[논문]혈소판농축혈장이 조골세포주의 세포증식 및 분화에 미치는 영향에 대한 연구

정태욱; 장경수; 김창회; 김영수

문제 정의

본 논문은 세포배양실험을 통해서 골형성과정의 초기부착 이후의 단계인 증식 및 분화과정에서 혈소판농축혈장이 어떤 기전으로 조골세포에 영향을 미치는 지를 알아보고자 계획되었다 일동안의 세 . 5포배양을 통해서 혈소판농축혈장의 농도에 따른 조골세포주의 증식변화를 관찰하였고 혈소판농축혈장의 효과를 알아보기 위해서 조 autocrine, paracrine 건배지를 제작하여 혈소판농축혈장과 비교 평가하였다 세포분화에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 . alkaline phosphatase의 활동성을 혈소판농축혈장과 조건배지를 첨가하여 측정하였고 이를 서로 비교 , 평가하였다 이후 다음과 같은 결과를 얻었다 .
이 혈소판농축혈장이 가지는 생물학적 효용성에 대해서는 논란의 여지가 여전히 존재하지만 많은 임상연구를 통해 혈소판농축혈장이 창상치유를 촉진시킨다는 것은 사실로 받아들여지게 되었다 임플랜트가 식립되면 골과의 계면에서 세포부착(cellular attachment), (secretion of bone 골기질 단백질의 분비 matrix protein), (mineralization of bone 골기질 경화 matrix)등의 일련의 골형성 과정이 일어나는데 여기에도 혈소판농축혈장은 효과적으로 이용될 수 있다. 본 논문은 세포배양실험을 통해 혈소판농축혈장이 조골세포에 미치는 생물학적 영향을 알아보고자 하였다. 이전 논문을 통해서는 골형성 과정의 초기 단계인 세포부착과정이 혈소판농축혈장의 첨가로 촉진된다는 사실을 알 수가 있었다.
본 논문은 세포배양실험을 통해서 골형성과정의 초기부착 이후의 단계인 증식 및 분화과정에서 혈소판농축혈장이 어떤 기전으로 조골세포에 영향을 미치는 지를 알아보고자 계획되었다 일동안의 세 . 5포배양을 통해서 혈소판농축혈장의 농도에 따른 조골세포주의 증식변화를 관찰하였고 혈소판농축혈장의 효과를 알아보기 위해서 조 autocrine, paracrine 건배지를 제작하여 혈소판농축혈장과 비교 평가하였다 세포분화에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 .
이전 논문을 통해서는 골형성 과정의 초기 단계인 세포부착과정이 혈소판농축혈장의 첨가로 촉진된다는 사실을 알 수가 있었다. 이에 본 논문은 혈소판농축혈장이 조골세포의 증식과 분화에는 어떤 영향을 끼치는지를 알아보기 위해서 계획되었다.

제안 방법

조골세포주를 2×104 cells/mL 96 well 의 농도로 culture plate 10% 에 분주한 후 어린 송아지 혈청이 포함된 배지를 이용하여 세포를 DMEM/F-12 34 , ℃5% CO2, 100% 습도의 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였다 세포 분주 후 시간이 지나 세포가 배양접시에 안착이 되면 어린 송아지 혈청이 포함되지 않은 으로 교체하여 시간 동안 배 DMEM 12양기에서 배양하였다 이 후 실험군에는 . , 1ul/mL, 3ul/mL, 5ul/mL, 10ul/mL의 혈소판농축혈장과 1ul/mL, 3ul/mL, 5ul/mL, 10ul/mL의 혈소판농축혈장 조건배지를 첨가하였으며 세포 배양 후 일 일 1 , 2 , 3일 일 일째 되는 날 각각 를 시행 하 , 4 , 5 MTT assay 였다 분석법은 노란색을 띠는 이라 . MTT tetrazolium 는 물질이 대사활동이 활발한 세포내에 존재하는 탈수소효소 에 의하여 갈색을 띠는 (dehydrogenase) formazan이라는 물질로 전환되는 성질을 이용한 것으로 반응 후 형성된 의 양은 흡광도를 통 formazan 해서 측정한다 이 흡광도는 살아있는 세포수와 정 .
2). ATCC에서 세포 구입당시 보내준 protocol 대로 2.5mM L-glutamine(SIGMA, St.Louis, MO, USA), 15mM HEPES (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 0.5mM sodium pyruvate(SIGMA, St.Louis, MO, USA), 1.2g/L sodium bicarbonate (SIGMA, St.Louis, MO, USA), 0.3mg/mL G418(Gentamycin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 배양액에 첨가하였으며 5% CO₂하에서 습도의 조건이 유지되는 세포배양기(Multi Gas CO₂ incubator, ASTEC, Fukuoka, Japan)에서 배양하였다(Fig.3). 공급사에서 보고한 세포가 두 배로 증식하는 시간(doubling time)은 36시간이었다.
MTT CellTiter 96ⓡ AQueous One Solution Reagent(Promega, Madison WI, USA) . MTT 을 사용하였다 실험배지에 분석시약을 각각 를 첨가하고 20uL 34 , 5% CO ℃ 2, 100% 2 습도가 유지되는 배양기에서 시간동안 배양한 후 에서의 흡광도를 분광측정기 490nm (sphectrophotometer, GeneSecIII, Hitachi, Japan)를 이용하여 측정하였다.
5포배양을 통해서 혈소판농축혈장의 농도에 따른 조골세포주의 증식변화를 관찰하였고 혈소판농축혈장의 효과를 알아보기 위해서 조 autocrine, paracrine 건배지를 제작하여 혈소판농축혈장과 비교 평가하였다 세포분화에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 . alkaline phosphatase의 활동성을 혈소판농축혈장과 조건배지를 첨가하여 측정하였고 이를 서로 비교 , 평가하였다 이후 다음과 같은 결과를 얻었다 . .
5) 2500 rpm(1400g) 10 으로 분간 원심분리를 시행하여 적혈구층을 혈액분리대(blood separation stand) . 를 이용하여 분리해 내었다 적혈구층을 분리한 후 나머지 혈장을 상온에서 으로 3000rpm(2010g) 15분간 두 번째 원심분리를 시행하여 가량의 50mL 혈소판농축혈장을 얻었다 얻은 혈소판농축혈장을 . -70 (deep freezer) ℃ 초저온냉동기 에 보관하였다가 실험에 사용하였다 혈소판농축혈장을 얻는 (Fig.
식과 분화과정에 있어서의 혈소판농축혈장의 영향을 알아보기 위해서 계획되었다 증식과정은 세포 . 배양을 일 동안 시행 분석을 통해 비교 평가 5 , MTT 하였고 분화과정은 조골세포가 일련의 분화단계에서 생성하는 단백질을 측정해서 관찰하였다 참고 . 로 조골세포는 일련의 골형성 과정속에서 그 분화 단계에 특이한 골기질 단백질을 생성해 낸다 분화 .
3. (conditioned 혈소판농축혈장의 조건배지 medium)의 제조

조골세포주를 100mm2의 세포배양접시(cell culture dish: Falcon, Becton Dickinson, USA)에 80-90%로 충만해질 때가지 배양한 후 어린송아지 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체하여 5ml DMEM 48시간 동안 세포배양기하에 정치하였다가 100ul/mL의 혈소판농축혈장을 배양액에 추가하여약 시간 정도 혈소판농축혈장에 세포를 노출시킨 2후 다시 어린송아지 혈청이 포함되어있지 않은 , 5ml DMEM 24 의 배지로 교체하여 시간 동안 배양기 하에 둔 뒤 배양액을 모았다 이렇게 하여 (Fig.8). 모아진 배양액속의 단백질은 혈소판농축혈장에 의해 활성화된 조골세포주로부터 유리된 단백질이라할 수 있다.
조골세포주를 2×104 cells/mL 96 well 의 농도로 culture plate 10% 에 분주한 후 어린 송아지 혈청이 포함된 배지를 이용하여 세포를 DMEM/F-12 34 , ℃5% CO2, 100% 습도의 조건이 유지되는 세포배양기에서 배양하였다 세포 분주 후 시간이 지나 세포가 배양접시에 안착이 되면 어린 송아지 혈청이 포함되지 않은 으로 교체하여 시간 동안 배 DMEM 12양기에서 배양하였다 이 후 실험군에는 . , 1ul/mL, 3ul/mL, 5ul/mL, 10ul/mL의 혈소판농축혈장과 1ul/mL, 3ul/mL, 5ul/mL, 10ul/mL의 혈소판농축혈장 조건배지를 첨가하였으며 세포 배양 후 일 일 1 , 2 , 3일 일 일째 되는 날 각각 를 시행 하 , 4 , 5 MTT assay 였다 분석법은 노란색을 띠는 이라 .
혈소판농축혈장 제조를 위하여 의 항응고제 56mL 인 citrate phosphate dextrose adenine (CPDA)가 든 채혈주머니 에 신체 건강한 (blood collection bag) (Fig.4) 실험자 한명의 전혈을 직접 채혈하여 총 의 400mL 채혈주머니를 만들었다 이것을 실온에서 . IEC central GP8R centrifuge (IEC, International Equipment Company, Needham Heights, MA, USA)를 이용하여 (Fig.

대상 데이터

사람의 조골세포주(osteoblast cell line) 를 American Type Culture Collection (CRL-11372, ATCC, Manassas, USA) 회사에서 구입하고(Fig.1), 10%의 어린송아지 혈청 (fetal bovine serum; FBS: Gibco, Carlsbad, CA, USA)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12; GibCo, Carlsbad, CA, USA)이 든 조직배양플라스크(Tissue culture flask 75cm², SARSTEDT, Newton, USA)에서 키웠다(Fig.2). ATCC에서 세포 구입당시 보내준 protocol 대로 2.

데이터처리

각각의 실험은 번씩 반복되었으며 각 실험에서 5얻어진 흡광도의 값은 평균값을 표시하였다 각 군 . 간의 비교를 위해서 를 사용하였다 Student's t-test . P 값이 이하인 경우에는 유의성 있는 차이가 있 0.

성능/효과

1. 혈소판농축혈장의 농도가 증가할수록 세포증식은 증가하였다.
2. 혈소판농축혈장의 조건배지 농도가 증가할수록 세포증식은 증가하였으며 증가량과 증가 양상은 혈소판농축혈장군과 비슷하였다.
3. 혈소판농축혈장을 첨가하였을 때 조골세포주의 alkaline phosphatase 활동성의 증가양상 이 관찰되었다.
4. 혈소판농축혈장의 조건배지를 첨가하였을 경우에도 의 활동성의 증 가양상이 alkaine phosphatase 관찰되었으며 증가량과 증가양상은 혈소판농축 혈장군과 비슷하였다.
Table 6은 혈소판농축혈장의 조건배지 농도를 1ul/mL, 3ul/mL, 5ul/mL, 10ul/mL로 달리하여 배지에 첨가하였을 때 측정된 의 활동성 alkaline phosphatase 의 변화를 보여주고 있다 혈소판농축혈장과 마찬 . 가지로 모든 군에서 통계적으로 유의한 활동성의 증가가 관찰되었다(p<0.05).
9,10 와 은 혈소판농축혈장의 농도에 따른 세포증식의 변화를 보여주고 있다 시간이 지 . 나면서 대조군에 비해서 높은 세포증식을 관찰할수 있었고 농도가 증가함으로써 세포증식도 상대적으로 증가하고 있는 양상을 관찰할 수 있었다 이러 . 한 결과들은 혈소판농축혈장내에 조골세포의 증식에 직접적인 영향을 끼치는 특정요소들이 존재하고 있음을 말해준다 혈소판농축혈장의 생물학적인 효 .
Table 5 1ul/mL, 3ul/mL, 5ul/mL, 10ul/mL alkaline 의 농도로 첨가하였을 때 phosphatase 활동성의 변화된 값을 보여주고 있다. 모든 군에서 통계적으로 유의한 활동성의 증가가 관찰되었으며 혈소판농축혈장의 농도가 증가할수록 활동성도 높아졌다(p<0.05).
가지로 분화과정에서도 조골세포는 autocrine, paracrine 효과를 이용하여 세포들의 치유능의 향상과 지속성을 극대화 한다는 것을 말해주고 있다. 이상과 같은 결과들을 바탕으로 혈소판농축혈장이 조골세포의 증식 분화과정을 촉진한다는 것을 , 알 수가 있었으며 아울러 조골세포의 autocrine, paracrine 효과에 의해서 이 효과가 더욱 더 극대화 된다는 것을 알 수가 있다.
이상과 같은 결과를 통해서 혈소판농축혈장은 조골세포의 증식과 분화를 촉진시키며 이 반응은 조골세포의 효과에 의해서 더욱 더 autocrine, paracrine 극대화된다고 결론을 내릴 수 있다 이는 혈소판농 . 축혈장이 이전에 보고한 세포부착의 증진효과와 더불어 임플랜트 주변의 골형성과정을 촉진하여 골질이 좋지 않은 경우에도 보다 빠르고 양호한 골융합의 결과를 얻을 수 있음을 말해준다.
서 시간에 따라 값이 증가 일째 최대 값을 보이다 , 45 . 일째 감소되는 양상을 보였다 아울러 혈소판농축 혈장의 농도가 커질수록 세포증식이 증가하는 양상을 보였다.
이상과 같은 결과를 통해서 혈소판농축혈장은 조골세포의 증식과 분화를 촉진시키며 이 반응은 조골세포의 효과에 의해서 더욱 더 autocrine, paracrine 극대화된다고 결론을 내릴 수 있다 이는 혈소판농 . 축혈장이 이전에 보고한 세포부착의 증진효과와 더불어 임플랜트 주변의 골형성과정을 촉진하여 골질이 좋지 않은 경우에도 보다 빠르고 양호한 골융합의 결과를 얻을 수 있음을 말해준다.

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