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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 약용가치가 우수한 구기자나무의 뿌리를 대량생산하기 위하여 구기자나무의 잎 절편으로부터 모상근을 유도하고, 이 렇게 유도된 모상근을 대량생산하기 위하여 최근 여러 약용식물의 대량생산에 이용되고 있는 생물반응기 (bioreactor)(Paek et al. 2001)를 적용함으로써 구기자나무 모상근의 대량생산 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 종자로부터 발아시킨 식물체의 뿌리절편에서 genomicDNA를 분리한 다음 (Murray and Thompson 1980), PCR분석을 통하여 비교분석하였다. PCR분석에 사용된 primer 는 총 500 bp의 PCR 산물을 증폭하도록 제작한 forwardprimer (5'-ATG GCT GAA GAC GAC CTG TGT T-3')와 reverse primer (5'-TTA GCC GAT TGC AAA CTT GCA C-3')를 이용하였다. PCR은 template DNA 100 ng, dNTP 0.
- PCR분석에 사용된 primer 는 총 500 bp의 PCR 산물을 증폭하도록 제작한 forwardprimer (5'-ATG GCT GAA GAC GAC CTG TGT T-3')와 reverse primer (5'-TTA GCC GAT TGC AAA CTT GCA C-3')를 이용하였다. PCR은 template DNA 100 ng, dNTP 0.4 μM, primer 10 pmoles, Taq DNA polymerase 2 unit등의 조성으로 총 반응액을 50 μL로, 95℃에서 5분간 predenaturation을 거친 후, 95 ℃ 에서 30초간 denaturation 하였으며, annealing은 55℃ 에서 30초, polymerization은 72℃ 에서 1분간 하여 36 cycle 을 하였으며, extension은 72 ℃에서 5분간하여 반응을 마친 후, 전기영동하여 결과를 확인하였다.
- 구기자나무의 잎 절편을 LB배지에서 24시간동안 배양(27±1℃)한 Agrobacterium rhizogenes strain, 15834와 공동배양 한 다음 멸균된 filter paper 위에 20분간 잎 절편을 건조시킨 후 MS 고체 배지 위에서 3일 간 공조배양 하였다. 사용된 배지의 pH는 5.
- 멸균된 증류수로 30분간 침지시킨 다음 70% (v/v)EtOH에 10초간 침지한 후 1% (v/v) sodium hypochlorite용액에 15분간 표면살균하였다. 그리고 살균된 종자를 멸균된 증류수로 5회 수세한 후 1/2 MS (Murashige and Skoog 1962)에 2% (w/v)의 sucrose와 0.3% (w/v)의 gelrite를 첨가한 배지에 접종하여 발아된 식물체를 사용하였다.
- 배양은 각각의 배지가 100 mL씩 포함된 250 mL 삼각플라스크에서 이루어졌으며, rpm은 110으로 조정하여 실시하였다. 또한 모상근의 현탁배양시 sucrose의 농도가 모상근의 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 1/2 MS 액체배지에서sucrose의 농도를 0%, 1%, 3%, 5%, 7% (w/v)로 달리 하여실험을 하였다. 위의 실험은 온도가 25±3℃로 조절되는 배양실에서 16시간의 명조건, 8시간의 암조건으로 4주간 배양하였으며, 각각 3회 수행하였다.
- 모상근의 생물반응기 배양에서 배지조건을 최적화하기 위하여, 배지는 1/2 MS와 MS배지를 이용하였으며 sucrose의 농도를 각각 3과 5% (w/v)로 첨가하여 수행하였다. 생물반응기는 10 L의 air lift bioreactor (balloon type, Figure lE)(Paek et al.
- 그리고 구기자 모상근은 각 생물반응기에 40 g씩 접종하여 배양하였다. 배양기내의 공기주입량은 0.1 vvm (air volume/culture medium volume/mim)으로 하고 배지의 pH는 5.7로 조정하여 온도가 25±3℃로 조절되는 배양실에서 16시간의 명조건, 8시간의 암조건으로 4주간 배양하였다.
- 또한 모상근의 현탁배양시 sucrose의 농도가 모상근의 생장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 1/2 MS 액체배지에서sucrose의 농도를 0%, 1%, 3%, 5%, 7% (w/v)로 달리 하여실험을 하였다. 위의 실험은 온도가 25±3℃로 조절되는 배양실에서 16시간의 명조건, 8시간의 암조건으로 4주간 배양하였으며, 각각 3회 수행하였다.
- 3%) 배지에 500 mg/L cefotaxime, 3%(w/v) sucrose 첨가하여 모상근을 유도하였다. 유도된 구기자나무 모상근을 cefotaxime이 500 mg/L들어간 MS고체배지에서 2주 간격으로 5회 계대배양하여 균을 제거하였다. 이후 cefbtaxime이 첨가되지 않은 배지에서 박테리아의 생장이 이루어지지 않은 것을 확인한 라인은 cefotaxime이 첨가되지 않은 고체배지에 배양하여 모상근 라인을 유지 하였다.
- 유도된 모상근에서 Agrobacterium rhizogenes strain, 15834의 rolC 유전자 도입여부를 확인하기 위하여 모상근과 기내에서 종자로부터 발아시킨 식물체의 뿌리절편에서 genomicDNA를 분리한 다음 (Murray and Thompson 1980), PCR분석을 통하여 비교분석하였다. PCR분석에 사용된 primer 는 총 500 bp의 PCR 산물을 증폭하도록 제작한 forwardprimer (5'-ATG GCT GAA GAC GAC CTG TGT T-3')와 reverse primer (5'-TTA GCC GAT TGC AAA CTT GCA C-3')를 이용하였다.
- 배양실의 온도는 25±3℃ 으로 조절하였으며 광도는 30 μmol m-2sec-1으로 하여 16시간의 명조건, 8시간의 암조건으로 배양하였다. 이후 MS 고체 (Gelrite 0.3%) 배지에 500 mg/L cefotaxime, 3%(w/v) sucrose 첨가하여 모상근을 유도하였다. 유도된 구기자나무 모상근을 cefotaxime이 500 mg/L들어간 MS고체배지에서 2주 간격으로 5회 계대배양하여 균을 제거하였다.
- 유전자가 삽입되지 않은 종자유래 뿌리 절편은 생장조절제가 첨가되지 않은 배지에서는 측근이 유도되지 않았지만(Figure 1A), 형질전환된 모상근 절편에서는 측근이 활발히 유도되었다 (Figure IB). 항생제 (cefbtaxime)가첨가된 배지에서 약 5번 이상 계대배양한 후 항생제가 제거된 배지에 옮겨 더이상 박태리아 생장이 이루어지지 않는 라인을 선발하고 유지 하였으며 이 라인들은 페트리디쉬 및 삼각플라스크에 옮겨 유지하였다 (Figure 1C, D).
- 현탁배양시 모상근의 최적 배양조건을 찾기 위해 생장이 왕성한 한가지 모상근 라인을 재료로하여 각각 생장조절물질이 첨가되지 않은 1/5 MS, 1/4 MS, 1/3 MS, 1/2 MS, MS(sucrose는 모든 배지에 3%로 동일하게 처리하였음) 액체배지에 모상근의 절편체를 약 1 g씩 각각 접종하였다. 배양은 각각의 배지가 100 mL씩 포함된 250 mL 삼각플라스크에서 이루어졌으며, rpm은 110으로 조정하여 실시하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 구기자나무 (L chinense Miller) 종자는 청양 구기자 시험장에서 채취한 청양 8호이며, 채취한 종자는 멸균된 증류수로 30분간 침지시킨 다음 70% (v/v)EtOH에 10초간 침지한 후 1% (v/v) sodium hypochlorite용액에 15분간 표면살균하였다. 그리고 살균된 종자를 멸균된 증류수로 5회 수세한 후 1/2 MS (Murashige and Skoog 1962)에 2% (w/v)의 sucrose와 0.
성능/효과
- 5 g)이 높게 나타났다. 1/2 MS배지에 5%의 sucrose가 첨가된 배지에서도 생체중과 건물중이 각각 249.1 g와 22.7 g으로 양호하게 나타났으나 생산성 측면에서 보면 sucrose을 적게 사용하는 3%처리구가 유리하다고 생각된다. 하지만, 이러한 결과는 생산규모가 증가하면서 달라질 수 있는 가능성을 가지고 있다.
- 구기자나무의 잎 절편을 A.rhizogenes strain, 15834와 공동배양하여 유도된 모상근의 최적배양조건을 결정하기 위하여 MS배지와 sucrose의 농도를 다양하게 처리한 결과, 1/2 MS 배지에서 생체중 (12.3 g)과 건물중 (1.4 g)으로 가장 높게 나타났으며, 탄소원으로 사용된 sucrose에서는 3% 농도에서 생체중과 건물중이 가장 양호하게 나타났다. 이와같이 결정된 MS농도와 sucrose의 농도을 이용하여 대량배양을 하고자 10 L의 air lift bioreactor에서 대량배양한 결과 역시 1/2 MS 와 3% sucrose 의 농도를 사용한 처리구에서 가장 높은 생체중과 건물중의 증가를 보였다.
- 구기자나무의 잎 절편체로부터 모상근을 유도하고자Agrobacterium rhizogenes 15834와 공동배양한 결과, 모상근은 배양 2주 후부터 절편체의 절단부위에서 유도되었다.이렇게 유도된 모상근은 500 mg/L의 cefbtaxime이 첨가된 MS 고체배지에 2주 간격으로 5번 계대배양하여 선발, 증식하였다.
- 이러한 탄소원의 대부분은 인위적으로 첨가하는 sucrose라고 할 수 있다. 본 실험에서 sucrose가 구기자나무 모상근의 생장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 배지 내 sucrose의 농도를 다양하게 첨가한 결과 (Figure 4), sucrose가 3%로 처리되었을 때 모상근의 생체중은 24.9 g으로 가장 높게 나타났으며 건물 중 역시 2.5 g으로 가장 높게 나타났다. 그러나 sucrose 농도가 5%이상으로 증가하면서 모상근의 생장이 감소하는 경향을 나타내었다.
- 삼각플라스크에서 액체배양에 의하여 증식된 구기자나무모상근 절편을 생장조절물질이 첨가되지 않은 1/5 MS, 1/4 MS, 1/3 MS, 1/2 MS, MS의 액체배지에 각각 생체중 1 g씩 넣어 4주간 현탁배양한 결과, 1/2 MS 배지에서의 생체중 12.3 g와 건물중 1.4 g으로 가장 높았으며, 그 다음으로는 MS 배지로 생체중 8.3 g와 건물중 1.0 g으로 생장이 높게 나타났다 (Figure 3). 반면에 1/2보다 낮은 농도에서는 농도가 감소될수록 모상근의 생장은 저조한 생장을 나타내는 것으로 나타났다 (Figure 3).
- Zhang 등 (1995)의 실험에서도 Panax notoginseng의 세포배양시 높은 초기 삼투압이 세포의 생장을 억제한다고 발표하였다. 이상의 결과에서 알 수 있듯이, 배지 내 sucrose 는 3% 이상의 농도에서 생장에 미치는 영향은 무기성분이모상근의 생장에 미치는 영향처럼 극적이지는 않지만 구기자나무 모상근의 생장에 영향을 주는 것으로 나타났다.
- 4 g)으로 가장 높게 나타났으며, 탄소원으로 사용된 sucrose에서는 3% 농도에서 생체중과 건물중이 가장 양호하게 나타났다. 이와같이 결정된 MS농도와 sucrose의 농도을 이용하여 대량배양을 하고자 10 L의 air lift bioreactor에서 대량배양한 결과 역시 1/2 MS 와 3% sucrose 의 농도를 사용한 처리구에서 가장 높은 생체중과 건물중의 증가를 보였다. 하지만,1/2 MS에 5% sucrose를 처리한 bioreactor배양에서도 3% sucrose처리에서와 마찬가지로 생체중과 건물중이 높게 나타났다.
- 증식된 모상근의 genome에 외 래의 rolC 유전자가 정상적으로 삽입되었는지의 여부를 확인하기 위하여 PCR분석을 실시한 결과, 대조구인 부정근 (Figure 2의 lane N)에서는 rolC 유전자를 확인할 수 없었으나, 선발된 구기자나무의 모상근 (Figure 2의 lane 1, 2, 3)에서는 0.5 kb에서 모두 단편을 확인하여 유전자가 도입되었음을 알 수 있었다 (Figure 2).
- Figure 5와 같다. 현탁배양의 결과와 마찬가지로 생물반응기를 이용한 배양에서도 역시 고농도의 무기물 농도는 모상근의 생장을 억제한 것으로 나타났고, 무기물 농도가 낮은 1/2 MS와 3% sucrose의 조합에서 생중량 (260.2 g)과 건물중 (24.5 g)이 높게 나타났다. 1/2 MS배지에 5%의 sucrose가 첨가된 배지에서도 생체중과 건물중이 각각 249.
후속연구
- 2003). 따라서 향후 배양규모를 증가 시키고자할 때 sucrose의 농도는 재고하여야 할 것으로 생각된다.
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