소아 Helicobacter pylori 감염에서 Clarithromycin 내성과 연관된 23S rRNA의 돌연변이 Detection of 23S rRNA Mutation Associated with Clarithromycin Resistance in Children with Helicobacter pylori Infection원문보기
목적: 우리 나라 소아에 감염된 H. pylori에서 PCR RFLP를 이용하여 clarithromycin 내성의 원인으로 알려진 23S rRNA의 돌연변이를 찾아내고, cagA, vacA 유전형과 clarithromycin 내성 돌연변이 사이에 연관이 있는지 알아보고자 하였다. 방법: 서울대학교병원 소아과에서 위내시경검사를 통해 H. pylori 위염으로 진단 받은 환아 27명의 내시경 생검 조직에서 H. pylori cagA, vacA 유전자를 증폭하여 유전형을 조사하였다. H. pylori의 23 rRNA V domain을 조사하기 위해 증폭한 후, PCR 산물은 BsaI과 MboII 제한효소로 처리하여 PCR RFLP를 이용하여 돌연변이 여부를 판정하였다. 결과: A2143G 돌연변이가 1명에서, A2144G 돌연변이가 4명에서 발견되어 18.5%가 clarithromycin 내성으로 관찰되었다. cagA 양성이 25명(93%)이었고, vacA s1a/m1이 6명(22%), s1a/m2가 3명(11%), s1c/m1이 16명(59%), s1c/m2가 1명(4%)이었다. clarithromycin 내성 돌연변이를 보이는 경우는 모두 cagA 양성이었고 s1a/m1이 2명, s1c/m1이 2명으로 특정 유전형이 clarithromycin 내성 돌연변이와 연관성을 보이지 않았다. 결론: 위점막 조직에서 PCR-RFLP를 이용한 H. pylori의 clarithromycin 내성 검사는 항생제를 선택하는데 유용하다고 생각된다. Clarithromycin 내성 돌연변이는 cagA, vacA 유전형과 연관성이 없었다.
목적: 우리 나라 소아에 감염된 H. pylori에서 PCR RFLP를 이용하여 clarithromycin 내성의 원인으로 알려진 23S rRNA의 돌연변이를 찾아내고, cagA, vacA 유전형과 clarithromycin 내성 돌연변이 사이에 연관이 있는지 알아보고자 하였다. 방법: 서울대학교병원 소아과에서 위내시경검사를 통해 H. pylori 위염으로 진단 받은 환아 27명의 내시경 생검 조직에서 H. pylori cagA, vacA 유전자를 증폭하여 유전형을 조사하였다. H. pylori의 23 rRNA V domain을 조사하기 위해 증폭한 후, PCR 산물은 BsaI과 MboII 제한효소로 처리하여 PCR RFLP를 이용하여 돌연변이 여부를 판정하였다. 결과: A2143G 돌연변이가 1명에서, A2144G 돌연변이가 4명에서 발견되어 18.5%가 clarithromycin 내성으로 관찰되었다. cagA 양성이 25명(93%)이었고, vacA s1a/m1이 6명(22%), s1a/m2가 3명(11%), s1c/m1이 16명(59%), s1c/m2가 1명(4%)이었다. clarithromycin 내성 돌연변이를 보이는 경우는 모두 cagA 양성이었고 s1a/m1이 2명, s1c/m1이 2명으로 특정 유전형이 clarithromycin 내성 돌연변이와 연관성을 보이지 않았다. 결론: 위점막 조직에서 PCR-RFLP를 이용한 H. pylori의 clarithromycin 내성 검사는 항생제를 선택하는데 유용하다고 생각된다. Clarithromycin 내성 돌연변이는 cagA, vacA 유전형과 연관성이 없었다.
Purpose: The resistance of H. pylori to clarithromycin is one of the major causes of eradication failure. In H. pylori, clarithromycin resistance is due to point mutation in 23S rRNA. The aims of this study were to investigate the mutation of 23S rRNA and to examine the association of cagA, vacA gen...
Purpose: The resistance of H. pylori to clarithromycin is one of the major causes of eradication failure. In H. pylori, clarithromycin resistance is due to point mutation in 23S rRNA. The aims of this study were to investigate the mutation of 23S rRNA and to examine the association of cagA, vacA genotype and clarithromycin resistant genes. Methods: H. pylori DNA was extracted from antral biopsy specimens from 27 children with H. pylori infection. Specific polymerase chain reaction (PCR) assays were used for cagA and vacA. Mutations associated with clarithromycin resistance were detected by using PCR restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of 23S rRNA gene. Results: A2143G mutation was detected in one case and A2144G in 4, indicating 18.5% were clarithromycin resistant. Among the total of 27, cagA was present in 25 (93%), vacA s1a/m1 in 6 (22%), s1a/m2 in 3 (11%), s1c/m1 in 16 (59%), and s1c/m2 in 1 (4%). All of the 5 clarithromycin resistant strains were cagA (+), among which 2 were s1a/m1 and 2 were s1c/m1. There was no relation between genotypes and clarithromycin resistant genes. Conclusion: Detection of H. pylori resistance to clarithromycin using PCR RFLP from biopsy specimens might be useful for the selection of antibiotics. Clarithromycin resistant genes are not associated with genotypes of cagA and vacA.
Purpose: The resistance of H. pylori to clarithromycin is one of the major causes of eradication failure. In H. pylori, clarithromycin resistance is due to point mutation in 23S rRNA. The aims of this study were to investigate the mutation of 23S rRNA and to examine the association of cagA, vacA genotype and clarithromycin resistant genes. Methods: H. pylori DNA was extracted from antral biopsy specimens from 27 children with H. pylori infection. Specific polymerase chain reaction (PCR) assays were used for cagA and vacA. Mutations associated with clarithromycin resistance were detected by using PCR restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of 23S rRNA gene. Results: A2143G mutation was detected in one case and A2144G in 4, indicating 18.5% were clarithromycin resistant. Among the total of 27, cagA was present in 25 (93%), vacA s1a/m1 in 6 (22%), s1a/m2 in 3 (11%), s1c/m1 in 16 (59%), and s1c/m2 in 1 (4%). All of the 5 clarithromycin resistant strains were cagA (+), among which 2 were s1a/m1 and 2 were s1c/m1. There was no relation between genotypes and clarithromycin resistant genes. Conclusion: Detection of H. pylori resistance to clarithromycin using PCR RFLP from biopsy specimens might be useful for the selection of antibiotics. Clarithromycin resistant genes are not associated with genotypes of cagA and vacA.
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문제 정의
목적: 우리 나라 소아에 감염된 H. pylori에서 PCR RFLP를 이용하여 clarithromycin 내성의 원인으로 알려진 23S rRNA의 돌연변이를 찾아내고, cagA, vacA 유전형과 clarithromycin 내성 돌연변이 사이에 연관이 있는지 알아보고자 하였다.
본 연구에서는 우리 나라 소아에 감염된 H. pylori 에서 PCR RFLP를 이용하여 clarithromycin 내성의원인으로 알려진 23S rRNA의 돌연변이를 찾아내고, cagA, vacA 유전형과 clarithromycin 내성 돌연변이 사이에 연관이 있는지 알아보고자 하였다.
제안 방법
PCR cycle은 1분 동안 94℃에서 denature하고 1분 동안 55℃에서 annealing한 후 1분간 72℃에서 확장하는데, 39 cycle을 시행하였다. 2% agarose gel에서 전기영동하여 425 bp의 산물을 확인 하였다. PCR 산물은 PCR RFLP를 이용하여 BsaI과 MboII 제한효소로 처리하여 37℃에서 3시간 배양 후 밴드를 확인하여 돌연변이 여부를 판정하였다.
vacA s region은 VA1-F와 VA1-R을 시발체로 하여 94℃에서 denature하고 1분간 57℃에서 annealing한 후 1분간 72℃에서 extension하는 35 cycle을 시행하였다. 259 bp가 나오면 s1, 286 bp가 나오면 s2로 분류하고 s1은 s1a, s1b, s1c 에 특이한 시발체인 S1A-F, SS3-F, S1C-F와 VA1-R 을 이용하여 PCR하여 세분하였다. vacA m region은 VAG-F, VAG-R을 시발체로 하여 94℃에서 denature 하고 1분간 58℃에서 annealing한 후 1분간 72℃에서 extension하는 35 cycle을 시행하였다.
PCR 실시 후 반응산물 10μL를 취하여 X6 전기 영동 완충액 2μL와 섞은 다음 2% agarose gel에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 폴라로이드 카메라로 촬영하였다. 294 bp 크기의 분절이 발견되어 H. pylori DNA가 양성으로 나온 환자가 27명으로 이들에 대하여 각 유전자에 대해 PCR을 시행하였다.
pylori cagA, vacA 유전자를 증폭하여 유전형을 조사하였다. H. pylori의 23 rRNA V domain을 조사하기 위해 증폭한 후, PCR 산물은 BsaI과 MboII 제한효소로 처리하여 PCR RFLP를 이용하여 돌연변이 여부를 판정하였다.
2% agarose gel에서 전기영동하여 425 bp의 산물을 확인 하였다. PCR 산물은 PCR RFLP를 이용하여 BsaI과 MboII 제한효소로 처리하여 37℃에서 3시간 배양 후 밴드를 확인하여 돌연변이 여부를 판정하였다.
final extension은 72℃에서 5분간 시행하고 4℃에서 보관하였다. PCR 실시 후 반응산물 10μL를 취하여 X6 전기 영동 완충액 2μL와 섞은 다음 2% agarose gel에서 전기영동한 후 UV transilluminator에서 폴라로이드 카메라로 촬영하였다. 294 bp 크기의 분절이 발견되어 H.
위생검조직을 lysis buffer와 proteinase K 용액에 넣은 후 55℃의 항온기에 12시간 이상 방치하여 용액이 투명하게 보일 때까지 조직을 분해하였다. QIAamp tissue kit (QIAGEN Inc., USA)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다.
pylori DNA를 검출하는데 가장 민감하고 특이하다고 보고된 phosphoglucosamine mutase gene, glmM9)에 대하여 PCR을 실시하였다. genomic DNA를 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200μM씩의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 25 pmole씩의 sense primer(HP-F)와 antisense primer (HP-R), 2.5 unit의 Taq DNA polymerase가 포함된 50μL의 buffer에서 PCR thermal cycler로 증폭시켰다. 94℃에서 5분간 denaturation한 후 94℃에서 1분간 denature, 58℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 35회 반복하였다.
방법: 서울대학교병원 소아과에서 위내시경검사를 통해 H. pylori 위염으로 진단 받은 환아 27명의 내시경 생검 조직에서 H. pylori cagA, vacA 유전자를 증폭하여 유전형을 조사하였다. H.
위 생검조직에서 H. pylori DNA를 검출하는데 가장 민감하고 특이하다고 보고된 phosphoglucosamine mutase gene, glmM9)에 대하여 PCR을 실시하였다. genomic DNA를 10 mM Tris-HCl (pH 8.
대상 데이터
A2143G 돌연변이는 MboII에 의해 두 개의 밴드가 나타나는데, 1명에서 관찰되었다. BsaI에 의해 두개의 밴드가 나타나 A2144G 돌연변이로 밝혀진 경우는 4명이었다(Fig. 1). 27명 중 5명에서 A2143G 또는 A2144G 돌연변이가 발견되어 18.
pylori 위염으로 진단받은 전국에서 의뢰해온 환아를 대상으로 하였다. 대상 환아의 연령은 3세에서 15세(정중값 10세)이었고 남자 11명, 여자 16명이었다. H.
서울대학교병원 소아 내시경실에서 위내시경검사를 통해 H. pylori 위염으로 진단받은 전국에서 의뢰해온 환아를 대상으로 하였다. 대상 환아의 연령은 3세에서 15세(정중값 10세)이었고 남자 11명, 여자 16명이었다.
결론: 위점막 조직에서 PCR-RFLP를 이용한 H. pylori의 clarithromycin 내성 검사는 항생제를 선택하는데 유용하다고 생각된다. Clarithromycin 내성 돌연변이는 cagA, vacA 유전형과 연관성이 없었다.
pylori에 비해서 훨씬 느린 성장 유형을 보여서 임상적으로 의미가 없는 것으로 보고되고 있다17). 본 연구의 결과 27명 중 5명에서 A2143G 또는 A2144G 돌연변이가 발견되어 18.5%에서 clarithromycin 내성이 관찰되었다. 아직까지 국내에서 amoxicillin 내성균은 거의 없으므로18) 우리 나라 소아에서 PPI 삼제병합요법의 낮은 제균율이 clarithromycin 내성 때문일 가능성이 많다.
후속연구
pylori 균주에서도 clarithromycin 내성률이 24%에 이르렀고, 내성 균주의 90%가 A2143G 돌연변이로 밝혀졌다20). 따라서 clarithromycin 내성률이 높은 지역에서는 위점막 조직의 PCR-RFLP 검사가 제균 실패를 예방하는데 도움이 될 것이다.
위점막 조직에서 PCR-RFLP를 이용한 H. pylori의 clarithromycin 내성 검사는 균배양 후 항생제 감수성 검사 없이도 항생제를 선택하는데 유용할 것이라고 생각된다.
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