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문제 정의
- 조직공학에 의한 골조직의 형성을 위해 골 생성을 유도하는 골아전구세포, 이런 세포들이 적당한 위치에서 증식 분화할 수 있는 담체, 그리고 골조직 형성의 유도분화를 촉진하는 골유도 성장인자들이 필요하다.23 이에 본 연구팀은 소장점막하 조직이 혼합된 PLGA 담체, 24 항생제인 겐타마이신이 혼합된 PLGA 담체, 쯔 신경성장인자가 혼합된 PLGA 담체, 26, 27 및 비타민 %가 함유된 PLGA 담체, 2829 이프리 플라본을 함유한 담체 등을30 제조하여 이들의 싸이토카 인류가 조직성장에 미치는 영향에 대하여 고찰하였다. 또 한 이전 실험에서 DBP를 이용하여 DBP 및 DBP를 함유한 PLGA 담체가 생체 내에서 새로운 골형성을 유도한다는 것을 확인하였다31
- In vivo 환경에서의 골 형성 효과. PLA와 PLGA에 DBP를 함유시킨 지지체를 제조하고 여기에 골수간엽줄 기세포를 파종시켜 골분화 정도를 확인하고자 하였다. 면 역 결핍 누드마우스의 피하에 지지체를 삽입하고 4주 후 꺼내어 조직을 10% 포르말린 수용액으로 고정한 후 3 ㎛로 절단하여 슬라이드에 고정시키고 H&E, von Kossa 염색을 하였다.
- 본 연구에서는 생체적합성 고분자인 PLA와 PLGA에 골형성 자극을 가지는 DBP를 함유시켜 다공성 지지체를 제조하여 골조직 공학에 응용하고자 하였다.
- 이러한 일련의 연구를 바탕으로 본 연구에서는 PLA 및 PLGA 담체의 생체활성력이 결여되어 있는 단점을 개선하고자, 그리고 골형성 자극을 가지는 DBP를 응용함으로써 골형성 촉진을 꾀하려 하였다. 또한 골수간엽줄기세 포 (bone-marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs) 가 골형성에 미치는 영향을 확인하려 하였다 DBP와 PLGA 를 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 다공성 지지체를 제조하였고32 특성 결정 방법으로 주사전자현미 경(scan ning electron microscopy, SEM)으로 다공형태 및 크기를 관찰하였다.
제안 방법
- 골수간엽 줄기 세포의 조골세포로의 분화는 골분화 배지 (DMEM+10% FBS + 1% 항생제+ 10 mM 0글리세롤포스페이트+10-8 M 덱사메타손+10』M 비타민 D3)< 이용하였다. 4주 후 Wright-Giemsa, Alizarin red, von Kossa 염색을 통하여 조 골세포로의 분화를 확인하였다. 골분화 배지는 4가지 그룹으로 나누어 &글리세롤포스페이트 덱사메타손, 비타민 D3의 인자가 조골세포로의 분화에 미치는 영향을 알아보았다 (Table 2).
- 또한 DBP 주위에 매크로파지로 사료되는 대식세포의 형성을 확인할 수 있고, 이는 DBP가 어느 정도의 감염반응을 일으키기 때문이라 사료된다. DBP가 골형성에 영향을 주는지 더 정확히 확인하기 위하여 칼슘형성을 확인할 수 있는 von Kossa 염색을 실시하였다. von Kossa 염색결과 PLA와 PLGA 지지체에서는 칼슘형성을 확인하지 못하였다.
- In vivo 환경에서의 골형성 효과. In vivo 환경에서의 조직공학적 골형성을 관찰하기 위하여 면역결핍 쥐를 이용하여 실험하였다. 생후 4주된 쥐의 등쪽 부분을 2~3 cm 정도 절개하고 PLA, PLA/DBP, PLGA 및 PLGA/DBP 지지체와 여기에 BMSCs를 1X105개/cell을 파종시킨 PLA/ BMSCs, PLA/DBP/BMSCs, PLGA/BMSCs, 및 PLGA/DBP/ BMSCs를 이식하고, 4주가 지난 후에 지지체를 10% 포르말린에 고정하였다.
- 용매 캐스팅/염 추출법을 이용한 다공성 지지체의 제조 PLA, PLA/DBP (50%), PLGA, 및 PLGA/DBP (50%) 다공성 지지체는 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다. 먼저 PLA 및 PLGA를 MC에 일정 농도로 용해 한 후 각각 DBP를 일정량 첨가하고 여기에 다공생성 물질인 염화나트륨을 분자체로 선별된 (180-250 ㎛, 250 ~355 ㎛) 염화나트륨을 일정 비율로 혼합하였다 (Table 1).
- 생후 4주된 쥐의 등쪽 부분을 2~3 cm 정도 절개하고 PLA, PLA/DBP, PLGA 및 PLGA/DBP 지지체와 여기에 BMSCs를 1X105개/cell을 파종시킨 PLA/ BMSCs, PLA/DBP/BMSCs, PLGA/BMSCs, 및 PLGA/DBP/ BMSCs를 이식하고, 4주가 지난 후에 지지체를 10% 포르말린에 고정하였다. 고정된 지지체를 파라핀 블록을 제작한 후에 3 ㎛로 자른 후 슬라이드에 고정하고 조직학적 평가를 하기 위하여 H&E 염색과 von Kossa 염색을 실시하였다.
- 4주 후 Wright-Giemsa, Alizarin red, von Kossa 염색을 통하여 조 골세포로의 분화를 확인하였다. 골분화 배지는 4가지 그룹으로 나누어 &글리세롤포스페이트 덱사메타손, 비타민 D3의 인자가 조골세포로의 분화에 미치는 영향을 알아보았다 (Table 2). 그룹 I은 성장배지 (DMEM)에 β글리 세롤포스페이트를 첨가한 것이고, 그룹 II는 성장배지에 .
- 골수간엽 줄기세포의 조골세포로의 분화. 골수간엽 줄기 세포가 조골세포로 분화되는지 확인하기 위하여 골분화 배지를 처리하고 4주 후 Wright-Giemsa, Alizarin red, 및 von Kossa 염색을 실시하였다. 염색 결과는 Figure 6에 나타내었고, von Kossa 염색 결과에서 조골세포에서 발견되는 칼슘형성을 확인할 수 있었다 또한 골분화 배지에 서 골분화 인자들의 영향을 확인하기 위하여 4가지 그룹으로 배지를 조성하여 골분화 실험을 하였고 4주 후 ALP 염색과 ALP 활성으로 분석한 결과를 Figure 7과 Table 3에 나타내었다.
- 그룹 I은 성장배지 (DMEM)에 β글리 세롤포스페이트를 첨가한 것이고, 그룹 II는 성장배지에 .글리세롤포스페이트와 비타민 %를 첨가한 것, 그룹 m는 성장배지에 β글리세롤포스페이트와 덱사메타손을 첨가한 것이고 마지막 그룹 IV는 성장배지에 )3글리세 롤포스페이트, 비타민 D3, 및 덱사메타손을 첨가한 것이다. 이들의 조골세포분화 정도는 ALP 염색과 ALP 활성을 측정하여 확인하였다.
- 두 번째로 골수간엽줄기세포의 골세포 분화는 골분화 배지를 사용하였다. 조골세포로의 분화를 확인하기 위하여 Wright-Giemsa, Alizarin red, 및 von Kossa 염색을 실시하여 조골세포에서 발현되는 칼슘형성을 알아보았다.
- 이러한 일련의 연구를 바탕으로 본 연구에서는 PLA 및 PLGA 담체의 생체활성력이 결여되어 있는 단점을 개선하고자, 그리고 골형성 자극을 가지는 DBP를 응용함으로써 골형성 촉진을 꾀하려 하였다. 또한 골수간엽줄기세 포 (bone-marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs) 가 골형성에 미치는 영향을 확인하려 하였다 DBP와 PLGA 를 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 다공성 지지체를 제조하였고32 특성 결정 방법으로 주사전자현미 경(scan ning electron microscopy, SEM)으로 다공형태 및 크기를 관찰하였다. BMSCs는 사람으로부터 분리하여 배양하였으며, 골분화 배지를 사용하여 조골세포로 분화시켰다.
- 용매 캐스팅/염 추출법을 이용한 다공성 지지체의 제조 PLA, PLA/DBP (50%), PLGA, 및 PLGA/DBP (50%) 다공성 지지체는 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다. 먼저 PLA 및 PLGA를 MC에 일정 농도로 용해 한 후 각각 DBP를 일정량 첨가하고 여기에 다공생성 물질인 염화나트륨을 분자체로 선별된 (180-250 ㎛, 250 ~355 ㎛) 염화나트륨을 일정 비율로 혼합하였다 (Table 1). 용해된 PLA, PLA/DBP, PLGA, 및 PLGA/DBP와 염의 혼합물을 직경 10 mm 및 두께 5 mm 크기의 실리콘 몰드에 넣은 후 프레스 (MH-50Y; CAP 50 tons, Japan)를 이용하여 상온에서 60 kgf/cn?의 압력으로 24시간 동안 가압 하였다 다공형성 물질인 염의 추출은 3차 증류수에서 48 시간 동안 시행한 후, 8 mTorr, -55 °C 조건에서 48시간 동안 동결 건조하였다 잔류용매인 MC를 제거하기 위하여 최소 1주일 동안 25 °C 진공오븐에서 건조시킨 후, 진공 상태에서 보관하여 실험에 사용하였다.
- PLA와 PLGA에 DBP를 함유시킨 지지체를 제조하고 여기에 골수간엽줄 기세포를 파종시켜 골분화 정도를 확인하고자 하였다. 면 역 결핍 누드마우스의 피하에 지지체를 삽입하고 4주 후 꺼내어 조직을 10% 포르말린 수용액으로 고정한 후 3 ㎛로 절단하여 슬라이드에 고정시키고 H&E, von Kossa 염색을 하였다. 먼저 골세포의 형태를 확인하기 위하여 H&E 염색을 하였다.
- In vivo 환경에서의 조직공학적 골형성을 관찰하기 위하여 면역결핍 쥐를 이용하여 실험하였다. 생후 4주된 쥐의 등쪽 부분을 2~3 cm 정도 절개하고 PLA, PLA/DBP, PLGA 및 PLGA/DBP 지지체와 여기에 BMSCs를 1X105개/cell을 파종시킨 PLA/ BMSCs, PLA/DBP/BMSCs, PLGA/BMSCs, 및 PLGA/DBP/ BMSCs를 이식하고, 4주가 지난 후에 지지체를 10% 포르말린에 고정하였다. 고정된 지지체를 파라핀 블록을 제작한 후에 3 ㎛로 자른 후 슬라이드에 고정하고 조직학적 평가를 하기 위하여 H&E 염색과 von Kossa 염색을 실시하였다.
- 세 번째로 DBP와 BMSCs가 새로운 골조직 형성에 주는 영향을 확인을 하였다. H&E 염색의 결과에서 4주 후 새로운 조직의 형성을 확인할 수 있었으며, DBP가 함유된 지지체에서는 DBP 주위로 조골세포로 사료되는 세포가 배열하고 있으며 또한 매크로파지로 사료되는 세포가 형성되었음을 확인하였다 또한 von Kossa 염색에서 DBP 자체와 그 주위에 광범위한 칼슘 형성 영역을 확인할 수 있었다.
- 용매 캐스팅/염 추출법을 이용한 다공성 지지체의 제조 PLA, PLA/DBP (50%), PLGA, 및 PLGA/DBP (50%) 다공성 지지체는 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다. 먼저 PLA 및 PLGA를 MC에 일정 농도로 용해 한 후 각각 DBP를 일정량 첨가하고 여기에 다공생성 물질인 염화나트륨을 분자체로 선별된 (180-250 ㎛, 250 ~355 ㎛) 염화나트륨을 일정 비율로 혼합하였다 (Table 1).
- 글리세롤포스페이트와 비타민 %를 첨가한 것, 그룹 m는 성장배지에 β글리세롤포스페이트와 덱사메타손을 첨가한 것이고 마지막 그룹 IV는 성장배지에 )3글리세 롤포스페이트, 비타민 D3, 및 덱사메타손을 첨가한 것이다. 이들의 조골세포분화 정도는 ALP 염색과 ALP 활성을 측정하여 확인하였다.
- , USA) 점진구배용액에 천천히 낙하시켜 퍼콜 층과 섞이지 않도록 하였다. 이를 원심분리기로 500 g에서 25분간 원심분리하여 적혈구 층, 퍼콜 층, 세포 층과 혈장 층으로 구분하였으며 마이크로 피펫을 이용하여 세포 층 만을 분리하여 배양액으로 다시 희석하여 1000 ipm에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 세포를 IO’ ~104 세포/cn?의 농도로 배양 플라스크에 배양하였다.
- BMSCs는 사람으로부터 분리하여 배양하였으며, 골분화 배지를 사용하여 조골세포로 분화시켰다. 조골세포 분화는 Wright-Giemsa, Alizalin red, von Kossa 염색으로 확인하였으며, in vivo 환경에서 조직공학적 골형성을 관찰하기 위하여 면역결핍 쥐로 실험하여 조직학적 염색을 실시하였다.
- 두 번째로 골수간엽줄기세포의 골세포 분화는 골분화 배지를 사용하였다. 조골세포로의 분화를 확인하기 위하여 Wright-Giemsa, Alizarin red, 및 von Kossa 염색을 실시하여 조골세포에서 발현되는 칼슘형성을 알아보았다. 위의 염색을 통해 골수간엽줄기세포를 골분화 배지로 분화가 가능하였음을 확인하였고, 글리세롤포스페이트, 비타민 D3및 덱사메타손이 골분화에 중요한 인자이며, 덱사 메타손보다 비타민 d가 더 중요한 작용을 한다고 사 료된다.
대상 데이터
- 시약 및 재료. PLA는 (Boehringer Ingelheim Chem. Co. Ltd., Germany)에서 구입하였고, PLGA (lactide/glicolide 몰비 , 75/25, Resomer® RG 756, Boehringer Ingelheim Chem. Co. Ltd., Germany)는 평균분자량이 90000 g/mole인 것을 사용하였다 염화나트륨 (Orient Chem. Co., Korea)은 다공 생성물질로 사용하였는데 본 실험에서 요구되는 크기로 선별하기 위하여 각 크기별 분자체를 사용하였다 DBP 는 (Osteotech, Inc., Shrewsbury, NJ, USA)으로부터 구입하였고, 메틸렌클로라이드 (MC, Tedia Co. Inc., USA) 등의 모든 화학약품과 유기용매는 HPLC 등급을 사용하였다. PLA와 PLGA의 화학 구조식은 Figure 1에 나타내었고 DBP의 형태는 Figure 2에 나타내었다.
- 골수간엽줄기세포의 분리 및 배양. 사람의 골수 간엽 줄기세포는 기부자로부터 14 게이지의 바늘과 3000 U 헤파린을 포함한 수용액이 든 주사기를 사용하여 20~ 30 mL의 골수에서 채취하였으며 배양액으로 2배 희석 하였다. 이 골수는 50% 퍼콜 (Percoll, Sigma, Chem.
- , Model AutoPore U 9220, USA)를 이용하였다. 사용된 PLA, PLGA 지지체의 질량, 측정수은 체적, 수은압력 및 최대압력은 각각 0.1 g, 6.7 ~ 7.3 mL,3.4 KPa 및 414 MPa 이었다. 수은압력 F와 구멍 반지름 r의 관계는 다음의 Washbum 식‘3
- 상등액을 제거하고 세포를 IO’ ~104 세포/cn?의 농도로 배양 플라스크에 배양하였다. 세포의 성장배지로는 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM, Gibco BRL, USA)에 10% 우태혈청(FBS, Gibco BRL)과 항생제 (10 U/mL, 페니실린 G 소디움과 10 |ig/mL 암프테리신 B, Gibco BRL)를 사용하였다. 배양된 세포는 3일에 한번씩 배양액을 교체하였으며 9일에 한 번씩 계대 배양하였다.
이론/모형
- 수은 다공도계 분석. 상기의 여러 방법들을 사용하여 제조한 다공성 지지체의 다공 크기 분포, 비다공면적, 평균 다공직경 및 다공도를 측정하기 위하여 수은 다공도 계 (Micromeritics Co., Model AutoPore U 9220, USA)를 이용하였다. 사용된 PLA, PLGA 지지체의 질량, 측정수은 체적, 수은압력 및 최대압력은 각각 0.
성능/효과
- 염색 결과는 Figure 6에 나타내었고, von Kossa 염색 결과에서 조골세포에서 발견되는 칼슘형성을 확인할 수 있었다 또한 골분화 배지에 서 골분화 인자들의 영향을 확인하기 위하여 4가지 그룹으로 배지를 조성하여 골분화 실험을 하였고 4주 후 ALP 염색과 ALP 활성으로 분석한 결과를 Figure 7과 Table 3에 나타내었다. ALP 염색결과 그룹 I, IU, n, 및 IV의 순으로 염색이 강하게 되었으며, 그룹 U와 Ⅲ을 비교하여 보았을 때 덱사메타손 보다 비타민 D3가 더 강한 골분화 효과를 가진다고 사료되며, Q글리세롤포스페이트 덱사메타손, 비타민 D3가 함유된 배지에서 비교적 강한 골분화 효과를 가진다. 또한 ALP 활성을 측정한 결과는 그룹 I에서 13.
- 지지체의 내부, 옆면의 다공 구조는 다공과 다공 사이의 연결이 양호하고 대부분이 열린 셀 구조를 하고 있는 것으로 나타났다. DBP가 함유된 지지체와 DBP가 함유되지 않 는 지지체의 다공형태는 형태학적으로 큰 차이가 관찰 되지 않았으며 이러한 결과는 DBP가 다공형태에 큰 영향을 주지 않는다고 사료된다.
- 세 번째로 DBP와 BMSCs가 새로운 골조직 형성에 주는 영향을 확인을 하였다. H&E 염색의 결과에서 4주 후 새로운 조직의 형성을 확인할 수 있었으며, DBP가 함유된 지지체에서는 DBP 주위로 조골세포로 사료되는 세포가 배열하고 있으며 또한 매크로파지로 사료되는 세포가 형성되었음을 확인하였다 또한 von Kossa 염색에서 DBP 자체와 그 주위에 광범위한 칼슘 형성 영역을 확인할 수 있었다. 이는 DBP가 가진 BMP 등의 골세포에 자극을 주는 인자가 피하층에 존재하는 미분화된 줄기세포를 골세포로 분화시켰거나, 미리 파종시킨 BMSCs가 골세포로 파종된 결과라고 사료된다.
- 결론적으로 PLA 및 PLGA에 DBP를 50% 함유시킨 지지체의 제조가 가능하였으며 DBP가 함유된 지지체는 생체 내에서 새로운 골조직을 형성한다는 것을 H&E와 von Kossa 염색을 통하여 확인하였다. 이는 DBP가 새로운 골조직의 형성에 매우 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
- 골수간엽줄기세포의 분리 및 배양. 골수간엽줄기세포는 기부자로부터 분리하여 배양하였으며, 4번 정도 계대 배양 후 세포를 관찰한 결과, 전형적인 골수간엽줄기세 포의 형태를 관찰할 수 있었다. 4주 정도 배양하여 실험에 필요한 정도의 세포를 얻을 수 있었다.
- 2로 나타났다. 그룹 HI에서 보다 그룹 II에서 높은 ALP 활성을 가졌으며, 그룹 IV에서 가장 강한 ALP 활성을 가졌다.
- 평균다공 크기는 염의 크기가 180~250pm 보다 250~355 ㎛의 지지체에서 큰 것을 확인하였고, 다공도는 모든 샘플에서 90%이상의 높은 다공도를 나타내었다. 모든 샘플은 상호다공연결성이 우수하다고 사료되며, DBP의 함량에 크게 영향을 받지 않는 것을 확인하였다. Figure 5에 다공 분포를 나타내었는데, DBP 의 함량이 50%정도 되어도 다공크기 및 다공도에 큰 영향을 주지 않아 일정한 형태의 다공성 지지체의 제조가 가능한 것으로 사료된다.
- 외형적 형태는 실리콘 몰드의 빈 공간과 똑같은 디스크 형태로 얻어졌으며, 수축, 부풀림, 불규칙한 크기의 구멍 및 여타 결함이 없는 것으로 관찰되었다. 몰드의 형태에 여러 형태의 지지체의 제조가 가능하였으며, 몰드 직경에 따라 지지체의 직경도 조절이 가능했고, 두께 역시 조절이 가능함을 알 수 있었다. 염의 크기 (180 -250 ㎛, 250 - 355 ㎛)에 따라 지지체에서도 염과 유사한 크기의 다공이 나타났다.
- 용매 캐스팅/염 추출법으로 제조한 다공성 지지체의 SEM 사진은 Figure 4에 나타내었다. 외형적 형태는 실리콘 몰드의 빈 공간과 똑같은 디스크 형태로 얻어졌으며, 수축, 부풀림, 불규칙한 크기의 구멍 및 여타 결함이 없는 것으로 관찰되었다. 몰드의 형태에 여러 형태의 지지체의 제조가 가능하였으며, 몰드 직경에 따라 지지체의 직경도 조절이 가능했고, 두께 역시 조절이 가능함을 알 수 있었다.
- 조골세포로의 분화를 확인하기 위하여 Wright-Giemsa, Alizarin red, 및 von Kossa 염색을 실시하여 조골세포에서 발현되는 칼슘형성을 알아보았다. 위의 염색을 통해 골수간엽줄기세포를 골분화 배지로 분화가 가능하였음을 확인하였고, 글리세롤포스페이트, 비타민 D3및 덱사메타손이 골분화에 중요한 인자이며, 덱사 메타손보다 비타민 d가 더 중요한 작용을 한다고 사 료된다.
- 결론적으로 PLA 및 PLGA에 DBP를 50% 함유시킨 지지체의 제조가 가능하였으며 DBP가 함유된 지지체는 생체 내에서 새로운 골조직을 형성한다는 것을 H&E와 von Kossa 염색을 통하여 확인하였다. 이는 DBP가 새로운 골조직의 형성에 매우 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 현재 DBP의 함량에 따른 지지체의 제조, DBP 함유량의 최적조건 설정, 시간에 따른 골형성의 메커니즘, BMSCs와의 상호작용 메커니즘 및 세포 성장 과 분화에 대한 영향을 실험 중에 있다.
- 마찬가지로 PIA와 PLGA에 BMSCs를 파종시킨 지지체에서는 칼 슘형성을 확인하지 못하였지만 PLA/DBP와 PLGA/DBP에 BMSCs를 파종시킨 지지체에서는 칼슘 형성 영역을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 PLA나 PLGA와 같은 고분자 자체가 골형성에 어떠한 영향도 가지고 있지 않으며, 또한 골분화 인자가 없이 미분화된 BMSCs의 이용도 골 형성에 영향을 주지 않는다고 사료된다 반면 골분화 성장인자인 BMP를 함유하고 있는 DBP를 넣은 지지체에서는 지지체 자체만으로도 피하층에 분포되어 있던 미분화된 줄기세포를 자극하여 골세포로 분화시켰고, 또한 BMSCs를 파종한 지지체에서는 BMSCs가 골세포로 분화 되었을 뿐만 아니라 피하층의 미분화 줄기세포도 골세포로 분화하였으리라 사료된다. BMSCs가 파종된 지지체에서는 줄기세포의 영향으로 더 많은 조직이 형성되었고, 칼슘 형성 영역도 광범위하게 나타났다고 사료된다.
- 이는 염의 크기와 양을 조절함으로써 지지체의 다공크기와 다공도를 조절할 수 있다는 것이다. 지지체의 내부, 옆면의 다공 구조는 다공과 다공 사이의 연결이 양호하고 대부분이 열린 셀 구조를 하고 있는 것으로 나타났다. DBP가 함유된 지지체와 DBP가 함유되지 않 는 지지체의 다공형태는 형태학적으로 큰 차이가 관찰 되지 않았으며 이러한 결과는 DBP가 다공형태에 큰 영향을 주지 않는다고 사료된다.
- 첫 번째로 다공성 지지체의 제조는 용매 캐스팅/염 추줄법을 사용하여 제조하였고 제조한 지지체의 다공도는 90% 이상, 100pm 내외의 다공크기를 가졌다.
- Table 1에서 수은다공도계 분석 결과를 나타내었다. 평균다공 크기는 염의 크기가 180~250pm 보다 250~355 ㎛의 지지체에서 큰 것을 확인하였고, 다공도는 모든 샘플에서 90%이상의 높은 다공도를 나타내었다. 모든 샘플은 상호다공연결성이 우수하다고 사료되며, DBP의 함량에 크게 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.
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