화시키기 위하여 CaMV 35S promotor를 가지고, 식물체의 신속한 선별을 위해, hygromycin을 selection marker로 사용하는 새로운 식물 형질 전환용 벡터를 제작하여 사용하였다.
- 조성으로 하였다. 각 2 ug의 total RNA를 사용하였으며, 1X RT buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 30 mM KC1, 8 mM MgC12, 10 mM DTT), 150 unit reverse transcriptase (MMLV), 50 pmole VP1- 또는 GEP-reverse primer, 4 unit RNase inhibitor, 2.5 mM dNTP를 첨가하고, 45℃, 45분의 RT-reaction에 이어 99℃, 5분으로 불활화하였다. 총 반응액의 양은 20 ul으로, GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, U.
- 제작된 벡터와 VP1 유전자 및 GFP 유전자를 사용하여 담배를 형질전환시켰고, 각각의 형질전환 식물체 내에서 전체 길이의 target gene (VP1) 의 성공적인 삽입을 확인하였다. 각 유전자의 발현은 RT-PCR 과 Real-Time PCR의 결과로 측정하였으며, VP1 유전자의 전사가 담배 내에서 이루어졌음과 고효율의 전사체를 만드는 형질전환체 VPl-4를 선별하였다.
- leaf disk transformation 방법에 의해 담배 SR1 품종에 감염 시 켰다. 감염 시 킨 leaf disk에서 hygromycin 내성(5 mg/L)의 callus들을 선별하였으며, 각각 재분화된 clone으로써 고유번호를 부여하고, 각 clone 중 일부의 잎을 수거하여 genomic DNA를 추출하였다. 형질전환 담배의 genomic DNA 내에 삽입된 VP1 또는 GFP 유전자를 확인하기 위하여 GEP와 VP1 각기 특이적 primer를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다.
- 를 가지고 있으며, kanamycin저항성 유전자를 가지고 있다. 그러나 kanamycin 저항성 유전자는 대장균 및 식물의 형질전환체를 선별하는 데 있어 hygromycin에 비하여 유용하지 않기 때문에, 형질전환체의 선별을 보다 신속하고 정확하게 하기 위하여 hygromycin 저항성 유전자 및 CaMV 35S promoter# 갖는 새로운 식물 형질 전환용 벡터를 제작하였다. 먼저, pBI121 벡터에 5' 말단의 BamHL, 3, 말단의 Sad 제한효소로 수식된 각 VP1 유전자 및 GFP 유전자를 삽입하였고, CaMV 35S promoter와 NOS poly terminator를 포함하는 식물형질전환용 벡터를 제작하였으며, 이를 pBI-^7, pBI-GFF 라 명명하였다 (Figure 2).
- )을사용하였으며, 형질전환 vector인 pBI121에 삽입하기 위한 VP1 유전자의 길이는 총 660 bp가 되었다. 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자 (Chen 2003; Newell 2003; Reisen 2003)를 증폭하기 위하여는 pQE-GFP plasmid DNA를 주형으로 사용하였으며, 상기의 방법으로 PCR, 클론 화 및 염기서열 분석을 수행하였다 (Table 1).
- 담배의 염색체 내에 도입이 확인된 GFP와 VP1 유전자가 식물체 내에서 정상적으로 발현되는지의 여부를 확인하기 위하여, GFP 형질전환체에 대하여는 형광현미경에 의한 조직의 검색 (Olympus fluorescence Microscope BX-50, DP-70 Fluorescence detector system), 그리고 VP1 및 GFP 형질전환체에 대하여 SDS-PAGE 및 ELISA 등을 수행하였다. 먼저 GFP 형질전환체에 대한 형광현미경 검색에서는 녹색 형광을 발하는 조직을 가진 약간의 형질전환체가 발견되었으나, 대조군 (Nicotiana tabacum SR1)과 분명한 차이를 보이지는 아니하였으며, 이 형질전환체의 형광이 GFP 단백질에 의한 것인지 아닌지 확인할 수가 없었다.
- 5% agarose gel에 전기영동 하여 확인하였다. 대조군으로, 대장균에 있는 VP1과 GFP 유전자를 갖고 있는 plasmid DNA> 동일한 primer 를 사용해 동시에 PCR을 수행하여 전체 길이가 삽입된 PCR product band를 확인하였으며, 각기 적절한 제한효소 절단으로 올바른 PCR product가 형성되었음을 재확인하였다.
- 그 이유는 callus 또는 소량의 잎 수준의 적은 시료로써 ELISA 실험에 충분한 발현 단백질을 얻지 못함에 있었으며, 또한 항체의 특이도 도 대장균에서 생산된 항원을 사용하여 만든 항체이기에 식물체에서 발현된 동일 단백질을 동일한 특이도로 반응하지 못할 수도 있을 것으로 생각되었다 (자료 미제시).따라서 VP1 및 GFP 유전자의 담배 형질전환체에서 해당 mRNA의 발현 여부를 확인하기 위하여 RT-PCR과 Real-Time RT-PCR을 수행하였다. 동일한 형질전환체에서 추출된 의 cDNA (정상 RT-reaction을 template로 사용)와 chromosomal DNA (reverse transcriptase# 제외한 RT-reaction을 template로 사용)를 각기 사용한 RT-PCR의 결과에서, 전자의 경우 660 bp의 PCR product (VP1)가 생성되었으나 후자의 경우 형성되지 않았다.
- Sacl enzyme site를 포함하게 하였다. 또한 BamHI부터 VP1 또는 GFP 유전자의 개시코 돈 간은 각각 18, 24 mer 의 염기를 포함하도록 제작하였다. 이는 식물체 내에서 삽입시킨 유전자를 효과적으로 발현시키기 위한 것으로, PBI121vector의 CaMV 35S promotor와 GUS의 시작 코돈 간의 거리와 일치시킨 것이다.
- PCR의 조건은 94 ℃ 에서 5분간 변성 후 denaturatione 94℃ 에서 30초, annealinge 63℃ 에서 30초 extensione 72℃ 에서 30초로 하여 35 회수행하였고, Real-Time PCR의 조건은 excitatione 490nm, emissione 530nm, exposure timee 500 msec, 필터 당측정시간은 3초로 하였으며, Ct (Threshold cycle) value는 3-12 cycle에서 보여준 형광강도의 표준편차에 10 배에 해당되는 형광강도를 나타내는 cycle로 결정하였다. 또한 PCR 과정의 종료 후 melting point analysis는 55 ℃ 에서 시작하여 10초당 0.5℃씩 94℃까지 올리며 진행하였으며, 이로써 생성된 PCR product의 순수 도를 확인하였다.
- 또한 VP1 전사체의 정량을 위해 RT-PCR의 결과에서 발현이 인정된 다수의 형질전환체에 대한 Real-Time RT-PCR 을 수행하였다. 동일한 형질전환체에서 추출된 VP1의 cDNA(정상 RT-reaction-g- template로 사용)와 chromosomal DNA (reverse tramscriptase를 제외한 RT-reaction을 template로 사용)를 각기 사용한 Real-Time PCR에서 전자와 후자의 .
- 본 연구는 FMDV taiwan O형과 베트남에서 분리된 FMDV의 VP1 sequence를 기반으로 식물에서 VP1 유전자의 발현을 위하여 633 bp의 VP1 유전자로 재편집하였으며, 이를 long-nucleotide를 사용한 multiple fragment extension 방법을 사용하여 인공적인 DNA 단편을 합성하였다. 또한 새로운 식물형질전환 벡터로 pBI121과 pCAMBIA1390의 장점을 수용하여, hygromycin 저항성과 CaMV 35S promotor 를 포함하는 pCAMBIA II를 제작하였다. 제작된 벡터와 VP1 유전자 및 GFP 유전자를 사용하여 담배를 형질전환시켰고, 각각의 형질전환 식물체 내에서 전체 길이의 target gene (VP1) 의 성공적인 삽입을 확인하였다.
- 또한 이 VP1 유전자가 형질전환 vector인 pBI121에 쉽게 삽입, 발현될 수 있도록, 개시코 돈 상류의 18염기를 그대로 포함하는 oligonucleotide# 제작하여(VPIF-BamHI, VP1R-SacV) PCR을 수행함으로써 변형된 VP1의 PCR product를 만들었으며, 이를 T-vector인 pBX에 클론화하여 pBX-VPl,pBX-GFP plasmid DNA를 제작하였다. PCR 조성은 15 mM MgCh, 100 pmol primers, 2.
- AF308157) 및 베트남 현지에서 확보한 strain Vietnam의 VP1 염기서열 등을 기초로 하여, 다양한 FMDV strain들에 대한 적용 가능성을 높이기 위하여 재편집을 수행하였고, 담배의 codon usage도 고려하여 인공적으로 합성하였다. 또한, 발현을 보다 강화시키기 위하여 CaMV 35S promotor를 가지고, 식물체의 신속한 선별을 위해, hygromycin을 selection marker로 사용하는 새로운 식물 형질 전환용 벡터를 제작하여 사용하였다.
- 그러나 kanamycin 저항성 유전자는 대장균 및 식물의 형질전환체를 선별하는 데 있어 hygromycin에 비하여 유용하지 않기 때문에, 형질전환체의 선별을 보다 신속하고 정확하게 하기 위하여 hygromycin 저항성 유전자 및 CaMV 35S promoter# 갖는 새로운 식물 형질 전환용 벡터를 제작하였다. 먼저, pBI121 벡터에 5' 말단의 BamHL, 3, 말단의 Sad 제한효소로 수식된 각 VP1 유전자 및 GFP 유전자를 삽입하였고, CaMV 35S promoter와 NOS poly terminator를 포함하는 식물형질전환용 벡터를 제작하였으며, 이를 pBI-^7, pBI-GFF 라 명명하였다 (Figure 2).
- 본 연구에 사용된 VP1 유전자의 염기서열은 FMDV Taiwan O type의 VP1 유전자 및 strain Vietnam의 VP1 염기서열을 기본으로 편집한 것이며, 식물의 codon usage도 고려하여 재편집하여 설계하였다. 설계된 VP1 유전자는 시작 코돈과 종결코돈을 제외한 VP1의 전체 염기 서열을 포함하는 것이며, 이는 유전자 인공합성 방법을 통해 DNA로 확보하였다.
- GFP와 VP1 유전자의 삽입 여부를 각각 확인하기 위하여, 유전자 증폭을 위해 사용했던 동일한 primer를 사용하였다. 사용된 primer는 GFP- forward- BamHI 5'-GGATCCCCG GGTGGTCAGTCCCTTATGAGTAAAGGAGAAGAA-3', GFP- reverse- SacI 5'-GAGCTCTTTGTATAGTTCATCCAT GCCATGTC-3', VP1- forward-BamHI 5'-GGATCCCCGG GTGGTCAGTCCCTTATGACCACCTCTGCGGGT-3, , VP1 -reverse-SacI (5'-GAGCTCCTGTTTTGCGGGTGCCACAATCCTCT-3'이며, PCR 조건은 GFP의 경우 94℃ 에서 3 분간 변성 후 denaturatione 94℃에서 30초, annealinge 58 ℃ 에서 30초, extensione 72℃ 에서 30초로 하여 30 회수 행하고 충분한 PCR 산 물을 얻기 위해 마지막에 72℃ 에서 5 분간 extension을 수행하였다. VP1 유전자의 검출을 위한 PCR 조건은 나머지 조건은 동일하게 하고, annealinge 63 ℃ 에서 30초로 하였다.
- 채취한 상등액과 동량의 isopropanol을 넣고 상온에서 10분 정치하였고, 이를 15분간 원심분리하여 상등액을 완전히 제거하였고, 1 mL의 75% ethml이을 넣고 세척 후원심분리하여 상등액을 제거하였다. 상온에서 20분 간건조시킨 후, 여기에 증류수를 40 ul 넣어 완전히 녹인 다음, 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 추출한 RNA의 농도와 순수 도를 측정하였다.
- 설계하였다. 설계된 VP1 유전자는 시작 코돈과 종결코돈을 제외한 VP1의 전체 염기 서열을 포함하는 것이며, 이는 유전자 인공합성 방법을 통해 DNA로 확보하였다. 일반적으로 유전자 인공합성은 유전자 자원을 구하기 힘든 강력한 병원균 등의 유전자를 안전한 방법으로 확보할 수 있는 방법으로 사용 하나, 본 연구에서는 담배의 codon usage 를 고려한 새로운 sequence의 유전자를 확보하기 위해 이 방법을 사용하였다.
- 유전자 인공합성의 방법을 약술하면, 합성하려는 유전자를 10개 부위로 나누어, 인접 부위 간 합성반응에 적합한 중복 부위를 포함하게 long-nucleotide (80-90mers)를 설계하고 (Table 1), 제작된 long-nucleotide (Bionics Co., Korea) 들중 가장 중심 위치에 있는 long-nucleotide들 (VP1-1F, VP1-1R)을 먼저 templateless nucleotide extension의 방법으로 core fragment 를 합성하고, 합성된 core fragment는 exten-sion-PCR (core fragment를 template로 하여, 인접한 longnucleotide를 이용한 extension)의 방법으로 2차 extended fragment를 제작하였으며, 이를 다시 template로 하여 같은 방법으로 3차, 4차 및 5차 extension을 수행함으로써 최종 633 bp의 DNA Augment를 제작하였다. 유전자 양끝 부위의 염기서열을 이용한 specific PCR로 이 DNA fragment를증폭시켰으며, 클론 화, 염기서열 분석 및 돌연변이체의 수정을 통하여 VP1 유전자 633 bp의 DNA의 인공합성을 완료하였다 (Figure 1).
- 시 2001). 이를 약술하면, 담배 (Nicotiana tabacume SRI) 자엽절편은 생장실에서 무균배양하여 생육시킨 담배의 건전한 자엽을 사용하였으며, 이를 실험에 적당한 크기(약 1.0 cm2) 로 절 단하고, pCAMBIA MP1 또는 pCAMBIA II-GEP가 형질 전환된 / 의 배양액에 침전 시켜 감염을 수행하였다. Agrobacteriume 28℃ YEP 배지에서 48시간 배양하여 안정화시켰으며, 이를 다시 28℃ 에서 24시간 계대 배양한 배양액을 감염에 사용하였다.
- 또한 새로운 식물형질전환 벡터로 pBI121과 pCAMBIA1390의 장점을 수용하여, hygromycin 저항성과 CaMV 35S promotor 를 포함하는 pCAMBIA II를 제작하였다. 제작된 벡터와 VP1 유전자 및 GFP 유전자를 사용하여 담배를 형질전환시켰고, 각각의 형질전환 식물체 내에서 전체 길이의 target gene (VP1) 의 성공적인 삽입을 확인하였다. 각 유전자의 발현은 RT-PCR 과 Real-Time PCR의 결과로 측정하였으며, VP1 유전자의 전사가 담배 내에서 이루어졌음과 고효율의 전사체를 만드는 형질전환체 VPl-4를 선별하였다.
- 주형 없이 각각의 oligonucleotide를 여러 횟수의 PCR을 통해 유전자의 길이를 증폭시켰고, 이렇게 제작된 유전자는 T-vector에 cloning 하여 확보하였으며, sequencing을 통해 염기서열을 확인하였다 (Figure 1). 합성된 총 VP1 DNA의 길이는 633 bp이며, 211개의 아미노산을 암호화하고 있다.
- 5 mM dNTP를 첨가하고, 45℃, 45분의 RT-reaction에 이어 99℃, 5분으로 불활화하였다. 총 반응액의 양은 20 ul으로, GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, U.S.A.)을 사용하여 수행하였다 1차 PCRe total volume 100 成으로 10 ng template DNA, 각 50 pmol VP1- 또는 GFP-forward 및 reverse primer pairs, 1.5 mM MgCh, lOx PCR buffer, 2.5 mM dNTP, 2.5 U Taq polymerase로 조성하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃ 에서 5분간 변성 후 denaturation 은 94 ℃ 에서 30초 annealinge 63 ℃ 에서 1분, extensione 72 ℃ 에서 30초로 하여 35회 수행하였고 충분한 PCR 산물을 얻기 위해 마지막에 72℃ 에서 5분간 extension을 수행하였다.
- 위해, genomic DNA를 분리하였다. 캘러스 100-200 mg의 시료에서 chromosomal DNA를 분리하였으며 (Bio-solution Co., genomic DNA extraction kit), 선발 배지를 통해 성장한 형질전환체 내에 GFP 및 VP1 유전자가 존재하는지 여부를 확인하기 위해 polymerase chain reaction (PCR) 을 수행하였다. PCR의 반응액 조성은 전체 반응액은 100 ul로 하였고 10 ngtemplate DNA, 각]00 pmol primer, 1.
- PCR 조건은 94 ℃ 에서 5분간 변성 후 denaturation 은 94 ℃ 에서 30초 annealinge 63 ℃ 에서 1분, extensione 72 ℃ 에서 30초로 하여 35회 수행하였고 충분한 PCR 산물을 얻기 위해 마지막에 72℃ 에서 5분간 extension을 수행하였다. 한편 RT-PCR 및 Real-Time PCR에 의한 정량을 위하여, RT-reaction의 조성에서 동량의 시료를 사용한 2 종류의 반응액, 즉 정상 RT-reaction과 reverse transcriptase만을 제외한 RT-reaction을 조성하였고, 항상 같은 조건으로 반응을 수행하였다.
- 형질 전환된 개체로부터 insert DNA의 삽입 여부를 판별하기 위해, genomic DNA를 분리하였다. 캘러스 100-200 mg의 시료에서 chromosomal DNA를 분리하였으며 (Bio-solution Co.
- 감염 시 킨 leaf disk에서 hygromycin 내성(5 mg/L)의 callus들을 선별하였으며, 각각 재분화된 clone으로써 고유번호를 부여하고, 각 clone 중 일부의 잎을 수거하여 genomic DNA를 추출하였다. 형질전환 담배의 genomic DNA 내에 삽입된 VP1 또는 GFP 유전자를 확인하기 위하여 GEP와 VP1 각기 특이적 primer를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질 전환하지 않은 식물체 (Nicotiana tabacum SR1)의 genomic DNA에서는 해당 DNA의 증폭이 일어나지 않았고, 형질 전환된 식물체에서는 각각 660 bp (VP1) 및 738 bp (GEP) 의 DNA의 증폭이 관찰되었으며, 이를 통하여 식물체의 염색체 내에 VP1 또는 GFF의 유전자가 도입되었다는 사실을 확인할 수 있었다 (Figure 5).
대상 데이터
- 8%), 항생제 (hygromycin 5 mg/L, cefotaxime 200 mg/L)가 첨가된 재분화 배지에 옮겼다 (Mu-rashige and Skoog 1962; Ohira 1973; Ikeda 1976). Hygromycin 내성을 갖는 캘러스로부터 발생한 신초를 뿌리 유도 배지 (Zatyko 1990)에 치상하여 순화시킨 후, 분석 시료로 사용하였다.
- 또한, CaMV 35S promoter와 NOS poly terminator를 포함하며, hygromycin 저항성 유전자를 가지는 식물 형질 전환용 벡터를 완성하였다. 본 연구에서는 pCAMBIA Ⅱ-VP1, pCAMBIA Ⅱ-GFP plasmid DNA를 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 설계된 VP1 유전자는 시작 코돈과 종결코돈을 제외한 VP1의 전체 염기 서열을 포함하는 것이며, 이는 유전자 인공합성 방법을 통해 DNA로 확보하였다. 일반적으로 유전자 인공합성은 유전자 자원을 구하기 힘든 강력한 병원균 등의 유전자를 안전한 방법으로 확보할 수 있는 방법으로 사용 하나, 본 연구에서는 담배의 codon usage 를 고려한 새로운 sequence의 유전자를 확보하기 위해 이 방법을 사용하였다.
- 제작된 형질전환용 clonee freeze and thaw method (Hooykaas 1989)를 사용하여 Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404에 형질전환 후 담배의 형질전환에 사용하였다 시(Endo et 시 2001). 이를 약술하면, 담배 (Nicotiana tabacume SRI) 자엽절편은 생장실에서 무균배양하여 생육시킨 담배의 건전한 자엽을 사용하였으며, 이를 실험에 적당한 크기(약 1.
- 농도로 사용하였다. 형광 시약은 2x SYBR Green supermix (Bio-Rad)를 사용하였으며, Bio-Rad사의 Real-Time MY-IQ machine을 사용하였다. PCR의 조건은 94 ℃ 에서 5분간 변성 후 denaturatione 94℃ 에서 30초, annealinge 63℃ 에서 30초 extensione 72℃ 에서 30초로 하여 35 회수행하였고, Real-Time PCR의 조건은 excitatione 490nm, emissione 530nm, exposure timee 500 msec, 필터 당측정시간은 3초로 하였으며, Ct (Threshold cycle) value는 3-12 cycle에서 보여준 형광강도의 표준편차에 10 배에 해당되는 형광강도를 나타내는 cycle로 결정하였다.
성능/효과
- 이는 본 연구의 total RNA isolation 과정에서 동량의 isopropanol을 사용하여 RNA를 침전시켰기에 chromosomal DNA가 제거되지 못하였음을 보여주는 것이며 또한 RNase free DNase를사용하지 아니한 것도 원인이라 생각되었다. 그러나 cDNA template를 희석하여 PCR을 수행하고 비교하여 본 결과, cDNA의 VP1 copy 수는 동량의 chromosome의 그것과 최소 1000배 이상의 차이를 보였기에 VPle] 형질 전환된 담배 내에서 VP1의 전 사체가 생성되었음은 인정할 수 있었다.
- 이는 식물체 내에서 삽입시킨 유전자를 효과적으로 발현시키기 위한 것으로, PBI121vector의 CaMV 35S promotor와 GUS의 시작 코돈 간의 거리와 일치시킨 것이다. 따라서 인공합성된 633 bp의 VP1 유전자는 rP/-forward-BamHI (S-GGATCCCCGGGTG GTCAGTCCCTTATGACCACCTCTGCGGGT-3'), VPMeverse-SacI (5'-GAGCTCCTGTTTTGCGGGTGCCA CAATCCTCT-3, )의 primer로 증폭되었으며, 이로써 pBI121-을 거쳐 pCAMBIA 을 완성하였다. GFP의 경우, 특이적 primer를 사용하여 제작된 GFP PCR product를 주형으로 하여, 재차 GFP-forward-BamWL (5'-GGATCCCCGGGTGGTCAGTCCCTTATGAGTAAAGGAGAAGA A-3'), GEP-reverse-SacI (5'-GAGCTCTTTGTATAGTTC ATCCATGCCATGTC-3)을 사용한 특이적 PCR로 DNA fragment를 얻었으며, T-vector cloning 및 염기서열 확인 후 (738 bp), pBI121-GKP를 거쳐 pCAMBIA II-GEP를 완성하였다 (Figure 4).
- 또한 VP1 및 GFP 형질전환체에 대한 SDS-PAGE에 의한 분석에서도 대조군인 SR1 에서는 발견되지 아니한 소수의 minor band가 확인되었으나, VP1 및 GFP 과발현으로 인정되는 단백질 밴드는 발견할 수 없었다 (자료 미제시). 또한 ELISA의 결과는 대장균에서 생산된 anti-GEP antibody 및 anti-VP1 antibody를 사용하였으나, 이 단백질들의 식물체 내에서 대량생산됨을 증명할 만한 수준은 아니라 판단되었다. 그 이유는 callus 또는 소량의 잎 수준의 적은 시료로써 ELISA 실험에 충분한 발현 단백질을 얻지 못함에 있었으며, 또한 항체의 특이도 도 대장균에서 생산된 항원을 사용하여 만든 항체이기에 식물체에서 발현된 동일 단백질을 동일한 특이도로 반응하지 못할 수도 있을 것으로 생각되었다 (자료 미제시).
- , Korea)를 첨가한 후 94 ℃ 30초 63 ℃ 30초, 72℃ 1 분을 30회 수행하고, 마지막으로 72℃ 에서 5 분간 final elongation을 주어 증폭하였다. 모든 PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, U.S.A.)을사용하였으며, 형질전환 vector인 pBI121에 삽입하기 위한 VP1 유전자의 길이는 총 660 bp가 되었다. 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP) 유전자 (Chen 2003; Newell 2003; Reisen 2003)를 증폭하기 위하여는 pQE-GFP plasmid DNA를 주형으로 사용하였으며, 상기의 방법으로 PCR, 클론 화 및 염기서열 분석을 수행하였다 (Table 1).
- 실험에 사용된 전 사체가 있음이 인정된 8 개의 형질 전환체 중 1개가 1 cycle, 6개가 3 cycle, 1개가 7 cycle의 Ct value의 차이를 보이는 것으로 나타났으며, 이는 형질전환 체간 VP1 mRNA 발현 양이 상당한 차이가 있음으로 해석하였다. 선별된 형질전환체 VPl-4는 반복 실험에서도 같은 결과를 보였으며, RNase free DNase를 사용한 RT-reaction에서도 동일한 Ct value를 보여주었다. 이 VPl-4는 현재 계통을 확립시키기 위하여 성장 중이며 향후 X可단백질의 식물체에 의한 대량생산에서 생산 효율의 향상을 위한 주요 실험 재료가 될 것으로 기대하고 있다.
- (Figure 6B). 실험에 사용된 전 사체가 있음이 인정된 8 개의 형질 전환체 중 1개가 1 cycle, 6개가 3 cycle, 1개가 7 cycle의 Ct value의 차이를 보이는 것으로 나타났으며, 이는 형질전환 체간 VP1 mRNA 발현 양이 상당한 차이가 있음으로 해석하였다. 선별된 형질전환체 VPl-4는 반복 실험에서도 같은 결과를 보였으며, RNase free DNase를 사용한 RT-reaction에서도 동일한 Ct value를 보여주었다.
- , Korea) 들중 가장 중심 위치에 있는 long-nucleotide들 (VP1-1F, VP1-1R)을 먼저 templateless nucleotide extension의 방법으로 core fragment 를 합성하고, 합성된 core fragment는 exten-sion-PCR (core fragment를 template로 하여, 인접한 longnucleotide를 이용한 extension)의 방법으로 2차 extended fragment를 제작하였으며, 이를 다시 template로 하여 같은 방법으로 3차, 4차 및 5차 extension을 수행함으로써 최종 633 bp의 DNA Augment를 제작하였다. 유전자 양끝 부위의 염기서열을 이용한 specific PCR로 이 DNA fragment를증폭시켰으며, 클론 화, 염기서열 분석 및 돌연변이체의 수정을 통하여 VP1 유전자 633 bp의 DNA의 인공합성을 완료하였다 (Figure 1).
- 형질전환 담배의 genomic DNA 내에 삽입된 VP1 또는 GFP 유전자를 확인하기 위하여 GEP와 VP1 각기 특이적 primer를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질 전환하지 않은 식물체 (Nicotiana tabacum SR1)의 genomic DNA에서는 해당 DNA의 증폭이 일어나지 않았고, 형질 전환된 식물체에서는 각각 660 bp (VP1) 및 738 bp (GEP) 의 DNA의 증폭이 관찰되었으며, 이를 통하여 식물체의 염색체 내에 VP1 또는 GFF의 유전자가 도입되었다는 사실을 확인할 수 있었다 (Figure 5).
후속연구
- 또한 ELISA의 결과는 대장균에서 생산된 anti-GEP antibody 및 anti-VP1 antibody를 사용하였으나, 이 단백질들의 식물체 내에서 대량생산됨을 증명할 만한 수준은 아니라 판단되었다. 그 이유는 callus 또는 소량의 잎 수준의 적은 시료로써 ELISA 실험에 충분한 발현 단백질을 얻지 못함에 있었으며, 또한 항체의 특이도 도 대장균에서 생산된 항원을 사용하여 만든 항체이기에 식물체에서 발현된 동일 단백질을 동일한 특이도로 반응하지 못할 수도 있을 것으로 생각되었다 (자료 미제시).따라서 VP1 및 GFP 유전자의 담배 형질전환체에서 해당 mRNA의 발현 여부를 확인하기 위하여 RT-PCR과 Real-Time RT-PCR을 수행하였다.
- 대하여 SDS-PAGE 및 ELISA 등을 수행하였다. 먼저 GFP 형질전환체에 대한 형광현미경 검색에서는 녹색 형광을 발하는 조직을 가진 약간의 형질전환체가 발견되었으나, 대조군 (Nicotiana tabacum SR1)과 분명한 차이를 보이지는 아니하였으며, 이 형질전환체의 형광이 GFP 단백질에 의한 것인지 아닌지 확인할 수가 없었다. 또한 VP1 및 GFP 형질전환체에 대한 SDS-PAGE에 의한 분석에서도 대조군인 SR1 에서는 발견되지 아니한 소수의 minor band가 확인되었으나, VP1 및 GFP 과발현으로 인정되는 단백질 밴드는 발견할 수 없었다 (자료 미제시).
- 선별된 형질전환체 VPl-4는 반복 실험에서도 같은 결과를 보였으며, RNase free DNase를 사용한 RT-reaction에서도 동일한 Ct value를 보여주었다. 이 VPl-4는 현재 계통을 확립시키기 위하여 성장 중이며 향후 X可단백질의 식물체에 의한 대량생산에서 생산 효율의 향상을 위한 주요 실험 재료가 될 것으로 기대하고 있다.
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