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문제 정의
- 따라서, 피부에 대한 자극이 거의 없으면서 미백효과가 우수한 천연 원료에 대한 연구가 지속되어 왔다. 이에 본 연구는 종래의 미백 원료들이 가지고 있는 문제점을 해결하고 보다 미백 효과가 뛰어난 원료를 찾기 위하여 식물 조직배양으로부터 얻어진 산삼부정근을 그 대상으로 삼았다.
- 식물 뿌리의 경우 발생학적으로 뿌리 이외의 기관인 줄기나 잎에서 생긴 뿌리와 오래된 뿌리에서 나온 뿌리를 부정근이라 하며 정상적인 발생 과정에서 생성된 겉 뿌리를 정근이라 한다. 최근에 조직 배양을 이용한 산삼 부정근의 생산이 가능해짐에 따라 본 연구는 천연산삼의 부정근을 인공적으로 조직 배양하여 얻은 산 삼부정근 추출물에 대한 화장품 원료로서의 효능. 효과를 살펴보았다.
제안 방법
- 2명의 시험자가 주관적으로 모든 피시험자들을 4주, 8주 후의 피부의 흑화도를 관찰하였으며 시료 도포 전과 비교하여 9개 등급으로 나누어 점수를 기록하였다.
- 용해된 melanin을 PBS로 적당량 희석하여 ELISA Teader로 475nm에서 흡광도를 측정하여 melanin 저해율을 측정하였다. 그리고 video micro- scope를 이용하여 사진촬영 후 미백 활성을 육안으로 확인하였다[Figure 2]
- Black mouse에서 유래된 B-16 melanoma를 10% FBS (Gibco)가 함유된 DMEM (Gibco)으로 6wel1에 세포 수 2ｘ104 cells/ well의 농도로 각 well에 2 mL씩 첨가하고 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 24h 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 10% FBS, 0.2 mM a-MSH (Sigma)와 2 mM theophylline (Sigma)이 함유된 DMEM으로 교체한 후 조직 배양한 산삼부정근 추출물을 동일 배지로 적당량 희석한 후 각각 첨가하고 나서, 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 세포가 약 90% 이상 될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음 PBS로 세척하고 tiypsiii으로 처리하여 세포 pellet을 회수하였다.
- 시험자가 Mexameter (Courage+Khazaka Electronic GmbH, Germany)를 이용하여 시료 도포 전과 도포 후의 흑화도 변화정도를 측정하였다. 시료 도포 부위에 3회 반복 측정하여 그 평균값을 구하고 비교하였다.
- 시험자가 Mexameter (Courage+Khazaka Electronic GmbH, Germany)를 이용하여 시료 도포 전과 도포 후의 흑화도 변화정도를 측정하였다. 시료 도포 부위에 3회 반복 측정하여 그 평균값을 구하고 비교하였다.
- 상등액이 제거된 pellet을 60℃ 항온기에서 24h 건조시킨 후 1 N NaOH를 첨가하여 세포 내의 melanin을 용해시켰다. 용해된 melanin을 PBS로 적당량 희석하여 ELISA Teader로 475nm에서 흡광도를 측정하여 melanin 저해율을 측정하였다. 그리고 video micro- scope를 이용하여 사진촬영 후 미백 활성을 육안으로 확인하였다[Figure 2]
- 조직배양된 산삼부정근 추출물에 대하여 B-16 mela- noma를 이용하여 미백효과를 측정하였다. Black mouse에서 유래된 B-16 melanoma를 10% FBS (Gibco)가 함유된 DMEM (Gibco)으로 6wel1에 세포 수 2ｘ104 cells/ well의 농도로 각 well에 2 mL씩 첨가하고 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 24h 배양하였다.
- 피시험자 20~40대 여성 29명을 대상으로 placebo와 sample (2% 산삼 부정근추출물 함유)를 8주 동안 1일 2회 도포하도록 하였다. 피시험자의 등 부위에 UVB를 조사하고 16—24h 후에 최소홍반량(minimal erythemal dose: MED)을 구하였다.
- 피시험자 20~40대 여성 29명을 대상으로 placebo와 sample (2% 산삼 부정근추출물 함유)를 8주 동안 1일 2회 도포하도록 하였다. 피시험자의 등 부위에 UVB를 조사하고 16—24h 후에 최소홍반량(minimal erythemal dose: MED)을 구하였다.
대상 데이터
- 110년산 천종산삼(강원도 평창에서 채취)의 식물체로부터 유래된 캘러스에서 유도한 부정근을 발근에 적합한 생장 호르몬 IBA(Indole-3-butyric acid) 5.0 mg/L (Duchefa), 5% sucrose가 함유한 Murashige & Skoog medium (Duchefa)에서 현탁 배양하였다[Figure 1].
- 조직배양된 산삼부정근 추출물에 대하여 B-16 mela- noma를 이용하여 미백효과를 측정하였다. Black mouse에서 유래된 B-16 melanoma를 10% FBS (Gibco)가 함유된 DMEM (Gibco)으로 6wel1에 세포 수 2ｘ104 cells/ well의 농도로 각 well에 2 mL씩 첨가하고 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 24h 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 10% FBS, 0.
데이터처리
- 각 시료간의 미백효과의 차이를 확인하기 위하여 SAS system으로 mixed procedure를 시행하였고 시간을 고려한 미백효과의 전체적인 차이에 대한 유의성을 확인하기 위해 repeated measure ANOVA를 시행하였다. 그리고 각 측정 시기마다 대조군과 처리군 사이의 미백효과 차이를 확인하기 위하여 unpaired t-test를 시행하였다.
- 각 시료간의 미백효과의 차이를 확인하기 위하여 SAS system으로 mixed procedure를 시행하였고 시간을 고려한 미백효과의 전체적인 차이에 대한 유의성을 확인하기 위해 repeated measure ANOVA를 시행하였다. 그리고 각 측정 시기마다 대조군과 처리군 사이의 미백효과 차이를 확인하기 위하여 unpaired t-test를 시행하였다.
이론/모형
- 산삼 부정근 및 산삼, 인삼, 홍삼 추출물에 대한 hydroxyl radical 억제효과를 알아보기 위하여 DPPH assay를 실시하였다. 산삼 부정근 추출물의 경우 0.
- 산삼 부정근 추출물 및 산삼, 인삼, 홍삼 추출물에 대한 hydroxyl radical 억제효과를 알아보기 위하여 DPPH assay를 실시하였다. 산삼 부정근 추출물의 경우 0.
성능/효과
- (1) 산삼 부정근 추출물은 미백효과 실험에서 가장 두드러진 효과를 보여주었다.
- (2) 산삼, 인삼, 장뇌삼의 saponin류에 대한 B-16 melanoma 내 melanin 생성억제 효과 및 tyrosinase inhibition 효과가 없는 것으로 나타났다.
- (3) 2% 산삼부정근 추출물의 임상실험 결과에서도 4주 및 8주 경과 후 visual assessment (육안평가)에서 4주 경과 후 두 group간의 비교치가 신뢰도 99.9% 수준에서 통계적 유의차(p = 0.0004)를 보여주었으며 8주 경과 후에는 신뢰도 99.9% 통계적 유의차(p = 0.0005)를 보여주었다. 기기 평가에서도 4주 경과 후 두 group간의 비교치가 신뢰도 99% 수준에서 통계적 유의차(p = 0.
- (4) 산삼부정근 추출물의 DPPH assay 결과, 높은 hydroxyl radical에 대한 활성 억제효과를 확인하였다. 반면에 산삼, 인삼 및 홍삼의 경우 낮은 hydroxyl radical에 대한 활성 억제효과를 보여주었다.
- 5% 농도에서 보다 높은 수치이다. 0.5% 인삼 추출물의 경우에는 13%의 낮은 억제율을 보여주었으며 인삼 및 홍삼을 농축한 경우에도 각각 17% 및 25%으로 산삼 부정근 추출물 및 농축액과는 현저한 차이를 보여주었다[Table 2], 그리고 산삼, 인삼, 장뇌삼의 saponin 3종을 0.02% 농도로 처리한 후 B-16 melanoma 내의 melanin 생성 억제율을 측정한 결과 melanin생성 억제효과를 보여주지 못하였다[Table 3].
- 이전에 실시한 실험과 비교해보면 산삼 부정근 추출물은 tyrosinase inhibition 효과보다 dopa auto-oxidation에서의 억제 효과가 보다 현저하였다. 1% 산삼 부정근 추출물 및 농축액의 경우 각각 62% 및 95%의 dopa autooxidation 억제효과를 보여주었으나 인삼 추출물 및 농축액의 경우 7%이내로 dopa auto-oxidation 억제효과가 거의 나타나지 않았다. 위의 결과를 토대로 산삼부 정근 추출물은 적어도 tyrosinase뿐만 아니라 melanin을 형성하는 생합성 과정 중 oxidation이나 hydroxylation 에 영향을 주는 것을 알 수 있다.
- 2% 산삼 부정근 추출물을 함유한 sample과 산삼 부정근 추출물을 함유하지 않은 placebo를 이용한 임상실험 결과에서도 각각의 제품사용 전과 사용 후 4주 및 8주 경과 후 결과치가 통계적으로 유의한 차이를 보여주었으며 두 group간의 차이도 통계적으로 유의한 차이를 보여주었다. Visual assessment (육안평가)에서 4주 경과 후 두 group 간의 향상도 차이는 66%로 나왔으며 신뢰도 99.
- 2명의 시험자가 주관적으로 모든 피시험자들을 4주, 8주 후의 피부의 흑화도를 관찰한 값은 placebo 및 sample (2% 산삼 부정근추출물 함유) 모두 사용 전에 비하여 4주, 8주 때 통계학적으로 유의있는 차이를 보이고 있으며 두 제품 간의 4주, 8주 후의 미백효과 차이를 비교했을 때 sample이 placebo비하여 미백효과가 더 좋은 것으로 나타났다. 또한 통계학적으로도 유의있는 차이를 보여주었다[Table 6].
- B~16 melanoma을 이용한 세포 내 melanin 생성 억제율 및 tyrosinase inhibition test에서 인삼, 홍삼 추출물 및 농축액보다 현저한 효과를 보여주었다.
- Placebo 및 sample 모두 각각 도포 전에 비교하여 4주 8주 후 미백효과가 통계학적으로 유의있는 차이를 보여주었다. Placebo와 sample의 시료 도포 4주와 8주 후 미백효과의 차이를 비교했을 때 sample이 placebo에 비하여 미백효과가 더욱 좋은 것으로 나타났으며 이는 통계 학적으로 유의있는 차이를 보였다. 이러한 통계 수치는 시료 도포 4주 이후 시간이 지날수록 placebo와 비교하였을 때 더욱 큰 차이를 보였으며 sample의 미백 효과가 좋은 것으로 나타났다[Table 7].
- 2% 산삼 부정근 추출물을 함유한 sample과 산삼 부정근 추출물을 함유하지 않은 placebo를 이용한 임상실험 결과에서도 각각의 제품사용 전과 사용 후 4주 및 8주 경과 후 결과치가 통계적으로 유의한 차이를 보여주었으며 두 group간의 차이도 통계적으로 유의한 차이를 보여주었다. Visual assessment (육안평가)에서 4주 경과 후 두 group 간의 향상도 차이는 66%로 나왔으며 신뢰도 99.9% 수준에서 통계적 유의차(p = 0.0004를 보여주었다. 그리고 8주 경과 후에는 38%의 차이가 발생하였으며 신뢰도 99.
- 0004를 보여주었다. 그리고 8주 경과 후에는 38%의 차이가 발생하였으며 신뢰도 99.9% 수준에서 통계적 유의차(p = 0.0005)를 보여주었다[Table 6]. 기기평가에서도 4주 경과 후 두 group간의 향상도 차이는 58%로 나왔으며 신뢰도 99% 수준에서 통계적 유의차(P = 0.
- 0005)를 보여주었다. 기기 평가에서도 4주 경과 후 두 group간의 비교치가 신뢰도 99% 수준에서 통계적 유의차(p = 0.0044)를 보여주 었으며 8주 경과 후에는 신뢰도 99% 수준에서 통계적 유의차(p = 0.0028)를 보여주었다.
- 0005)를 보여주었다[Table 6]. 기기평가에서도 4주 경과 후 두 group간의 향상도 차이는 58%로 나왔으며 신뢰도 99% 수준에서 통계적 유의차(P = 0.0044)를 보여 주었다. 또한 8주 경과 후에는 59%의 차이가 발생하였으며 신뢰도 99% 수준에서 통계적 유의차(p = 0.
- 마찬가지로 tyrosinase inhibition test에서도 같은 농도의 인삼 추출물 및 농축액의 경우 7% 이내로 거의 tyrosinase inhibition 효과가 없는 것으로 나왔으며 홍삼 농축액의 경우에도 12%로 매우 낮은 억제율을 보여준 반면에 산삼 부정근 추출물 및 농축액의 경우 35% 및 45%의 억제효과를 보여주고 있다. 또한 B-16 melanoma 내의 melanin 생성억제 실험결과에서와 같이 saponin 5종에서 모두 7% 이내의 매우 낮은 억제효과를 보여주었다. 위에서도 언급했듯이 산삼 부정근 추출물의 미백 효과가 saponin 계통에 의한 것이기보다는 다른 성분에 의해 특히 인삼이나 홍삼 내에는 많이 존재하지 않는 성분에 의한 것임을 다시 한번 보여주는 결과이다.
- B-16 melanoma을 이용한 세포 내 melanin 생성 억제율 실험에서 같은 농도의 다른 인삼 추출물 및 농축액 그리고 홍삼 농축액에 비해서도 현저한 미백효과를 보여주고 있다. 또한 같은 농도의 arbutin보다도 13% 더 높은 melanin 생성 억제 효과를 보여주었다(Table 2). 반면에 산삼, 인 삼, 장뇌삼의 saponin 3종에 대한 BT6 melanoma 내의 melanin 생성억제 효과가 7% 이내로 매우 낮게 나타났다 (Table 3).
- 산삼 부정근 농축액은 1% 농도에서 45%의 tyrosinase 억제효과를 보였다. 반면에 인삼 추출물 및 농축액은 각각 5% 및 7%로 매우 낮은 억제 효과를 보여주었다. 홍삼 농축액의 경우에도 산삼 부정근 추출물 및 농축액보다 상대적으로 매우 낮은 억제효과를 보여주었다.
- 2%에서 각각 86%, 90% 및 94%의 높은 hydroxyl radical에 대한 활성 억제효과를 보여주었다. 반면에 인삼의 경우에도 동일한 농도에서 8% 이내로 hydroxyl radical에 대한 활성 억제 효과가 매우 낮았으며 산삼 및 홍삼의 경우에도 25% 이내의 다소 낮은 hydroxyl radical에 대한 활성 억제효과를 보여주었다. 그러나 0.
- 홍삼 농축액의 경우에도 산삼 부정근 추출물 및 농축액보다 상대적으로 매우 낮은 억제효과를 보여주었다. 산삼, 인삼, 장뇌삼의 saponin 5종을 0.5% 농도로 처리한 결과 6%이하의 낮은 억제효과를 보여주었다[Table 5].
- 산삼 부정근이 산삼 및 홍삼보다 낮은 농도에서 현저한 효과를 보여주는 것은 산삼 부정근이 산삼, 홍삼 및 인삼 내에는 존재하지 않거나 많이 존재하지 않는 성분을 가지고 있음을 암시해 주고 있다. 위에서 살펴본 미백효과 실험에도 산삼 부정근이 인삼 및 홍삼보다 현저한 효과를 보여주었다.
- 0028)를 보여주었다[Table 7]. 위의 결과로 산삼부정근 추출물이 임상에서도 현저한 미백효과가 있음을 보여주었다.
- 1% 산삼 부정근 추출물 및 농축액의 경우 각각 62% 및 95%의 dopa autooxidation 억제효과를 보여주었으나 인삼 추출물 및 농축액의 경우 7%이내로 dopa auto-oxidation 억제효과가 거의 나타나지 않았다. 위의 결과를 토대로 산삼부 정근 추출물은 적어도 tyrosinase뿐만 아니라 melanin을 형성하는 생합성 과정 중 oxidation이나 hydroxylation 에 영향을 주는 것을 알 수 있다.
- Placebo와 sample의 시료 도포 4주와 8주 후 미백효과의 차이를 비교했을 때 sample이 placebo에 비하여 미백효과가 더욱 좋은 것으로 나타났으며 이는 통계 학적으로 유의있는 차이를 보였다. 이러한 통계 수치는 시료 도포 4주 이후 시간이 지날수록 placebo와 비교하였을 때 더욱 큰 차이를 보였으며 sample의 미백 효과가 좋은 것으로 나타났다[Table 7].
- 반면에 인삼 추출물 및 농축액은 각각 5% 및 7%로 매우 낮은 억제 효과를 보여주었다. 홍삼 농축액의 경우에도 산삼 부정근 추출물 및 농축액보다 상대적으로 매우 낮은 억제효과를 보여주었다. 산삼, 인삼, 장뇌삼의 saponin 5종을 0.
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