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문제 정의
- 따라서 본 연구는 강우에 의한 산불피해 초기 토양 유실에 의한 피해를 줄이기 위해 토양 입단화촉진 소재로의 개발을 목적으로 EPS를 분비하는 미생물을 탐색·분리 하고, 이중 EPS 생산 능력과 응집활성이 우수한 균주를 선별동정하여 토양 입단의 안정성 및 토양 입단화 촉진제로서의 활용여부를 파악하고자 하였다.
제안 방법
- 산불지역과 농경지의 토양 시료를 NA 배지 및 PDA 배지에 도말하여 30℃에서 2일간 배양 후, 170 여종의 미생물을 분리하였고, 이 중에서 점성을 가지거나 표면이 젤리형태인 균주 6종을 1차선별 하였다 [Table 1]. 1차 분리된 균주를 액체 EPS medium에서 배양 한 후 건중량 측정을 통해 수율이 높은 2종의 균주를 최종 선정하여 FM-02, AL-02로 각각 명명하였다.
- 증폭을 위한 primer는 세균의 공통 primer 인 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1542R(5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3')를 사용하였고 반응조건은 다음과 같다. Micro tube에 멸균된 증류수 62.5㎕, Chromosomal DNA Template 3㎕, 10X Buffer 10㎕, 25mM MgCl2 6㎕와 공통 primer를 각각 5㎕씩 10㎕로총 부피 100㎕ PCR 완충액을 넣고 Gene Cycler™ (BIO RAD)를 이용하여 증폭하였다. Pre-denaturation 과정으로 99℃에서 8분간 반응시킨 후, 5U/㎕ Taq Polymerase 0.
- 5㎕, Chromosomal DNA Template 3㎕, 10X Buffer 10㎕, 25mM MgCl2 6㎕와 공통 primer를 각각 5㎕씩 10㎕로총 부피 100㎕ PCR 완충액을 넣고 Gene Cycler™ (BIO RAD)를 이용하여 증폭하였다. Pre-denaturation 과정으로 99℃에서 8분간 반응시킨 후, 5U/㎕ Taq Polymerase 0.5㎕와 2.5mM dNTP 8㎕를 첨가하고 2분간 반응을 더 진행시킨 다음, 94℃에서 1분간 변성작용 (Denaturation Step), 55℃에서 30초간 혼성과정 (Annealing Step), 72℃에서 2분간 중합반응과정 (Polymerization Step)의 세 가지 과정을 35회 반복시켰다. 이후 PCR 과정의 마지막 복제과정 (Post-polymerization Step)으로 72℃, 10분간 방치한 후 반응을 완료하였다.
- 응집활성 측정은 5,000ppm의 kaolin clay 및 활성 탄소(active carbon) 현탁액 90 ml을 100 ml mass cylinder에 넣고 원심분리를 통해 얻은 배양 상등액 10 ml를 첨가하여 100 ml이 되게 한 후 10~60분간 방치 한 다음 상등액을 취하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 배양액 대신 증류수를 사용하여 이 두 흡광도의 차이를 응집 활성으로 나타내었다. 측정된 흡광도에 의한 응집 활성 (flocculation activity ; FA)의 계산은 다음식과 같다.
- 배양 상등액을 10ml 취한 후 증류수를 이용하여 12시간 동안 투석하여 monosacchraide를 제거한 후, 총당량을 측정하였다. 투석시 pore size는 12,000-14,000을 사용하였으며, 발색시약으로는 anthrone reagent를 사용하였고, 90℃에서 15분간 반응 후 냉각하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분리세균의 동정을 위하여 1차적으로 그람 염색을 실시하였으며, 운동성 여부를 확인하기 위해 단일 콜로니를 취하여 NA 반고체배지 중앙에 접종한 후 30℃, 24시간동안 배양시키고 배양된 모양을 관찰하여 운동성 여부를 파악하였다. 세균의 생화학적 특성을 조사하기 위하여 API 20E Test Kit (Biomerieux, France)을 사용하였으며, 실험 방법은 제조사의 manual에 따라 실행하였다.
- 분리한 세균의 계통진화학적 분류를 위하여 세균으로부터 염색체를 분리한 후 16s-rDNA를 PCR(Polymearase Chain Reaction)을 통하여 증폭하였다. 증폭을 위한 primer는 세균의 공통 primer 인 9F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'), 1542R(5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3')를 사용하였고 반응조건은 다음과 같다.
- 산불지역과 농경지의 토양 시료를 NA 배지 및 PDA 배지에 도말하여 30℃에서 2일간 배양 후, 170 여종의 미생물을 분리하였고, 이 중에서 점성을 가지거나 표면이 젤리형태인 균주 6종을 1차선별 하였다 [Table 1]. 1차 분리된 균주를 액체 EPS medium에서 배양 한 후 건중량 측정을 통해 수율이 높은 2종의 균주를 최종 선정하여 FM-02, AL-02로 각각 명명하였다.
- 생성 균주를 EPS 배지에서 25℃, 48시간 200 rpm에서 진탕배양 한 후, 배양액 10ml을 10,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 제거한 후, 상층액에 2배의 cold isopropanol을 첨가하여 4℃에서 24시간 방치 시킨 후, 침전되는 EPS를 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 50℃에서 24시간 동안 건조한 다음 무게를 측정하였다.
- 5Kb의 크기에 해당하는 16s rDNA Band를 확인하였다. 증폭된 16s rDNA를 Chromosomal DNA로부터 순수분리하기 위해 DNA PrepMateTMⅡ Kit (Bioneer. Co. Ltd)를 이용하여 Gel Purification 하였으며, 분리된 DNA 절편을 pGEM-T Easy Vector System Ⅱ (Promega)를 사용하여 vector에 ligation한 후, E. coli JM109 세균에 형질전환 하였다. 형질전환 후 mini-prep에 의해 확인된 positive colony로부터 Qiagen tip (Mini) Kit을 사용하여 Plasmid DNA를 순수 분리하였으며 분리된 plasmid는 (주) 솔젠트의 DNA Sequencing Laboratory에 의뢰하여 16s rDNA 의 염기서열을 분석하였다.
- coli JM109 세균에 형질전환 하였다. 형질전환 후 mini-prep에 의해 확인된 positive colony로부터 Qiagen tip (Mini) Kit을 사용하여 Plasmid DNA를 순수 분리하였으며 분리된 plasmid는 (주) 솔젠트의 DNA Sequencing Laboratory에 의뢰하여 16s rDNA 의 염기서열을 분석하였다.
대상 데이터
- 콜로니 형태, 색깔 등 특징적인 균주들을 배양한 후 점성을 가지거나 표면이 젤리형태인 균주를 1차 선별 하였다. 1차 분리된 균주를 EPS medium20)에서 배양 한 후 건중량 측정을 통해 수율이 높은 균주를 최종 선정하여 본 연구에 사용하였다.
- 산불 토양의 복원을 위한 EPS생성균주를 분리하기 위하여 강원도 강릉 사천, 옥계, 삼척의 산불 지역과 농경지의 토양을 채취하여 분리용 시료로 사용하였다. 이들 시료를 NA 배지 및 PDA 배지에도말하여 30℃에서 3일간 배양 하였다.
- 이들 시료를 NA 배지 및 PDA 배지에도말하여 30℃에서 3일간 배양 하였다. 콜로니 형태, 색깔 등 특징적인 균주들을 배양한 후 점성을 가지거나 표면이 젤리형태인 균주를 1차 선별 하였다. 1차 분리된 균주를 EPS medium20)에서 배양 한 후 건중량 측정을 통해 수율이 높은 균주를 최종 선정하여 본 연구에 사용하였다.
이론/모형
- 분리세균의 동정을 위하여 1차적으로 그람 염색을 실시하였으며, 운동성 여부를 확인하기 위해 단일 콜로니를 취하여 NA 반고체배지 중앙에 접종한 후 30℃, 24시간동안 배양시키고 배양된 모양을 관찰하여 운동성 여부를 파악하였다. 세균의 생화학적 특성을 조사하기 위하여 API 20E Test Kit (Biomerieux, France)을 사용하였으며, 실험 방법은 제조사의 manual에 따라 실행하였다.
성능/효과
- 8,9) 우리나라는 겨울과 봄철에 건조하고 특히 동해안 지역의 높새바람에 의한 기후 특성상 산불이 자주 발생하고 있어 피해지 복원에 대한 합리적인 방안이 모색되어야 한다.6) 이러한 산불의 피해를 최소화하기 위해서는 예방에 집중하여야 하며, 산불 발생시, 산불피해지의 조기 식생회복 및 토양유실을 최소화 하는 것이 최선의 방책이라 할 수 있다.5)
- 균주별 Generation time 은 각각 63분, 186분 이었으며, 균체량은 두 균주 모두 48시간 이후에 일정하게 유지 되었다. EPS 량은 AL-02균주가 건중량과 흡광도 측정에서 FM-02균주에 비해 3~4배 이상 높은 수율을 보였으며, 배양일수에 따라서도 증가하는 경향을 보였다[Fig. 2]. 균주별 응집활성은 사용된 부유물질과 분리균주에 따라 상이한 결과를 보였다.
- 3g/L의 수율을 보였고, 손 등20)의 연구에서 Xanthomonas sp. EPS-1 균주가 sucrose 5%의 최적배지에서 14.5g/L의 수율을 보였다. 이와 같은 결과를 비교해 볼 때, AL-02균주의 EPS 생산 최적조건을 결정하여 배양한다면 기존 균주의 EPS 생성수율을 크게 상회할 것으로 기대된다.
- 분리된 2종의 EPS 생성 균주의 Chromosomal DNA로부터 증폭된 16s rDNA를 cloning 하여 염기서열 분석을 위한 BLAST search 결과는 다음과 같이 나타났다. FM-02 세균의 9F Primer 로부터의 염기서열은 uncultured beta Proteobacterium과 96%의 유사성을 나타내었으며. 또한 1542R Primer로부터 얻은 염기서열의 비교 결과 uncultured beta Proteobacterium 98%, uncultured Eubacterium WD264, Aquaspirillum arcticum gene과는 97%의 유사성을 나타내었다.
- 1]과 같다. 균주별 Generation time 은 각각 63분, 186분 이었으며, 균체량은 두 균주 모두 48시간 이후에 일정하게 유지 되었다. EPS 량은 AL-02균주가 건중량과 흡광도 측정에서 FM-02균주에 비해 3~4배 이상 높은 수율을 보였으며, 배양일수에 따라서도 증가하는 경향을 보였다[Fig.
- FM-02 세균의 9F Primer 로부터의 염기서열은 uncultured beta Proteobacterium과 96%의 유사성을 나타내었으며. 또한 1542R Primer로부터 얻은 염기서열의 비교 결과 uncultured beta Proteobacterium 98%, uncultured Eubacterium WD264, Aquaspirillum arcticum gene과는 97%의 유사성을 나타내었다. 위 종들은 모두 beta Proteobacterium sp.
- 에 속하는 것으로 나타났으며, AL-02 세균의 염기서열 분석 결과 Zoogloea sp. 및 다른 여러 종의 균주와 유사도 81% 이하의 결과를 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때 AL-02균주가 Zoogloea sp.
- 본 연구에서 분리된 두 종의 EPS 생산 균주는 각각 활성탄소와 kaolin clay에 대해 높은 응집 활성을 나타내었다. 응집활성은 토양 입단화 소재로 이용하기 위한 중요한 특성 중 하나이며, 따라서 응집활성이 뛰어나다는 것은 토양 입단화 소재로써의 활용 가능성이 높다는 것을 의미한다.
- 다당류 생성에 효과적인 탄소원으로는 glucose26)와 sucrose20)가 알려져 있으며 어떠한 탄소원이 최적의 탄소원인가 하는 것은 균주의 특성으로부터 오는 결과라고 추정되고 있다27). 본 연구에서는 sucrose가 분리 균주의 생장에 보다 효율적인 탄소원으로 이용되는 것으로 나타났으며 이는 분리균주가 다당류의 탄소원을 효과적으로 이용하기 위한 효소 체계가 존재하는 것으로 사료 된다. 본 실험에서는 일반적으로 알려진 EPS 생성 배지를 이용하였으나, 추후 연구를 통해 탄소원과 질소원등의 영양요인과 pH, 온도 등 EPS 생성에 영향을 주는 조건들을 확인하여 분리된 균주들의 EPS 생산조건을 최적화 할 필요성이 있다.
- AL-02의 경우 9F Primer 로부터 얻은 염기서열의 비교 분석결과 Zoogloea sp. 와 81%의 유사성을 보였으며, 1542R Primer 로부터 얻은 염기서열의 비교 분석 결과 uncultured Lake bacterium과 81%, Rainbow trout intestinal bacterium 과 81%의 유사성을 보였다. AL-02는 여러 종들과 유사성이 81% 이하로 매우 낮게 나타났다.
- 5g/L의 수율을 보였다. 이와 같은 결과를 비교해 볼 때, AL-02균주의 EPS 생산 최적조건을 결정하여 배양한다면 기존 균주의 EPS 생성수율을 크게 상회할 것으로 기대된다. FM-02의 경우 EPS의 수율은 낮았지만 2000년도 강원도에서 발생한 산불지역 토양으로부터 분리한 토착형 균주이므로 산불토양에 직접 활용시 높은 생존율과 더불어 산불토양의 입단화를 촉진하여 훼손된 토양의 미생물학적 복원소재로서의 이용이 가능할 것이다.
- 이후 PCR 과정의 마지막 복제과정 (Post-polymerization Step)으로 72℃, 10분간 방치한 후 반응을 완료하였다. 증폭한 PCR의 산물은 2% Agarose Gel에 전기영동하여 약 1.5Kb의 크기에 해당하는 16s rDNA Band를 확인하였다. 증폭된 16s rDNA를 Chromosomal DNA로부터 순수분리하기 위해 DNA PrepMateTMⅡ Kit (Bioneer.
후속연구
- 10) 따라서 산불의 피해를 최소화하기 위한 산불피해 지의 조기 식생회복 및 토양유실을 최소화 하기위한 방법의 하나로 미생물에 의한 생태계 복원이 가능할 것이다. 이처럼 미생물을 이용하여 산불지역을 복원하고자 하는 연구는 주로 산불직후 발생된 유해 물질 (다이옥신, PCBs, PAHs등)의 분해를 통한 복원 연구11)와 산불지역의 토양미생물 군집을 생태학적으로 모니터링한 연구12)가 있다.
- 이와 같은 결과를 비교해 볼 때, AL-02균주의 EPS 생산 최적조건을 결정하여 배양한다면 기존 균주의 EPS 생성수율을 크게 상회할 것으로 기대된다. FM-02의 경우 EPS의 수율은 낮았지만 2000년도 강원도에서 발생한 산불지역 토양으로부터 분리한 토착형 균주이므로 산불토양에 직접 활용시 높은 생존율과 더불어 산불토양의 입단화를 촉진하여 훼손된 토양의 미생물학적 복원소재로서의 이용이 가능할 것이다.
- 본 연구에서는 sucrose가 분리 균주의 생장에 보다 효율적인 탄소원으로 이용되는 것으로 나타났으며 이는 분리균주가 다당류의 탄소원을 효과적으로 이용하기 위한 효소 체계가 존재하는 것으로 사료 된다. 본 실험에서는 일반적으로 알려진 EPS 생성 배지를 이용하였으나, 추후 연구를 통해 탄소원과 질소원등의 영양요인과 pH, 온도 등 EPS 생성에 영향을 주는 조건들을 확인하여 분리된 균주들의 EPS 생산조건을 최적화 할 필요성이 있다.
- 차후 이들 EPS 생산 균주 및 세포외 생분해성 고분자 물질이 미치는 토양 입단화에 대한 현장 연구가 수행되어야 할 것이며, 또한 토양 내 EPS생성 세균의 생존률도 확인할 필요가 있다. 본 연구에서 분리된 미생물과 기타 유기물 및 미생물 혼합제제를 이용하여 토양의 입단을 촉진할 수 있다면 산불 초기 강우에 의한 토양의 유기물 유실을 예방 할 수 있을 것이며 이는 산불피해지역의 신속한 미생물학적 복원을 유도할 것으로 사료된다.
- 차후 이들 EPS 생산 균주 및 세포외 생분해성 고분자 물질이 미치는 토양 입단화에 대한 현장 연구가 수행되어야 할 것이며, 또한 토양 내 EPS생성 세균의 생존률도 확인할 필요가 있다. 본 연구에서 분리된 미생물과 기타 유기물 및 미생물 혼합제제를 이용하여 토양의 입단을 촉진할 수 있다면 산불 초기 강우에 의한 토양의 유기물 유실을 예방 할 수 있을 것이며 이는 산불피해지역의 신속한 미생물학적 복원을 유도할 것으로 사료된다.
- 일반적으로 산불피해로 인한 산성화 토양의 pH 조절을 위해 석회를 이용하고 있으며, 따라서 피해지 복원시에 분리균주 및 세포외 고분자물질을 처리할 경우 pH 조절용 석회의 칼슘 성분과의 작용에 의해 응집활성이 상승할 것으로 기대 된다. 특히 AL-02의 경우 생산되는 EPS는 토양의 성분과 유사한 kaolin clay에 대한 응집활성이 크게 나타나 토양입자 응집유도를 통한 입단화에 좋은 효과를 기대 할 수있으며, 토양응집뿐만 아니라 토양의 입단화에 따른 부가효과로 산불피해 초기 초본식생의 생장촉진에 도움이 될 것으로 기대된다.
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