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문제 정의
- 본 실험은 bleomycin 유도 폐 섬유화 백서 모델을 이용하여 IFN-γ가 폐 섬유화에 있어서 중요한 역할을 하는 MMP와 TIMP 그리고 Th-2 사이토카인에 미치는 영향을 알아보기 위하여 계획되었다.
- 이에 저자들은 bleomycin 유도 백서 폐 섬유화 모델에서 IFN-γ가 폐 섬유화에 미치는 영향과 MMP-2, -9과 이의 길항제인 TIMP-1, -2 그리고 Th-2 사이토카인의 변화에 미치는 영향을 조사함으로써, IFN-γ가 폐 섬유화증에 미치는 영향과 기전을 연구하고자 하였다.
- 이에 저자들은 폐 섬유화증의 대표적인 동물모델인 bleomycin 유도 백서 폐 섬유화 모델에서 IFN-γ의 투여가 폐의 MMP-2,-9과 TIMP-1,-2에 미치는 영향을 대조군과 비교하여 알아보고, IFN-γ의 투여에 따른 Th-2 사이토카인의 변화를 조사함으로써 IFN-γ가 폐 섬유화증을 호전시키는지 아니면 악화시키는지 알아보고 MMP와 TIMP의 작용과 Th-2 사이토카인에 영향과 기전을 연구하고자 하였다.
가설 설정
- 폐의 섬유화 정도는 Masson's trichrome 염색에서 섬유화 점수를 0, 비정상 소견이 없는 경우; 1, 폐포벽과 기관지벽에 미량의 섬유화; 3, 폐의 구조는 유지되고 있으나 폐포와 기관지벽에 중등도의 섬유화; 5, 폐 섬유화의 증가로 인해서 폐의 구조가 손상되고 작은 섬유화 종괴가 발견; 7, 폐 구조가 심하게 손상되고 커다란 섬유화 종괴가 발견;8, 시야가 섬유화로 완전히 대치된 경우로 정하였다. 구분이 어려운 경우는 중간 값을 취하였다.
제안 방법
- Louis, Mi)를 300 μl의 생리식염수에 섞어 기관 내로 주입하였다. Bleomycin+IFN-γ 군에서는 bleomycin군과 동일한 처치를 한 후 14일간 매일 400 μl의 phosphate buffer saline(PBS)에 섞은 IFN-γ(Peprotech, Rocky Hill, NJ)를 2×105 U/Kg 씩 14일간 근육주사 하였다. 정상 대조군에서는 bleomycin군과 동일한 방법으로 300 μl의 생리식염수를 기관 내로 주입하였으며, 정상 대조군과 bleomycin군은 PBS 400 μl 를 근육 내로 매일 14일간 주사하였다.
- Sprague-Dawley계의 수컷 흰쥐를 정상 대조군, bleomycin 군, bleomycin+IFN-γ 군의 세 군으로 나누어, bleomycin 군 과 bleomycin+IFN-γ 군은 bleomycin sulfate를 생리식염수에 섞어 기관 내로 주입하였고(6 U/kg), bleomycin+IFN-γ 군은 IFN-γ를 14일간 근육주사 하였다(2×105 U/kg). 실험동물은 3, 7, 14, 28일에 폐를 얻어 hematoxylin eosin 염색과 Masson's trichrome 염색을 하여 폐의 염증 반응과 섬유화 정도를 관찰하였고, 폐 조직 내의 hydroxyproline 함량, MMP-2, -9, TIMP-1, -2에 대한 Western blot, zymography와 reverse zymography, IL-4와 IL-13에 대한 ELISA 검사를 시행하였다.
- 실험동물은 3, 7, 14, 28일에 각 군마다 5마리씩 마취 후 실혈사 시킨 다음, 흉부 중앙을 절개하여 폐를 노출시킨 후 폐동맥으로 PBS를 관류시켜 혈액을 제거하였다. 관류 후 우측 폐는 기관지와 늑막 등의 결체 조직을 분리하고 PBS로 세척한 다음 잘게 분쇄하여 -70℃에 보관하였으며 hydroxy proline 측정, Western blot, zymography, reverse zymography 등의 실험에 이용하였다. 좌측 폐는 흉곽에서 분리한 후 4% neutral formalin을 주입하여 균일하게 팽창시키고, 4% neutral formalin에 넣어 보관 후 조직학적 검사에 이용하였다.
- 균질화 시킨 후 4℃, 2,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 얻은 상청액을 -20℃에서 보관하였 다. 균질액 내의 IL-4와 IL-13의 양은 구입한 IL-4 ELISA kit(Endogen, Woburn, MA)와 IL-13 ELISA kit(BioSource, Camarillo, CA)로 측정하였 다. 검사의 민감도는 IL-4<2 pg/ml, IL-13<1.
- 실험동물은 3, 7, 14, 28일에 각 군마다 5마리씩 마취 후 실혈사 시킨 다음, 흉부 중앙을 절개하여 폐를 노출시킨 후 폐동맥으로 PBS를 관류시켜 혈액을 제거하였다. 관류 후 우측 폐는 기관지와 늑막 등의 결체 조직을 분리하고 PBS로 세척한 다음 잘게 분쇄하여 -70℃에 보관하였으며 hydroxy proline 측정, Western blot, zymography, reverse zymography 등의 실험에 이용하였다.
- Sprague-Dawley계의 수컷 흰쥐를 정상 대조군, bleomycin 군, bleomycin+IFN-γ 군의 세 군으로 나누어, bleomycin 군 과 bleomycin+IFN-γ 군은 bleomycin sulfate를 생리식염수에 섞어 기관 내로 주입하였고(6 U/kg), bleomycin+IFN-γ 군은 IFN-γ를 14일간 근육주사 하였다(2×105 U/kg). 실험동물은 3, 7, 14, 28일에 폐를 얻어 hematoxylin eosin 염색과 Masson's trichrome 염색을 하여 폐의 염증 반응과 섬유화 정도를 관찰하였고, 폐 조직 내의 hydroxyproline 함량, MMP-2, -9, TIMP-1, -2에 대한 Western blot, zymography와 reverse zymography, IL-4와 IL-13에 대한 ELISA 검사를 시행하였다.
- 실험동물은 체중 200-250g의 무균(specific pathogen free, SPF) Sprague-Dawley계의 수컷 흰쥐를 사용하여, 무작위로 정상 대조군, bleomycin 군, bleomycin+IFN-γ 군의 세 군으로 나누었다.
- 절편을 폐 기저부에서 얻어 hematoxyline-eosin(H&E) 염색과 Masson's trichrome 염색을 하였다. 폐의 염증 정도는 H&E 염색에서 염증세포 침윤이나 간질 비후, 폐 구조가 파괴된 부위, 비정상적인 조직이 침착된 부위를 %로 나타내어 조사하였다.
- Bleomycin+IFN-γ 군에서는 bleomycin군과 동일한 처치를 한 후 14일간 매일 400 μl의 phosphate buffer saline(PBS)에 섞은 IFN-γ(Peprotech, Rocky Hill, NJ)를 2×105 U/Kg 씩 14일간 근육주사 하였다. 정상 대조군에서는 bleomycin군과 동일한 방법으로 300 μl의 생리식염수를 기관 내로 주입하였으며, 정상 대조군과 bleomycin군은 PBS 400 μl 를 근육 내로 매일 14일간 주사하였다.
- 관류 후 우측 폐는 기관지와 늑막 등의 결체 조직을 분리하고 PBS로 세척한 다음 잘게 분쇄하여 -70℃에 보관하였으며 hydroxy proline 측정, Western blot, zymography, reverse zymography 등의 실험에 이용하였다. 좌측 폐는 흉곽에서 분리한 후 4% neutral formalin을 주입하여 균일하게 팽창시키고, 4% neutral formalin에 넣어 보관 후 조직학적 검사에 이용하였다.
- 절편을 폐 기저부에서 얻어 hematoxyline-eosin(H&E) 염색과 Masson's trichrome 염색을 하였다. 폐의 염증 정도는 H&E 염색에서 염증세포 침윤이나 간질 비후, 폐 구조가 파괴된 부위, 비정상적인 조직이 침착된 부위를 %로 나타내어 조사하였다. 다음과 같은 기준으로 조직학적 등급을 평가하여 통계에 이용하였다.
- 반응이 끝난 다음 perchloric acid 1 ml를 넣고 5분간 반응시키고, ρ-dimethyl amino benzaldehyde 용액 1 ml를 넣고 60℃서 20분 동안 발색 반응을 일으켰다. 흡광도를 557 nm에서 측정하여 농도를 알고 있는 hydroxyproline standard로 구한 표준곡선를 이용하여 hydroxyproline의 양을 구하였다.
데이터처리
- 폐 조직의 염증정도, 섬유화 정도, hydroxyproline 함량, Western blot 검사, zymography 검사, ELISA 검사의 세 군간의 통계적 유의성은 Kruskal-Wallis test를 이용하여 검정하였고 서로 다른 두 군 간의 통계적 유의성은 Mann-Whitney U test를 이용하여 검정하였다. 모든 통계분석은 P<0.
이론/모형
- 세척 후 biotin 부착 이차항체를 첨가한 후, NovaRed(Vector, Burlingame, CA)로 상온에서 1시간 반응시켰다. Chemiluminescent detection 방법(ECL, Amersham Life Science, Piscataway NJ)을 이용하여 발색하였다.
- 1% SDS] 800 μl를 넣고 얼음 위에서 homogenizer(Tissue tearer, biospec, Bartlesville, OK)으로 10초 정도 균질화 시킨 후 Eppendorf tube에 넣고 원심분리를 한 다음(4℃, 1000g, 30 min), 상청액을 모아 -70℃에 보관하였다. 단백질의 농도는 Bradford assay를 이용하여 결정하였다.
성능/효과
- 1. 폐 염증은 bleomycin 투여 7일째에는 IFN-γ를 투여한 경우 더 심하게 일어났으나(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=2.08±0.15 : 2.74±0.29, P<0.05), 폐 섬유화는 bleomycin 투여 후 28일째 IFN-γ 투여에 의해 유의하게 감소되었다(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=3.94±0.43 : 2.46±0.13, P<0.05).
- 2. 폐 내 hydroxyproline 함량은 bleomycin 투여 28일 후 IFN-γ 투여에 의해 유의하게 감소되었다(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=294.04±31.73 μg/g : 194.92±15.51 μg/g, P<0.05).
- 3. Bleomycin 투여에 의해 MMP-2 단백질의 양이 증가되는 소견이 Western blot에서 관찰되었는데 MMP-2의 증가는 bleomycin 투여 14일에 최고에 이르렀으며, IFN-γ의 투여에 의해 bleomycin에 의한 MMP-2의 증가는 억제되었으나 대조군 수준으로 감소하지는 않았다.
- 4. Zymography 검사에서 bleomycin 투여 3일째에는 활성화된 형태의 MMP-2가 IFN-γ에 의해 유의하게 증가되었으나(bleomycin 군 : bleomycin+ IFN-γ 군=209.63±7.60% : 407.66±85.34%, P<0.05), 투여 14일 후에서는 IFN-γ에 의해 활성화 된 상태의 MMP-2가 유의하게 감소되었다(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=159.36±20.93%: 97.23±12.50%, P<0.05).
- 5. Bleomycin을 투여한 후 bleomycin 군과 bleomycin+IFN-γ 군 모두에서 IL-4의 양이 감소되었으나, 두 군간 차이는 통계적으로 유의하지는 않았고, IL-13은 별 다른 차이가 없었다.
- 05, denote significant differences in values measured in bleomycin treated group compared with corresponding bleomycin+INF-γ treated group(n=5). 7 days after blcomycin instillation, inflammatory changes were more severe in bleomycin+INF-γ group than the bleomycin group.
- Bleomycin 군과 bleomycin+IFN-γ 군은 처음 3일 째에 염증 정도는 양군에 서 유의한 차이가 없이 폐 실질에 전반적으로 가벼운 정도의 염증성 변화가 관찰되었으나, 7일째부터 양 군 모두 폐 실질의 심한 염증성 변화가 관찰되었다. 7일 후의 염증성 변화는 bleomycin+IFN-γ 군에서 보다 더 심하게 일어나, 염증 지수에서 bleomycin 군과 유의한 차이를 보였다(bleomycin 투여군 : bleomycin+IFN-γ투여군 =2.08±0.15 : 2.74±0.29, P<0.05). 염증성 변화는 14일에도 심하게 일어났지만 양 군간 유의한 차이는 없었으며, 28일에는 염증성 변화는 거의 소실되었으나 bleomycin 군이 bleomycin+IFN-γ 군보다 섬유성 변화가 심한 염증 병소가 더 많이 남아있는 경향을 보였다(그림 1, 2).
- 생리 식염수를 투여한 정상 대조군은 투여 후 3일에서 28일까지 기관지 주위 림프조직의 비후 외에 폐 조직의 특별한 염증이나 섬유화 변화는 없었다. Bleomycin 군과 bleomycin+IFN-γ 군은 처음 3일 째에 염증 정도는 양군에 서 유의한 차이가 없이 폐 실질에 전반적으로 가벼운 정도의 염증성 변화가 관찰되었으나, 7일째부터 양 군 모두 폐 실질의 심한 염증성 변화가 관찰되었다. 7일 후의 염증성 변화는 bleomycin+IFN-γ 군에서 보다 더 심하게 일어나, 염증 지수에서 bleomycin 군과 유의한 차이를 보였다(bleomycin 투여군 : bleomycin+IFN-γ투여군 =2.
- Bleomycin 군과 bleomycin+IFN-γ 군의 MMP2의 총량이 양 군간 별다른 차이가 없고, IFN-γ군에서 후기 폐 섬유화가 억제되어 있는 것을 감안할 때, 폐의 섬유화의 형성에 MMP-2의 활성화가 중요한 역할을 한다는 것을 본 실험으로 알 수 있었다. IFN-γ가 폐 섬유화를 억제하는 기전에 관한 최근의 연구에 의하면 IFN-γ는 강력한 섬유화 사이토카인인 TGF-β를 억제함으로써 섬유화가 일어나지 않도록 하는 것으로 알려지고 있는데7 , IFN-γ가 MMP-2의 활성화에 어떠한 영향을 미치는 지에 대해서는 아직 잘 알려져 있지 않다.
- Bleomycin 투여 초기인 3일째에는 bleomycin 군과 bleomycin+IFN-γ 군에서 비활성 MMP-2와 활성화된 MMP-2를 합한 MMP-2의 총량은 양 군 간별 다른 차이가 없는데 비해서 활성화된 형태의 MMP-2가 bleomycin+IFN-γ 군에서 유의하게 증가되어 있었고 (bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ군=209.63±7.60% : 407.66±85.34%, P<0.05), MMP-2의 활성화 비도 bleomycin+IFN-γ 군에서 유의하게 증가되어 있었다(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=0.36±0.03 : 0.64±0.13, P<0.05). 투여 7일 후에는 MMP-2의 양은 대조군에 비하여 증가된 상태로 있었지만 양 군간 유의한 차이는 없었고 bleomycin+IFN-γ 군에서 관찰되었던 활성된 형태의 MMP-2의 증가는 관찰되지 않았다.
- Bleomycin 투여에 의해 MMP-2 단백질의 양이 증가되는 소견이 Western blot검사에서 관찰되었는데, MMP-2의 증가는 bleomycin 투여 14일에 최고에 이르렀고, 28일째에는 생리식염수 수준으로 감소하였다. IFN-γ의 투여에 의해 bleomycin에 의한 MMP-2의 증가는 억제되었으나, 대조군 수준으로 감소하지는 않았다(그림 5).
- Bleomycin에 의한 백서 폐 섬유화 모델에서 IFNγ는 초기 폐 염증을 증가시키지만 후기 폐 섬유화는 억제시킨다는 것을 알 수 있었다. IFN-γ가 폐 섬유화를 억제하는 것은 MMP-2의 활성화를 억제하기 때문인 것으로 생각한다.
- Bleomycin 투여에 의해 MMP-2 단백질의 양이 증가되는 소견이 Western blot검사에서 관찰되었는데, MMP-2의 증가는 bleomycin 투여 14일에 최고에 이르렀고, 28일째에는 생리식염수 수준으로 감소하였다. IFN-γ의 투여에 의해 bleomycin에 의한 MMP-2의 증가는 억제되었으나, 대조군 수준으로 감소하지는 않았다(그림 5). MMP-2와는 달리 MMP-9, TIMP-1은 유의한 특징을 관찰할 수 없었으며, TIMP-2는 Western blot 검사에 의해 검출되지 않았다.
- 본 실험에서 폐 섬유화 과정에서 Th-1과 Th-2사이토카인의 상호작용을 알아보기 위하여 IFNγ투여 후 IL-4와 IL-13의 변화를 조사한 결과, bleomycin 투여에 의해 IL-4는 감소되었으나 통계적으로 유의하지 않았고, 길항작용을 하는 IFN-γ에 의해서도 억제되지 않았다. IL-13도 bleomycin 투여나 IFN-γ에 의해서도 영향을 받지 않았고, bleomycin 투여 후 IFN-γ를 투여한 군이나 IFNγ를 투여하지 않은 군이나 모두에서 큰 변화 없이 거의 일정한 수준을 유지하였다.
- MMP-9은 초기인 투여 3일 후에는 bleomycin군과 bleomycin+IFN-γ 군 모두에서 증가하였으나 유의한 차이는 관찰할 수 없었고, 시간이 지나면서 MMP-2와는 반대로 MMP-9의 양과 활성도가 양 군 모두 감소하였다.
- Madetes 들31은 TIMP-1과 -2가 bleomycin에 의한 폐 손상에서 폐 섬유화에 중요한 역할을 함을 보고했으나, 본 실험에서는 TIMP-1가 TIMP-2가 zymography와 Western blot 모두에서 잘 검출되지 않았고, 검출이 되더라도 미량으로 유의한 변화를 볼 수 없었다. 여러 보고6,32에 의하면 폐의 섬유화가 진행되는 것은 TIMPs의 작용이 중요한 요인으로 지적되어 왔는데, 본 실험에서 TIMP의 작용은 미미하며 MMP-2를 중심으로 하는 MMP가 폐 섬유화에 중요한 역할을 하는 것에 대해서는 실험동물이나 방법의 차이 등 여러 원인이 있을 것으로 생각되며, 이에 대해서는 보다 더 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- *.P<0.05, denote significant differences in values measured in bleomycin treated group compared with corresponding bleomycin+INF-γ treated group (n=5) 28 day after bleomycin instillation, lung fibrosis was significantly reduced by INF-γ treatment.
- Reverse zymography를 이용하여 MMP들을 억제하는 TIMP-1과 TIMP-2의 변화를 조사하였으나 MMP들에 비하여 적게 검출되었으며 bleomycin 투여에 의해 별다른 변화를 보이지 않았다.
- 결론적으로 bleomycin에 의한 폐 섬유화 모델에서 IFN-γ투여에 의해 초기 폐 염증은 증가하지만 후기 폐 섬유화는 억제된다는 것을 알 수 있었고, IFN-γ가 폐 섬유화를 억제하는 것은 MMP-2의 활성화를 IFN-γ가 억제하기 때문인 것으로 생각된다.
- 폐 hydroxyproline 함량은 생리식염수 대조군에 비해서 bleomycin 군, bleomycin+IFN-γ 군 모두에서 초기부터 유의하게 증가하여 있었고 14일까지 계속 증가하였으나 양 군간 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 bleomycin 투여 28일 후 bleomycin+IFN-γ 군에서는 hydroxyproline의 폐 내 함량이 생리식염수 대조군과 비슷하거나 낮은 수준으로 감소한 반면 bleomycin 군에서는 14일보다는 감소했으나 bleomycin+IFN-γ 군 보다는 hydroxyproline의 폐 함량이 유의하게 증가한 상태로 유지되고 있었다(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=294.04±31.73 μg/g : 194.92±15.51 μg/g, P<0.05).
- IFN-γ가 폐 섬유화를 억제하는 것은 MMP-2의 활성화를 억제하기 때문인 것으로 생각한다. 또한 IFN-γ에 의한 MMP-2의 기능 억제는 Th-2 사이토카인을 억제하여 이루어지는 것 같지는 않았다.
- 본 실험에서 bleomycin 투여에 의한 초기 염증반응에 있어서 특징은 투여 후 3일에는 bleomycin＋IFN-γ 군이나 bleomycin 군 양 군 사이에 폐 염증 변화에는 유의한 차이가 없었지만, 투여 후 7일에는 bleomycin＋IFN-γ 군에서 더 심하게 염증성 변화가 관찰된 것이다. 이러한 차이가 나타난 원인을 Izbicki 들의 실험결과를 고려하여 해석해보면, 중성구가 주로 폐 염증을 일으키는 bleomycin 투입 초기인 3일에는 IFN-γ의 투여가 별다른 영향을 주지 않지만, 림프구가 침윤되기 시작하는 시기에 IFN-γ가 주된 영향을 미쳐서 비교적 후기인 투여 후 7일의 폐 염증이 심해진 것으로 생각된다.
- 본 실험에서 가장 특징적인 소견은 폐 섬유화를 억제한다고 알려진 IFN-γ 투여에 의해서 폐 섬유화가 가장 활발하게 일어나는 bleomycin 투여후 14일 경의 폐 조직에서 활성화된 MMP-2의 비율이 유의하게 감소한다는 것, 즉 MMP-2의 활성화가 폐 섬유화 형성에 가장 중요한 시기에 IFN-γ 투여에 의해서 억제된다는 있다는 것이다.
- 본 실험에서 폐 섬유화 과정에서 Th-1과 Th-2사이토카인의 상호작용을 알아보기 위하여 IFNγ투여 후 IL-4와 IL-13의 변화를 조사한 결과, bleomycin 투여에 의해 IL-4는 감소되었으나 통계적으로 유의하지 않았고, 길항작용을 하는 IFN-γ에 의해서도 억제되지 않았다. IL-13도 bleomycin 투여나 IFN-γ에 의해서도 영향을 받지 않았고, bleomycin 투여 후 IFN-γ를 투여한 군이나 IFNγ를 투여하지 않은 군이나 모두에서 큰 변화 없이 거의 일정한 수준을 유지하였다.
- 본 실험에서도 MMP-9은 IFN-γ 투여 초기에는 증가하다가 시간이 지나면서 감소되어 거의 검출이 안되는 수준으로 감소하였는데, 위의 여러 실험결과와 종합하여 볼 때 MMP-9이 bleomycin 폐 섬유화 모델에서는 폐 염증과 섬유화에 별다른 중요한 역할을 하지 않기 때문에, bleomycin 투여 후 오히려 감소했을 것으로 생각된다.
- 생리 식염수를 투여한 정상 대조군은 투여 후 3일에서 28일까지 기관지 주위 림프조직의 비후 외에 폐 조직의 특별한 염증이나 섬유화 변화는 없었다. Bleomycin 군과 bleomycin+IFN-γ 군은 처음 3일 째에 염증 정도는 양군에 서 유의한 차이가 없이 폐 실질에 전반적으로 가벼운 정도의 염증성 변화가 관찰되었으나, 7일째부터 양 군 모두 폐 실질의 심한 염증성 변화가 관찰되었다.
- 투여 7일 후에는 MMP-2의 양은 대조군에 비하여 증가된 상태로 있었지만 양 군간 유의한 차이는 없었고 bleomycin+IFN-γ 군에서 관찰되었던 활성된 형태의 MMP-2의 증가는 관찰되지 않았다. 투여 14일 후에서는 특징적으로 bleomycin+IFNγ 군이 bleomycin 군보다 활성화된 상태의 MMP-2의 양이 유의하게 감소되었고(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=159.36±20.93% : 97.23±12.50%, P<0.05) 이에 따라 MMP-2의 활성화 비도 bleomycin+IFN-γ군에서 유의하게 감소하였다(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ군=0.54±0.04 : 0.71±0.31, P<0.05). 투여 28일 후에는 양 군 모두 MMP-2의 양이 감소하였고 활성화 상태의 MMP-2도 감소하였다(그림 6).
- 05). 투여 28일 후에는 양 군 모두 MMP-2의 양이 감소하였고 활성화 상태의 MMP-2도 감소하였다(그림 6).
- 05). 투여 7일 후에는 MMP-2의 양은 대조군에 비하여 증가된 상태로 있었지만 양 군간 유의한 차이는 없었고 bleomycin+IFN-γ 군에서 관찰되었던 활성된 형태의 MMP-2의 증가는 관찰되지 않았다. 투여 14일 후에서는 특징적으로 bleomycin+IFNγ 군이 bleomycin 군보다 활성화된 상태의 MMP-2의 양이 유의하게 감소되었고(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=159.
- 폐 hydroxyproline 함량은 생리식염수 대조군에 비해서 bleomycin 군, bleomycin+IFN-γ 군 모두에서 초기부터 유의하게 증가하여 있었고 14일까지 계속 증가하였으나 양 군간 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 그러나 bleomycin 투여 28일 후 bleomycin+IFN-γ 군에서는 hydroxyproline의 폐 내 함량이 생리식염수 대조군과 비슷하거나 낮은 수준으로 감소한 반면 bleomycin 군에서는 14일보다는 감소했으나 bleomycin+IFN-γ 군 보다는 hydroxyproline의 폐 함량이 유의하게 증가한 상태로 유지되고 있었다(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=294.
- 폐의 섬유화 지수는 bleomycin 투여 후 증가하여 14일에 최고 수준에 다다랐으며 28일에는 양 군 모두 섬유화 지수가 감소하는 경향을 보였으나, bleomycin+IFN-γ 군이 bleomycin 군 보다 섬유화 지수가 유의하게 감소하였다(bleomycin 군 : bleomycin+IFN-γ 군=3.94±0.43 : 2.46±0.13, P<0.05)(그림 3).
후속연구
- IFN-γ가 발현되지 않는 쥐 bleomycin 폐 섬유화 모델에서 IL-4가 증가되어 있지 않고33, bleomycin에 의해 폐 섬유화가 잘 일어나는 동물품종에서 IL-4 mRNA가 증가되어 있지 않는 등34 여러 실험에서 IFN-γ와 IL-4는 독립적인 발현양상을 보이는 것이 관찰되었는데, 본 실험의 결과도 위의 실험과 같이 IFN-γ가 MMP를 조절하는 것은 Th-1과 Th-2 사이토카인의 상호조절에 의한 것이 아닌 다른 기전에 의한 것이기 때문일 가능성이 크다는 것을 말해준다. 그러나 IL-4 결핍 생쥐 모델에서 bleomycin을 투여하면 정상 생쥐에 비해서 유의하게 후기 폐 섬유화가 감소되는 등35, 많은 연구에서 IL-4가 폐 섬유화에 중요한 역할을 하는 것은 확실한 것으로 여겨지기 때문에, 폐 섬유화에서 Th-1과 Th-2 사이토카인의 역할과 상호작용에 대해서는 보다 자세한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 일부에서는 MMP가 조직의 파괴를 증가시켜 폐 섬유화를 촉진한다고 주장하는가 하면22,23 일부에서는 세포 외 기질을 분해하여 폐 섬유화를 억제한다고 주장하기도 하였다14. 그러나 본 실험에서 MMP-2의 활성화가 증가할수록 폐 섬유화가 심한 것으로 보아 MMP-2가 폐 섬유화를 악화시키는 것으로 판단되지만 본 실험은 동물실험이며 bleomycin에 의한 급성 폐 섬유화 모델이기 때문에 사람의 폐 섬유화증에 일반적으로 적용하기에는 무리가 있을 것으로 보인다.
- . 따라서 본 실험에서 bleomycin+IFN-γ 군에서 후기 폐 섬유화가 bleomycin 군에 비해서 억제된 것은 IFN-γ의 투여에 의해서 TGF-β가 억제되면서 MMP-2의 활성화가 억제되었기 때문이 아닐까도 추측될 수 있는데, 이에 대해서는 아직 알려진 것이 부족하기 때문에 IFN-γ에 의한 MMP-2의 비활성화에 대해서는 보다 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 본 논문을 기초로 향후 IFN-γ가 MMP-2의 활성화를 조절하는 기전과 MMP-2의 활성화가 폐 섬유화에 미치는 영향에 대한 연구가 필요할 것으로 생각한다.
- 본 연구를 기초로 폐 섬유화증에서 MMP-2의 활성화를 조절하는 기전과 MMP-2의 활성화가 폐섬유화에 미치는 영향에 대한 연구가 필요할 것으로 생각되며, bleomycin 이외의 다른 종류의 폐 손상에서 MMP-2의 활성화에 대해서도 연구가 필요하리라고 생각된다.
- 은 TIMP-1과 -2가 bleomycin에 의한 폐 손상에서 폐 섬유화에 중요한 역할을 함을 보고했으나, 본 실험에서는 TIMP-1가 TIMP-2가 zymography와 Western blot 모두에서 잘 검출되지 않았고, 검출이 되더라도 미량으로 유의한 변화를 볼 수 없었다. 여러 보고6,32에 의하면 폐의 섬유화가 진행되는 것은 TIMPs의 작용이 중요한 요인으로 지적되어 왔는데, 본 실험에서 TIMP의 작용은 미미하며 MMP-2를 중심으로 하는 MMP가 폐 섬유화에 중요한 역할을 하는 것에 대해서는 실험동물이나 방법의 차이 등 여러 원인이 있을 것으로 생각되며, 이에 대해서는 보다 더 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 하지만 특발성 폐 섬유화 환자를 대상으로 한 여러 연구에 의하면28, 폐 조직에서 MMP-9이 다른 MMP 보다 유의하게 증가하는 것을 보고한 바 있는데 이런 차이가 관찰되고 있는 것은 bleomycin 폐 섬유화 모델이 특발성 폐 섬유화증과 다른 차이점에 기인할 수도 있기 때문에 이에 대한 보다 많은 연구가 필요하리라 생각된다.
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