기능성 어육단백질의 젤화 특성과 산업적 응용-1. 가열변성 중 화학결합에 미치는 pH의 영향 Gelation Properties and Industrial Application of Functional Protein from Fish Muscle-1. Effect of pH on Chemical Bonds during Thermal Denaturation원문보기
근원섬유단백질과 알칼리 용액으로 처리하여 회수한 단백질의 가열 중 ANS 소수성의 변화, IR스펙트럼의 변화, SH기의 변화, 전기영동상의 변화 및 엔탈피의 변화로 비교하여 회수 단백질의 가열 변성기구를 조사하였다. 갈고등어와 냉동 꼬마민어의 근원섬유단백질은 가열 온도의 상승과 더불어 소수성 잔기가 외부로 노출되고 소수성 상호작용은 6$0^{\circ}C$ 부근에서 최대로 일어나지만, 근형질 단백질을 포함하는 회수단백질은 근원섬유 단백질과 ANS 소수성에서 차이를 보였다. pH가 증가함에 따라 1636 $cm^{-1}$ /에 해당하는 peak가 증가하였다. 반응성 SH기와 총 SH기 수의 차이는 pH 7.0과 pH 10에서 비교적 큰 것으로 나타났다. SDS-PAGE 상에서 pH가 상승함에 따라 myosin heavy chain의 중합체가 확인되었다. 알칼리 공정으로 제조한 회수 단백질을 시차주사열량계로 분석한 결과, 회수 단백질은 33.1,44.3 및 65.5$^{\circ}C$에서 전이 온도가 나타나며, myosin의 변성 에 해당하는 온도인 51.7$^{\circ}C$의 peak는 보이지 않았다. 회수 단백질의 가열 젤은 극단적 인 pH 처리에 의한 $\alpha$-helix 구조의 $\beta$-sheet 구조 전환, 가열에 의한 S-S 결합의 형성과, myosin heavy chain 중합체 형성에 의한 것으로 보인다.
근원섬유단백질과 알칼리 용액으로 처리하여 회수한 단백질의 가열 중 ANS 소수성의 변화, IR스펙트럼의 변화, SH기의 변화, 전기영동상의 변화 및 엔탈피의 변화로 비교하여 회수 단백질의 가열 변성기구를 조사하였다. 갈고등어와 냉동 꼬마민어의 근원섬유단백질은 가열 온도의 상승과 더불어 소수성 잔기가 외부로 노출되고 소수성 상호작용은 6$0^{\circ}C$ 부근에서 최대로 일어나지만, 근형질 단백질을 포함하는 회수단백질은 근원섬유 단백질과 ANS 소수성에서 차이를 보였다. pH가 증가함에 따라 1636 $cm^{-1}$ /에 해당하는 peak가 증가하였다. 반응성 SH기와 총 SH기 수의 차이는 pH 7.0과 pH 10에서 비교적 큰 것으로 나타났다. SDS-PAGE 상에서 pH가 상승함에 따라 myosin heavy chain의 중합체가 확인되었다. 알칼리 공정으로 제조한 회수 단백질을 시차주사열량계로 분석한 결과, 회수 단백질은 33.1,44.3 및 65.5$^{\circ}C$에서 전이 온도가 나타나며, myosin의 변성 에 해당하는 온도인 51.7$^{\circ}C$의 peak는 보이지 않았다. 회수 단백질의 가열 젤은 극단적 인 pH 처리에 의한 $\alpha$-helix 구조의 $\beta$-sheet 구조 전환, 가열에 의한 S-S 결합의 형성과, myosin heavy chain 중합체 형성에 의한 것으로 보인다.
The effect of pH on surface hydrophobicity, sulfhydryl group, infrared spectrum, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) pattern and enthalpy was investigated in recovered protein from mackerel and frozen blackspotted croaker by alkaline processing. Hydrophobic residue i...
The effect of pH on surface hydrophobicity, sulfhydryl group, infrared spectrum, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) pattern and enthalpy was investigated in recovered protein from mackerel and frozen blackspotted croaker by alkaline processing. Hydrophobic residue in myofibrillar protein exposed to the surface of protein, and hydrophobic interaction were the highest around 6$0^{\circ}C$. The surface hydrophobicity was different between myofibrillar protein and myofibrillar protein including sarcoplasmic protein (recovered protein). The peak at 1636 c $m^{-l}$ was increased with pH, and the recovered protein was unfolded in alkali pH. Difference of surface and total sulfhydryl group at pH 7.0 and 10 was comparative high, and decrease of surface sulfhydryl group indicated formation of S-S bonds. Mackerel and frozen blackspotted croaker in alkaline pH showed bands of polymerized myosin heavy chain on SDS-PAGE pattern. The transition temperatures of recovered protein were 33.1, 44.3 and 65.5$^{\circ}C$. Gelation of recovered protein from alkali processing was estimated by increase of $\beta$-sheet structure by pH treatment, S-S bonds by oxidation of surface sulfhydryl group in heating, polymerization of myosin heavy chain in order.r.
The effect of pH on surface hydrophobicity, sulfhydryl group, infrared spectrum, SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) pattern and enthalpy was investigated in recovered protein from mackerel and frozen blackspotted croaker by alkaline processing. Hydrophobic residue in myofibrillar protein exposed to the surface of protein, and hydrophobic interaction were the highest around 6$0^{\circ}C$. The surface hydrophobicity was different between myofibrillar protein and myofibrillar protein including sarcoplasmic protein (recovered protein). The peak at 1636 c $m^{-l}$ was increased with pH, and the recovered protein was unfolded in alkali pH. Difference of surface and total sulfhydryl group at pH 7.0 and 10 was comparative high, and decrease of surface sulfhydryl group indicated formation of S-S bonds. Mackerel and frozen blackspotted croaker in alkaline pH showed bands of polymerized myosin heavy chain on SDS-PAGE pattern. The transition temperatures of recovered protein were 33.1, 44.3 and 65.5$^{\circ}C$. Gelation of recovered protein from alkali processing was estimated by increase of $\beta$-sheet structure by pH treatment, S-S bonds by oxidation of surface sulfhydryl group in heating, polymerization of myosin heavy chain in order.r.
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문제 정의
본 연구에서는 알칼리 용액으로 처리하여 회수한 어육 단백질의 가열 중 ANS 소수성 의 변화, SH기의 변화, 전기 영 동상의 변화, IR 스펙트럼의 변화 및 엔탈피의 변화를 측정하여 pH 전이로 회수한 어육 단백질의 가열 변성기구와 식염 무첨가 가열 젤 형성 기구를 구명하고자 시도하였다.
제안 방법
DSC 분석은 micro DSC IKSETARAM Scientific and Industrial Equipment, France)로 실시하였다. 정 확하게 무게를 단 650 - 700 mg의 시료단백질(수분함량 80%)을 실린더 형 cell에 넣고 뚜껑 을 닫아 밀봉한 다음 10 〜 90°C의 온도 범위에 걸쳐 분당 1°K의 속도로 온도를 상승시키면서 분석하였다.
5 mL를 첨 가하였다. 각각의 반응 용액 에 50 虬의 10 mM 5, 5, -dithiobis(2- nitrobenzoic acid)용액을 첨가하여 total SH기는 40°C에서 25분 동안 항온한 후, 반응성 SH기는 5°C 에서 25분 저장한 후 412 nm에서 각각의 흡광도를 분광광도계(UV-1601, Shi- madzu, Kyoto, Japan)로 측정하였다.
즉 10% sorbitol을 포함하는 마쇄육에 6배 량의 찬 증류수를 첨가하여 8000 rpm에서 1분 동안 호모게나즈하였다. 균질물에 1 N NaOH를 첨가하여 pH 7, 8, 9, 10, 10.5 및 11로 조절하고 원심 분리 (10, 000xg, 25분)하여 중간층만을 취하여 회수 단백질로 사용하였다.
원심분리하여 얻은 침전물에 6배량의 찬 증류수를 가하여 8000 rpm에서 1분 동안 호모게나이즈하였다. 균질물에 1 N NaOH를 첨가하여 pH 7, 8, 9, 10, 10.5 및 11로 조절하여 어육 단백질을 용해시킨 후 원심분리하고(10, 000 xg, 25분), 원심분리 후 가용성 단백질과 수화 단백질을 포함하는 중간층을 회수하여 근원섬유 단백질로 사용하였다. 근형질 단백질을 포함하는 회수 단백질은 다음과 같이 조제하였다.
근원섬유단백질과 알칼리 용액으로 처리하여 회수한 단백질의 가열 중 ANS 소수성의 변화, IR 스펙트럼의 변화, SH기의 변화, 전기영동 상의 변화 및 엔탈피의 변화로 비교하여 회수 단백질의 가열 변성기구를 조사하였다. 갈고등어와 냉동 꼬마민어의 근원섬유단백질은 가열 온도의 상승과 더불어 소수성 잔기가 외부로 노출되고 소수성 상호작용은 60°C 부근에서 최대로 일어나지만, 근형질 단백질을 포함하는 회수단백질은 근원섬유 단백질과 ANS 소수성에서 차이를 보였다.
하여 측정하였다. 단백질 용액(1 mg/mL)을 가열 순환 수조(Model PCC-7000, EYELA, Tokyo, Japan)에서 분당 1°C의 속도로 25°C에서 80°C까지 가열하면서 5°C 간격으로 시료를 취하여 즉시 얼음물에서 냉각시키고 시료 용액 250 UL에 total SH기 의 측정 인 경 우는 8 M urea, 2% SDS, 10 mM EDTA-f- 포함하는 0.1 M sodium phosphate(pH 8.0) 용액 2.5 mL를 첨가하였고, 반응성 SH기의 측정인 경우는 시료 용액 250 虬에 2% SDS와 10 mM EDTA를 포함하는 0.1 M sodium phosphate(pH 8.0) 용액 2.5 mL를 첨 가하였다. 각각의 반응 용액 에 50 虬의 10 mM 5, 5, -dithiobis(2- nitrobenzoic acid)용액을 첨가하여 total SH기는 40°C에서 25분 동안 항온한 후, 반응성 SH기는 5°C 에서 25분 저장한 후 412 nm에서 각각의 흡광도를 분광광도계(UV-1601, Shi- madzu, Kyoto, Japan)로 측정하였다.
단백질의 구조 변화에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해 IR 스펙 트럼의 변화를 분석 하였다. 갈고등어 인 경 우(Fig.
측정하였다. 동일한 pH 용액으로 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/mL가 되도록 4단계로 희석한 어육 단백질 용액 3 mL를 가열 순환수조 (Model PCC-7000, EYELA, Tokyo, Japan)에서 분당 1°C 의 속도로 25°C에서 80°C까지 가열하면서 5°C 간격으로 시료를 꺼내 즉시 얼음물에 냉각시 키고 20°C에서 5분 동안 단백 질을 안정 시 킨 다음 10 虬의 l-anilio-8-naphtalene sulfo- nate(ANS) 용액을 첨가하여 excitation 파장 374 nm, emis sion 파장 485 nm에서 형광광도계 (LS-50B, Perkin Elmer, USA)로 형광의 강도를 측정하였다. 표면 소수성의 크기는 단계별로 희석한 단백질 용액의 농도에 대한 형광강도의 크기를 선형회귀로 분석하고 선형 방정식의 기울기로 표시하였다.
동일한 pH 용액을 사용하여 각 시료 단백질의 농도를 1.25 mg/mL로 조절한 후, 시료 용액 1 mL에 0.25 mL의 SDS- PAGE 시료 완중액 (0.1% bromophenol blue, 14.4 mM 2- mercaptoethanol, 2% SDS, 50% glycerol을 포함하는 60 mM Tris-HCKpH 6.8))을 첨가하고, 90°C에서 3분 동안 가열하여 전기영동용 시료를 조제하였다.
, Suwon, Korea)로 2회 마쇄하였다. 마쇄한 어 육 중량에 대하여 냉동변성 방지 제 로서 10%의 sorbitol을 첨 가한 후 동결 저장하면서 단백질 추출 시료로 사용하였다.
반응성 SH기 와 total SH기 는 Ellman의 방법 (13)을 다소 변형 하여 측정하였다. 단백질 용액(1 mg/mL)을 가열 순환 수조(Model PCC-7000, EYELA, Tokyo, Japan)에서 분당 1°C의 속도로 25°C에서 80°C까지 가열하면서 5°C 간격으로 시료를 취하여 즉시 얼음물에서 냉각시키고 시료 용액 250 UL에 total SH기 의 측정 인 경 우는 8 M urea, 2% SDS, 10 mM EDTA-f- 포함하는 0.
압착하여 투명한 disk를 성형하였다. 성형한 KBr disk를 cell에 넣고, pH 변성시킨 단백질 용액과 같은 pH 용액을 사용하여 단백질의 농도를 5 mg/mL로 조절한 각 시료 용액 10 况를 loading한 후 500-4000 crL의 범위에서 FT- IR(IFS 66, Bruker, Germany)로 흡수 스펙 트럼을 분석 하였다.
정 확하게 무게를 단 650 - 700 mg의 시료단백질(수분함량 80%)을 실린더 형 cell에 넣고 뚜껑 을 닫아 밀봉한 다음 10 〜 90°C의 온도 범위에 걸쳐 분당 1°K의 속도로 온도를 상승시키면서 분석하였다. 이 때 reference는 동량의 증류수를 사용하였으며, 시료 분석 을 행 하기 전 에 reference5]- 시 료 cell의 heat flow를 검정하였다.
Equipment, France)로 실시하였다. 정 확하게 무게를 단 650 - 700 mg의 시료단백질(수분함량 80%)을 실린더 형 cell에 넣고 뚜껑 을 닫아 밀봉한 다음 10 〜 90°C의 온도 범위에 걸쳐 분당 1°K의 속도로 온도를 상승시키면서 분석하였다. 이 때 reference는 동량의 증류수를 사용하였으며, 시료 분석 을 행 하기 전 에 reference5]- 시 료 cell의 heat flow를 검정하였다.
5 및 1 mg/mL가 되도록 4단계로 희석한 어육 단백질 용액 3 mL를 가열 순환수조 (Model PCC-7000, EYELA, Tokyo, Japan)에서 분당 1°C 의 속도로 25°C에서 80°C까지 가열하면서 5°C 간격으로 시료를 꺼내 즉시 얼음물에 냉각시 키고 20°C에서 5분 동안 단백 질을 안정 시 킨 다음 10 虬의 l-anilio-8-naphtalene sulfo- nate(ANS) 용액을 첨가하여 excitation 파장 374 nm, emis sion 파장 485 nm에서 형광광도계 (LS-50B, Perkin Elmer, USA)로 형광의 강도를 측정하였다. 표면 소수성의 크기는 단계별로 희석한 단백질 용액의 농도에 대한 형광강도의 크기를 선형회귀로 분석하고 선형 방정식의 기울기로 표시하였다.
회수 단백질의 반응성 및 총 SH기의 변화에 미치는 pH의 영향을 알아보기 위해 pH 7, 8, 9, 10, 10.5 및 11에 용해한 갈고등어 단백 질을 20~80°C까지 l°C/min의 속도로 가열하면서 40, 60 및 80°C에서 반응성 SH기 (Fig. 6)와 총 SH기 (Fig. 7)의 변화를 측정하였다. 반응성 SH기의 수는 40과 60°C에서 pH 상승과 더불어 감소하였고 80°C에서도 pH 상승과 더불어 감소하는 경향을 보였으나, 큰 차이는 없었다.
대상 데이터
실험 에 사용한 신선한 갈고등어 (Decapterus muroadsi', 체장, 21.2±0.5 cm, 체중, 137±10 宮)는 경남 통영시 소재의 어시장에서 구입하였으며, 원양산 냉동 꼬마민어CProtonf- bea diacanthus', 체장, 21.2±1.6 cm, 체중 146±12 g)는 경남 통영시 소재 할인 매장에서 구입하였다. 냉동 꼬마 민어는 실온에서 해동한 후, 선어는 그대로 두부와 내장을 제거하고 육만을 절취 호].
데이터처리
표준편차, 유의성 검정 및 선형회귀분석은 JMP 통계 프로그램(15)으로 실시하였다.
이론/모형
ANS 소수성은 Roura 등의 방법(12)에 따라 측정하였다. 동일한 pH 용액으로 0.
SDS-PAGE는 5%의 농축 젤과 10%의 분리 젤에서 Laem- mH의 방법 (14)에 따라 실시하였다. 전기 영동이 끝난 젤은 Coomassie brilliant blue R-250에 서 하룻밤 염 색 한 후 meth- anol:acetic acid:증류수(1:1:8, v/v/v)의 탈색액으로 배경이 깨끗해질 때까지 탈색하였다.
성능/효과
갈고등어와 냉동 꼬마민어의 근원섬유단백질은 가열 온도의 상승과 더불어 소수성 잔기가 외부로 노출되고 소수성 상호작용은 60°C 부근에서 최대로 일어나지만, 근형질 단백질을 포함하는 회수단백질은 근원섬유 단백질과 ANS 소수성에서 차이를 보였다. pH가 증가함에 따라 1636 cnf'에 해당하는 peak 가 증가하였다.
갈고등어와 냉동 꼬마민어의 육 단백질을 pH 별로 용해시킨 후 10% polyacrylamide 젤에서 SDS-PAGE한 결과, 갈고등어는 pH가 상승함에 따라 mysoin heavy chain의 양은 다소 감소하면서 205 kDa과 116 kDa 사이 에 minor band 가 출현하였고, pH 11에서는 으¥ 50 kDa에 해당하는 band가 소실되었다(Fig. 10). 그리고 냉동 꼬마민어는 pH 7.
갈고등어와 냉동꼬마민어의 근원섬유 단백질을 분당 1°C 로 가열하면서 40, 60 및 80°C에서 ANS 소수성을 측정 했을 때(Fig. 1), 갈고등어의 ANS 표면 소수성은 60°C, pH 10.5에서 가장 높은 값을 나타낸 반면(Fig. la), 냉동꼬마민어는 60°C, pH 10.0에서 가장 높은 ANS 표면 소수성을 보였다 (Fig. lb). 이 같은 결과는 가열 온도 상승과 더 불어 소수성잔기가 외부로 노출되고 소수성 상호작용은 60°C 부근에서 최대로 일어나지만, 어종과 pH에 따라 소수성이 최대로 노출되는 온도 영역은 다소 차이가 있는 것으로 판단된다.
10). 그리고 냉동 꼬마민어는 pH 7.0에서 뚜렷하게 나타난 분자량 약 125kDa에 해당하는 band의 강도는 pH 상승과 더불어 감소하는 것으로 나타났고 myosin heavy chain에 해당하는 205 kDa 이상에서 몇 개의 특정적인 minor band를 관측할 수 있었다(Fig, 11). 이는 pH 10.
pH가 증가함에 따라 1636 cnf'에 해당하는 peak 가 증가하였다. 반응성 SH기 와 총 SH기 수의 차이는 pH 7.0 과 pH 10에서 비교적 큰 것으로 나타났다. SDS-PAGE 상에서 pH가 상승함에 따라 myosin heavy chain의 중합체가확인되 었다.
그리고 이 같은 변성온도는 동물에 차이가 있으며 서식 온도와 밀접한 상관이 있다고 하였다(27). 본 실험의 결과, 근원섬유단백질은 42.3, 51.7 및 60.1°C에서 최대전이 온도를 나타내어 잉어와 다소 차이는 보이는 것은 동물의 종에 따른 차이인 것으로 판단되며, 5L7°C의 peak는 myosin을 변성을 반영하는 것으로 보인다.
알칼리 공정으로 제조한 회 수단백질은 33.1, 44.3 및 65.5°C 에서 전이온도가 나타났으며, 변성 엔탈피 값은 0.0188 cal/g 으로 근원섬유단백질에서 myosin의 변성에 해당하는 온도인 51.7°C에 해당하는 peak는 보이지 않았으며 변성 엔탈피도 근원섬 유단백 질 에 비 하여 낮은 것 에 미 루어 극단적 인 알칼리 pH가 어육 단백질의 변성에 기여한 것으로 추정하였다. 자연응고 지표와 되풀림 이 지표는 엔탈피 변화에 의존하며 엔탈피변화와 젤 강도 사이 에는 상관이 없다고 하였다(28).
SDS-PAGE 상에서 pH가 상승함에 따라 myosin heavy chain의 중합체가확인되 었다. 알칼리 공정으로 제조한 회수 단백질을 시 차 주사 열량계로 분석한 결과, 회수 단백질은 33.1, 44.3 및 65.5°C 에서 전이온도가 나타나며, myosin의 변성 에 해당하는 온도인 5L7°C의 peak는 보이 지 않았다. 회 수 단백 질의 가열 젤은 극단적 인 pH 처 리 에 의 한 a -helix 구조의 P-sheet 구조 전환, 가열에 의한 S-S 결합의 형성과, myosin heavy chain 중합체 형성에 의한 것으로 보인다.
경우와 많은 차이를 보이고 있었다. 온도에 따른 반응성 SH기의 수는 거의 차이가 없었으나 pH 10.5에서 가장 높은 반응성 SH기 함량을 나타내는 것에 미루어 (Fig. 8), pH 10.5에서 내 부의 SH기 가 가장 많이 표면으로 노출되 는 것으로 판단된다. 그리고 가열 온도에 따른 총 SH기 수는 차이가 없었으나 pH 7, 8, 9에서 가장 높았고 pH 10과 11 에서는 1/3이 감소하였다(Fig.
참고문헌 (28)
Xiong YL. 1997. Structure-function relationships of muscle proteins. In Food Proteins and Their Applications. Damodaran S, Paraf A, eds. Marcel Dekker, Inc, New York. p 341-392
Shenouda SYK. 1980. Theories of protein denaturation during frozen storage of fish flesh. In Advances in food research. Chichester CO, Mark EM, Stewart GF, eds. Academic press, New York. Vol 26, p 275-311
Lanier TC. 1987. Muscle protein functional properties and protease content of surimi prepared from fatty, dark-fleshed fish species. In Fatty fish utilization: upgrading from feed to food. Proceedings of a national technical conference in Raleigh. NC, USA. p 247-262
Snow GW. 1992. Development of under-utilized species in Atlantic Canada. In Seafood science and technology. Bligh EG, ed. Fishing News Books, Cambridge, MA, USA. p 149-153
Krishnamurthy G, Chang H-S, Hultin HO, Feng Y, Srinivasan S, Kelleher SD. 1996. Solubility of chicken breast muscle proteins in solutions of low ionic strength. J Agric Food Chem 44: 408-415
Kristinsson HG, Hultin HO. 2003. Role of pH and ionic strength on water relationships in washed minced chicken- breast muscle gels. J Food Sci 68: 917-922
Park JD, Jung C-H, Kim J-S, Cho D-M, Cho MS, Choi YJ. 2003. Surimi processing using acid and alkali solubilization of fish muscle protein. J Korean Soc Food Sci Nutr 32: 400-405
Park JD, Yoon S-S, Jung C-H, Cho MS, Choi YJ. 2003. Effect of sarcoplasmic protein and NaCl on heating gel from fish muscle surimi prepared by acid and alkaline processing. J Korean Soc Food Sci Nutr 32: 567-573
Lanier TC. 1992. Measurement of surimi composition and functional properties. In Surimi Technology. Lanier TC, Lee CM, eds. Marcel Dekker Inc, New York. p 123-163
Roura S, Saavedra JP, Truco R, Crupkin M. 1992. Conformational change in actomyosin from post-spawned hake stored on ice. J Food Sci 57: 1109-1111
Ogawa M, Nakamura S, Horimoto Y, An H, Tsuchiya T, Nakai S. 1999. Raman spectroscopic study of changes in fish actomyosin during setting. J Agric Food Chem 47: 3309-3318
Bouraoui M, Nakai S, Li-Chan E. 1997. In situ investigation of protein structure in Pacific whiting surimi and gels using Raman spectroscopy. Food Research International 30: 65- 72
Hossain MI, Itoh Y, Morioka K, Obtatake A. 2001. Inhibiting effect of polymerization and degradation of myosin heavy chain during preheating at 30oC and 50oC on the gel- forming ability of walleye pollack surimi. Fisheries Science 67: 718-725
Kimura I, Sugimoto M, Toyoda K, Seki N, Arai K, Fujita T. 1991. A study on the cross-linking reaction of myosin in Kamaboko 'suwari' gels. Nippon Suisan Gakkaihsi 57: 1389-1396
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