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문제 정의
- FHIT 유전자의 발현이 항암제에 의한 세포의 사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해 FHIT가 결손된 폐암 세포주인 NCI-H358 세포에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후 항암제에 대한 반응의 변화를 살펴보고자 하였다. FHIT 유전자를 삽입한 plasmid인 pRc/CMV-FHIT를 transfection 시켰을 때, transfection을 시키지 않은 세포나 FHIT 유전자를 삽입하지 않은 plasmid인 pRc/CMV를 transfection 시킨 세포에서는 관찰되지 않는 FHIT 단백질의 발현을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 하지만 아직까지 FHIT 단백질의 기능에 대한 지식은 미진한 상태이다. 본 연구에서는 FHIT 유전자를 폐암 세포에 이입시켰을 때 유발되는 apoptosis의 기전을 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 FHIT 유전자를 폐암 세포에 이입시켰을 때 유발되는 apoptosis의 기전을 규명하여 FHIT 단백질의 기능을 알아보고자 하였다. 이를 위하여 FHIT 유전자가 결손된 폐암세포주에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후 항암제를 가하고 apoptosis가 항진되어 나타나는가를 조사해 보았다.
- 본 연구에서도 caspase system의 활성화를 관찰할 수 있었다. FHIT가 발현된 세포에서는 PARP의 바로 위 단계에 있는 caspase-7과 그 위 단계의 caspase-3 활성화가 유의하게 증가되는 것이 관찰되었다.
- 폐암 세포주에서 FHIT transfection이 paclitaxel이나 cisplatin에 의해 유발되는 apoptosis에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. FHIT가 transfection된 세포와 그렇지 않은 세포에 각각 paclitaxel 0-5 μg/ml 혹은 cisplatin 0-30 μg/ml을 가하고, 48-72시간 후 세포 생존율을 분석하여 비교해 보았다.
제안 방법
- 나아가 이러한 caspase-3. -7 활성화의 증가가 apoptosis의 증가와 직접 관련되어 있는지를 확인하기 위하여, pan-caspase inhibitor인 Z-VAD-FMK를 10 μM로 1시간동안 전처치한 후 paclitaxel을 투여하고 PARP의 분해와 세포 생존율의 변화를 관찰해 보았다(Fig. 9). H358-pRc/CMV, H358-pRc/CMVFHIT 세포 모두에서 paclitaxel 투여 48시간째에 관찰되던 PARP의 분해가 Z-VAD-FMK의 투여에 의해 소실됨이 확인되었다(Fig.
- 48시간이 지난 후에 G418 700 μg/ml이 첨가된 10% FBS RPMI 1640 배지로 교환한 뒤 selection을 시작하였다. 2주간 G418로 selection을 시행한 후 G418-resistant colony를 isolation하여 배양하였다. 형성된 colony는 rabbit polyclonal anti-FHIT 항체로 Western blotting을 시행하여 FHIT 발현을 확인하였다.
- 여기에 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)를 1 μg/ml 농도로 가한 후 30분 동안 염색하였다. 3번의 세척 후 형광현미경으로 관찰하였다.
- 6 μg을 첨가하고 또 다른 RPMI 1640 배지 100 μl에 2 mg/ml의 LipofectamineTM Reagent 2-20 μl를 첨가한 뒤, 두 용액을 부드럽게 혼합하여 실온에 15-45분 정도 유지하였다. 50-80% 정도 confluent해진 세포를 RPMI 1640 배지로 씻어낸 뒤 0.8 ml의 배지로 다시 채우고 여기에 위의 혼합액을 상층으로 가한 뒤 CO2 incubator에 37℃에서 5시간 동안 유지하였고, 5시간 후 20% FBS가 첨가된 RPMI 1640 배지 1 ml을 첨가하였다. 48시간이 지난 후에 G418 700 μg/ml이 첨가된 10% FBS RPMI 1640 배지로 교환한 뒤 selection을 시작하였다.
- FHIT 유전자가 결손된 NCI-H358 세포주에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후, cisplatin 혹은 paclitaxel을 가하고 apoptosis가 항진되어 나타나는가를 DAPI staining과 flow cytometry로 관찰해 보았다. 또한 이 과정에서 나타나는 caspase system의 변화와 Bcl-2 family의 변화를 Western blotting으로 조사해 보았다.
- 폐암 세포주에서 FHIT transfection이 paclitaxel이나 cisplatin에 의해 유발되는 apoptosis에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. FHIT가 transfection된 세포와 그렇지 않은 세포에 각각 paclitaxel 0-5 μg/ml 혹은 cisplatin 0-30 μg/ml을 가하고, 48-72시간 후 세포 생존율을 분석하여 비교해 보았다.
- (B) Dose-dependent effect of paclitaxel on the cell survival. NCI-H358 cells were incubated with 0, 0.0005, 0.005, 0.05, 0.5, 5 μg/ml of paclitaxel for 48 hours. Cell viability was assayed by MTT assay.
- NCI-H358 폐암 세포주에 cisplatin을 72시간 동안, paclitaxel을 48시간 동안 농도별로 투여하고 세포의 생존율을 MTT assay로 조사하였다. Cisplatin을 0-30 μg/ml 농도까지, paclitaxel을 0-5 μg/ml 농도까지 투여하였을 때, 농도를 증가시킴에 따라 세포의 생존율은 지속적으로 감소함을 관찰할 수 있었다(Fig.
- RIPA buffer (1% Nonidet P-40, 0.1% SDS, 0.5% Deoxycholic acid, 50 mM Tris-Hcl (pH 7.5), 150mM NaCl, 0.5 mM PMSF, 5 μg/ml Leupeptin, 5μg/ml Aprotinin, 1 mM Na3VO4, 3 mM DTT)를 이용하여 총세포 단백을 추출하였다. 50 μg의 세포 단백을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동 시켰다.
- 이 vector 역시 XbaI과 HindIII의 restriction site를 가지고 있다. XbaI/HindIII로 digestion 시킨 pRc/CMV vector에 역시 같은 효소로 digestion시킨 RT-PCR product를 ligation시켰다. 완성된 plasmid (pRc/CMV-FHIT)는 sequencing을 시행하여 염기 서열을 확인하였다.
- FHIT 유전자가 결손된 NCI-H358 세포주에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후, cisplatin 혹은 paclitaxel을 가하고 apoptosis가 항진되어 나타나는가를 DAPI staining과 flow cytometry로 관찰해 보았다. 또한 이 과정에서 나타나는 caspase system의 변화와 Bcl-2 family의 변화를 Western blotting으로 조사해 보았다.
- 이를 위하여 FHIT 유전자가 결손된 폐암세포주에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후 항암제를 가하고 apoptosis가 항진되어 나타나는가를 조사해 보았다. 또한 이 과정에서 나타나는 몇몇 apoptosis 관련 단백질들의 변화를 살펴보았다.
- 하지만 그 보다 위 단계에 있는 caspase-8, -9의 차이는 관찰할 수 없었다. 또한, 이러한 caspase 활성화가 apoptosis 유발에 직접적으로 관련되어 있음을 Z-VAD-FMK를 이용한 억제 실험으로 확인하였다. 폐암 세포에 대한 기존의 연구에서는 caspase-8의 활성화만이 관찰되었으나25, 이는 NCI-H460 세포에 대한 실험 결과로서 본 연구와는 차이를 보이는 것으로 생각된다.
- 먼저 human FHIT cDNA 중 coding region인 exon 5에서 exon 9에 해당하는 cDNA를 얻기위해 정상 조직에서 뽑은 RNA로부터 이 부위를 cover하는 primer를 이용하여 RT-PCR을 시행하였다. 이때 사용한 primer는 XbaI과 HindIII의 restriction site를 가지고 있도록 제작하였다18.
- 100 μl의 부유액을 5 ml culture tube에 옮긴 뒤 5 μl의 annexin V-FITC와 5 μl의 propidium iodide를 첨가하였다. 세포를 vortex하고 어두운 실온에 15분간 놔둔 뒤 1X annexin V binding buffer 400 μl를 첨가하여 한 시간 이내에 flow cytometry 분석을 시행하였다.
- XbaI/HindIII로 digestion 시킨 pRc/CMV vector에 역시 같은 효소로 digestion시킨 RT-PCR product를 ligation시켰다. 완성된 plasmid (pRc/CMV-FHIT)는 sequencing을 시행하여 염기 서열을 확인하였다.
- 활성화된 caspase에 의한 단백 분해는 apoptosis에서 관찰되는 특징적인 소견으로서, DNA의 분절화와 함께 세포 사멸 과정을 비가역적인 과정이 되게 한다. 위에서 관찰된 FHIT 단백질 발현에 의해 유발되는 apoptosis의 증가 과정에 caspase system이 관여하는지를 평가하기 위하여 H358-pRc/CMV 세포와 H358-pRc/CMV-FHIT 세포에 paclitaxel을 투여한 후 caspase-3, -7, -8, -9의 활성을 Western blot 분석으로 조사하였다(Fig. 8). 32 kDa의 caspase-3는 12 kDa 분절로 분해되어 활성화됨이 알려져 있다.
- 위의 H358, H358-pRc/CMV, H358-pRc/CMVFHIT 세 가지 세포에 각각 항암제를 가하고 이 때 발생하는 apoptosis에 차이가 나타나는가를 조사해 보았다. Cisplatin을 0-30 μg/ml 농도로 72 시간 동안 투여하였을 때 H358-pRc/CMV-FHIT 세포는 나머지 두 세포에 비해 통계적으로 유의하게 생존율이 감소하였다 (p<0.
- 5). 이러한 세포 생존율의 감소가 apoptosis에 기인한 것인지를 확인하기 위해 H358-pRc/CMV 세포와 H358-pRc/CMV-FHIT 세포에 항암제를 투여한 후 DAPI staining과 FACS 분석을 시행하였다. Cisplatin을 투여하고 48시간 후 관찰하였을 때, H358-pRc/CMV-FHIT 세포는 H358-pRc/CMV 세포에 비해 DAPI staining상 apoptosis가 유의하게 증가되어 있었으며 FACS 결과에서도 apoptosis 분획이 증가되어 있음을 확인할 수 있었다 (각각 23.
- 3). 이렇게 FHIT가 stable transfection된 세포에서 항암제를 투여하기 전 기저 상태에서 생존율에 차이가 있는지를 MTT assay로 분석해 보았다. Transfection을 시키지 않은 NCI-H358 세포의 생존율을 100%로 하였을 때 FHIT 유전자를 삽입하지 않은 plasmid인 pRc/CMV를 transfection시킨 세포 (H358-pRc/CMV)와 FHIT 유전자를 삽입한 plasmid인 pRc/CMV-FHIT를 transfection시킨 세포 (H358-pRc/CMV-FHIT)에서 모두 차이를 보이지 않았다(Fig.
- 본 연구에서는 FHIT 유전자를 폐암 세포에 이입시켰을 때 유발되는 apoptosis의 기전을 규명하여 FHIT 단백질의 기능을 알아보고자 하였다. 이를 위하여 FHIT 유전자가 결손된 폐암세포주에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후 항암제를 가하고 apoptosis가 항진되어 나타나는가를 조사해 보았다. 또한 이 과정에서 나타나는 몇몇 apoptosis 관련 단백질들의 변화를 살펴보았다.
- 한편, FHIT 단백질 발현에 의해 유발되는 apoptosis의 증가 과정에 Bcl-2 family가 관여하는지를 평가하기 위하여 H358-pRc/CMV 세포와 H358-pRc/CMV-FHIT 세포에 paclitaxel을 투여한 후 Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bad의 활성을 Western blot 분석으로 조사하였다(Fig. 10). Bcl-2 family는 미토콘드리아의 투과성과 cytochrome c의 분비를 조절함으로써 apoptosis를 제어함이 잘 알려져 있다.
- 항암제를 투여하였을 때 나타나는 세포 사멸 과정 중 혹시 FHIT 단백질의 발현에 어떠한 변화가 나타나는지를 알아보기 위해, FHIT가 결손되지 않은 세포주인 NCI-H1573과 A549 세포주에 항암제를 투여하고 FHIT 발현을 Western blotting으로 관찰하였다(Fig. 2). 먼저 cisplatin 3 μg/ml을 투여하고 시간별로 관찰하였을 때 NCI-H1573과 A549 세포 모두에서 시간 경과에 따른 FHIT 단백질의 발현 증가를 관찰할 수 있었다.
대상 데이터
- ECL Western blotting detection systemTM은 Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, USA)의 제품이었고, LipofectamineTM Reagent는 Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)의 제품이었다. Annexin V-FITC, annexin V binding buffer, propidium iodide, mouse monoclonal anticaspase-8 항체, rabbit polyclonal anti-caspase-9 항체는 PharMingen (San Diego, CA, USA)에서, Z-VAD-FMK는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- 이때 사용한 primer는 XbaI과 HindIII의 restriction site를 가지고 있도록 제작하였다18. Cytomegalovirus (CMV) immediate early gene의 enhancer-promotor sequence와 neomycin resistant gene을 포함하고 있는 eukaryotic expression vector인 pRc/CMV plasmid (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 구입하였다. 이 vector 역시 XbaI과 HindIII의 restriction site를 가지고 있다.
- Paclitaxel, cisplatin, 3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)- 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 용액, 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Rabbit polyclonal anti-FHIT 항체는 Zymed (South San Francisco, CA, USA)에서, mouse polyclonal anti-PARP 항체, mouse monoclonal anti-Bcl-2 항체, rabbit polyclonal anti-Bcl-xL 항체, rabbit polyclonal anti-Bad 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서, rabbit polyclonal anti-cleaved caspase-3 (Asp175) 항체, rabbit polyclonal anti-cleaved caspase-7 (Asp178) 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서, rabbit polyclonal anti-Bax 항체는 DakoCytomation (Carpinteria, CA, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Rabbit polyclonal anti-FHIT 항체는 Zymed (South San Francisco, CA, USA)에서, mouse polyclonal anti-PARP 항체, mouse monoclonal anti-Bcl-2 항체, rabbit polyclonal anti-Bcl-xL 항체, rabbit polyclonal anti-Bad 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서, rabbit polyclonal anti-cleaved caspase-3 (Asp175) 항체, rabbit polyclonal anti-cleaved caspase-7 (Asp178) 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서, rabbit polyclonal anti-Bax 항체는 DakoCytomation (Carpinteria, CA, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. ECL Western blotting detection systemTM은 Amersham Biosciences (Piscataway, NJ, USA)의 제품이었고, LipofectamineTM Reagent는 Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)의 제품이었다.
- 폐암 세포주 중 FHIT 단백질의 발현이 결손된 것으로 알려져 있는 NCI-H358 세포를 10% fetal bovine serum (FBS), 100 μg/ml의 streptomycin이 첨가된 RPMI 1640 배지에 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. NCI-H358 세포에 FHIT gene을 transfection한 세포는 위와 동일한 조건 하에서 700 μg/ml의 G418 (geneticin)을 첨가하여 배양하였다.
데이터처리
- 배양액을 제거한 후 50 μl의 DMSO를 첨가하여 녹이고 분광광도계를 이용하여 590 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 4개 well의 성적을 분석하였다.
- 농도별 세포 생존율의 차이는 SPSS for Windows Release 11.0 프로그램의 Mann-Whitney U-test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- 3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 96-well plate에 well당 1×104개의 세포를 분주하고 4-5시간 뒤 항암제를 처리하여 정해진 시간 동안 배양하였다.
- 5, 5 μg/ml of paclitaxel for 48 hours. Cell viability was assayed by MTT assay. Data are shown as mean percentage of control ± standard deviation.
- 일차 항체들의 반응 농도는 rabbit polyclonal anti-FHIT 항체가 1:500, mouse polyclonal anti-PARP 항체가 1:1000, rabbit polyclonal anticleaved caspase-3 (Asp175) 항체가 1:1000, rabbit polyclonal anti-cleaved caspase-7 (Asp178) 항체가 1:1000, mouse monoclonal anti-caspase-8 항체가 1:500, rabbit polyclonal anti-caspase-9 항체가 1:1000, mouse monoclonal anti-Bcl-2 항체가 1:1000, rabbit polyclonal anti-Bcl-xL 항체가 1:500, rabbit polyclonal anti-Bax 항체가 1:500, rabbit polyclonal anti-Bad 항체가 1:200 이었다. 세척 후 이차 항체를 1:2000-1:10000으로 첨가하여 반응시킨 후 면역신호의 검출은 ECL Western blotting detection systemTM을 이용하였다.
- 6). 한편, apoptosis의 특징적 소견인 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)의 분해를 시간 경과에 따라 Western blotting으로 조사해보았다. H358-pRc/CMV와 H358-pRc/CMV-FHIT 세포에 3 μg/ml의 cisplatin 혹은 0.
- 2주간 G418로 selection을 시행한 후 G418-resistant colony를 isolation하여 배양하였다. 형성된 colony는 rabbit polyclonal anti-FHIT 항체로 Western blotting을 시행하여 FHIT 발현을 확인하였다.
성능/효과
- 32 kDa의 caspase-3는 12 kDa 분절로 분해되어 활성화됨이 알려져 있다. 0.1 μg/ml의 paclitaxel을 투여하고 0, 24, 48, 72 시간 후에 cleaved caspase-3를 관찰하였을 때, H358-pRc/CMV, H358-pRc/CMVFHIT 세포 모두에서 48시간째에 cleaved caspase-3의 발현이 나타났으나 H358-pRc/CMVFHIT에서 훨씬 강하게 발현되었다. Cleaved caspase-7 (20 kDa)에 있어서도 같은 소견을 관찰할 수 있었다.
- NCI-H358 폐암 세포주에 cisplatin을 72시간 동안, paclitaxel을 48시간 동안 농도별로 투여하고 세포의 생존율을 MTT assay로 조사하였다. Cisplatin을 0-30 μg/ml 농도까지, paclitaxel을 0-5 μg/ml 농도까지 투여하였을 때, 농도를 증가시킴에 따라 세포의 생존율은 지속적으로 감소함을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
- 위의 H358, H358-pRc/CMV, H358-pRc/CMVFHIT 세 가지 세포에 각각 항암제를 가하고 이 때 발생하는 apoptosis에 차이가 나타나는가를 조사해 보았다. Cisplatin을 0-30 μg/ml 농도로 72 시간 동안 투여하였을 때 H358-pRc/CMV-FHIT 세포는 나머지 두 세포에 비해 통계적으로 유의하게 생존율이 감소하였다 (p<0.05). 예를 들어 cisplatin 농도 1 μg/ml에서 H358은 61%, H358-pRc/CMV는 58%의 생존율을 보인 반면, H358-pRc/CMVFHIT 세포는 43%로 생존율이 뚜렷이 낮게 나타났다.
- 이러한 세포 생존율의 감소가 apoptosis에 기인한 것인지를 확인하기 위해 H358-pRc/CMV 세포와 H358-pRc/CMV-FHIT 세포에 항암제를 투여한 후 DAPI staining과 FACS 분석을 시행하였다. Cisplatin을 투여하고 48시간 후 관찰하였을 때, H358-pRc/CMV-FHIT 세포는 H358-pRc/CMV 세포에 비해 DAPI staining상 apoptosis가 유의하게 증가되어 있었으며 FACS 결과에서도 apoptosis 분획이 증가되어 있음을 확인할 수 있었다 (각각 23.4%, 12.7%). Paclitaxel을 투여하고 24시간 후에 관찰하였을 때도 같은 현상을 관찰할 수 있었는데 FACS 분석상 apoptosis 분획은 각각 58.
- FHIT 유전자의 발현이 항암제에 의한 세포의 사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해 FHIT가 결손된 폐암 세포주인 NCI-H358 세포에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후 항암제에 대한 반응의 변화를 살펴보고자 하였다. FHIT 유전자를 삽입한 plasmid인 pRc/CMV-FHIT를 transfection 시켰을 때, transfection을 시키지 않은 세포나 FHIT 유전자를 삽입하지 않은 plasmid인 pRc/CMV를 transfection 시킨 세포에서는 관찰되지 않는 FHIT 단백질의 발현을 확인 할 수 있었다(Fig. 3). 이렇게 FHIT가 stable transfection된 세포에서 항암제를 투여하기 전 기저 상태에서 생존율에 차이가 있는지를 MTT assay로 분석해 보았다.
- 본 연구에서도 caspase system의 활성화를 관찰할 수 있었다. FHIT가 발현된 세포에서는 PARP의 바로 위 단계에 있는 caspase-7과 그 위 단계의 caspase-3 활성화가 유의하게 증가되는 것이 관찰되었다. 하지만 그 보다 위 단계에 있는 caspase-8, -9의 차이는 관찰할 수 없었다.
- FHIT를 발현시킨 세포에서는 cisplatin 혹은 paclitaxel을 투여하였을 때 유의하게 생존율이 감소하였으며, 이는 apoptosis 증가에 의한 것으로 확인되었다. 이 과정에서 FHIT가 발현된 세포는 caspase-3, caspase-7의 활성화가 유의하게 증가되었으며, Bcl-2와 Bcl-xL 발현은 유의하게 감소하고 Bax와 Bad 발현은 유의하게 증가하였다.
- 여기에는 apoptosis를 억제하는 단백질과 항진시키는 단백질이 모두 포함되어 있는데, Bcl-2, Bcl-xL 등은 미토콘드리아의 외벽에 존재하면서 cytochrome c의 분비를 막아 apoptosis를 억제하며, Bax, Bad 등은 세포질 내에 존재하다가 사멸 신호가 전달되면 미토콘드리아로 이동하여 cytochromec의 분비를 촉진함으로써 apoptosis를 항진시키게 된다. H358-pRc/CMV, H358-pRc/CMV-FHIT 두 세포에 0.1 μg/ml의 paclitaxel을 투여하고 0, 48 시간 후에 관찰하였을 때, H358-pRc/CMV-FHIT 세포에서는 paclitaxel을 투여하고 48 시간 후 H358-pRc/CMV 세포에 비해 Bcl-2와 Bcl-xL는 유의하게 감소하고 Bax와 Bad는 유의하게 증가함을 관찰할 수 있었다. 즉, apoptosis 억제 단백질의 감소와 apoptosis 유발 단백질의 증가를 관찰할 수 있었다.
- 9). H358-pRc/CMV, H358-pRc/CMVFHIT 세포 모두에서 paclitaxel 투여 48시간째에 관찰되던 PARP의 분해가 Z-VAD-FMK의 투여에 의해 소실됨이 확인되었다(Fig. 9A). MTT 분석 결과를 살펴보면 Z-VAD-FMK를 투여했을 때 H358-pRc/CMV, H358-pRc/CMV-FHIT 세포 모두에서 생존율이 증가되었는데 paclitaxel 만을 투여했을 때 관찰되던 두 세포간의 유의한 차이가 소실된 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 한편, apoptosis의 특징적 소견인 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)의 분해를 시간 경과에 따라 Western blotting으로 조사해보았다. H358-pRc/CMV와 H358-pRc/CMV-FHIT 세포에 3 μg/ml의 cisplatin 혹은 0.1 μg/ml의 paclitaxel을 투여하고 48시간까지 PARP의 분해를 관찰하였을 때, PARP의 분해시 나타나는 86 kDa 분절은 48시간째에 나타났는데 band의 density를 비교해 보았을 때 H358-pRc/CMV-FHIT 세포에서 훨씬 뚜렷이 나타남이 확인되었고(Fig. 7), 이는 MTT assay 결과와 같은 양상이라고 할 수 있다. 이상의 결과는 cisplatin이나 paclitaxel 투여에 의한 세포 생존율의 감소는 apoptosis에 의하며, FHIT가 발현된 세포에서는 그렇지 않은 세포에 비해 항암제에 의한 apoptosis가 증가함을 보여주고 있다.
- 9A). MTT 분석 결과를 살펴보면 Z-VAD-FMK를 투여했을 때 H358-pRc/CMV, H358-pRc/CMV-FHIT 세포 모두에서 생존율이 증가되었는데 paclitaxel 만을 투여했을 때 관찰되던 두 세포간의 유의한 차이가 소실된 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 9B). 이 결과는 NCI-H358 세포에서 FHIT 단백질 발현에 의해 항암제 투여 후 나타나는 apoptosis가 증가되는 경로에 caspase-3과 caspase-7의 활성화가 관련되어 있음을 보여주는 소견이라 할 수 있다.
- 7%). Paclitaxel을 투여하고 24시간 후에 관찰하였을 때도 같은 현상을 관찰할 수 있었는데 FACS 분석상 apoptosis 분획은 각각 58.1%와 7.8%로 더욱 큰 차이를 보였다(Fig. 6). 한편, apoptosis의 특징적 소견인 poly (ADP-ribose) polymerase (PARP)의 분해를 시간 경과에 따라 Western blotting으로 조사해보았다.
- 이렇게 FHIT가 stable transfection된 세포에서 항암제를 투여하기 전 기저 상태에서 생존율에 차이가 있는지를 MTT assay로 분석해 보았다. Transfection을 시키지 않은 NCI-H358 세포의 생존율을 100%로 하였을 때 FHIT 유전자를 삽입하지 않은 plasmid인 pRc/CMV를 transfection시킨 세포 (H358-pRc/CMV)와 FHIT 유전자를 삽입한 plasmid인 pRc/CMV-FHIT를 transfection시킨 세포 (H358-pRc/CMV-FHIT)에서 모두 차이를 보이지 않았다(Fig. 4).
- NCI-H358 세포에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후 시행한 실험이므로, selection 과정에서 FHIT 발현 자체에 의해 apoptosis가 일어난 세포, 즉 FHIT 발현에 상대적으로 sensitive한 세포는 이미 제거되었을 것이다. 따라서 이러한 세포에 대해서도 결과를 얻기 위해 transient transfection을 시키고 실험을 진행하였으나, transfection 효율이 충분하지 못하여 결과를 얻을 수 없었다. 따라서 이러한 세포군에 대한 연구를 위해서는 향후 효율이 높은 viral vector를 이용한 실험이나 inducible promotor를 가진 plasmid vector를 이용한 실험이 필요할 것으로 생각된다.
- 2). 먼저 cisplatin 3 μg/ml을 투여하고 시간별로 관찰하였을 때 NCI-H1573과 A549 세포 모두에서 시간 경과에 따른 FHIT 단백질의 발현 증가를 관찰할 수 있었다. Paclitaxel 0.
- 한편, 본 연구에서는 기존에 발표된 연구 결과에서는 확실치 않았던 Bcl-2 family의 활성화가 FHIT 단백질이 발현된 세포에서 관찰되었다. 본 실험 결과를 보면, FHIT가 발현된 세포에서는 apoptosis 억제 단백질인 Bcl-2, Bcl-xL의 활성이 감소하고 apoptosis 유발 단백질인 Bax, Bad의 활성은 증가함이 관찰되어 apoptosis를 유발하는 방향으로 변화되어 있음을 알 수 있다. FHIT 발현에 의한 apoptosis 과정에 미토콘드리아가 관련되어 있을 가능성을 시사하는 소견들이 발표돤 바 있는데, 췌장암 세포에서 미토콘드리아에 대한 형광 염색을 시행하였을 때 FHIT가 발현된 세포에서는 정상 세포에 비해 미토콘드리아의 형광 염색이 변화되어 관찰되었고27, 위암 세포에서 미토콘드리아 내막 전위(inner mitochondrial transmembrane potential)을 synchronous luminescence spectroscopy를 이용하여 측정하였을 때, FHIT가 발현된 세포에서는 정상 세포에 비해 막전위가 파괴되어 관찰되었다는 보고가 있다29.
- 즉, apoptosis 억제 단백질의 감소와 apoptosis 유발 단백질의 증가를 관찰할 수 있었다. 이 결과는 NCI-H358 세포에서 FHIT 단백질 발현에 의해 유발되는 항암제 투여 후 apoptosis의 증가 과정이 미토콘드리아 의존성 기전에 의한 것임을 시사하는 소견이라 할 수 있다.
- FHIT를 발현시킨 세포에서는 cisplatin 혹은 paclitaxel을 투여하였을 때 유의하게 생존율이 감소하였으며, 이는 apoptosis 증가에 의한 것으로 확인되었다. 이 과정에서 FHIT가 발현된 세포는 caspase-3, caspase-7의 활성화가 유의하게 증가되었으며, Bcl-2와 Bcl-xL 발현은 유의하게 감소하고 Bax와 Bad 발현은 유의하게 증가하였다.
- 7), 이는 MTT assay 결과와 같은 양상이라고 할 수 있다. 이상의 결과는 cisplatin이나 paclitaxel 투여에 의한 세포 생존율의 감소는 apoptosis에 의하며, FHIT가 발현된 세포에서는 그렇지 않은 세포에 비해 항암제에 의한 apoptosis가 증가함을 보여주고 있다.
- 1 μg/ml의 paclitaxel을 투여하고 0, 48 시간 후에 관찰하였을 때, H358-pRc/CMV-FHIT 세포에서는 paclitaxel을 투여하고 48 시간 후 H358-pRc/CMV 세포에 비해 Bcl-2와 Bcl-xL는 유의하게 감소하고 Bax와 Bad는 유의하게 증가함을 관찰할 수 있었다. 즉, apoptosis 억제 단백질의 감소와 apoptosis 유발 단백질의 증가를 관찰할 수 있었다. 이 결과는 NCI-H358 세포에서 FHIT 단백질 발현에 의해 유발되는 항암제 투여 후 apoptosis의 증가 과정이 미토콘드리아 의존성 기전에 의한 것임을 시사하는 소견이라 할 수 있다.
후속연구
- 따라서 이러한 세포에 대해서도 결과를 얻기 위해 transient transfection을 시키고 실험을 진행하였으나, transfection 효율이 충분하지 못하여 결과를 얻을 수 없었다. 따라서 이러한 세포군에 대한 연구를 위해서는 향후 효율이 높은 viral vector를 이용한 실험이나 inducible promotor를 가진 plasmid vector를 이용한 실험이 필요할 것으로 생각된다. 또한, FHIT 유전자를 transfection 시킨 후 관찰된 이상의 실험결과들이 FHIT 발현과 직접적인 관련이 있는지를 확인하기 위한 FHIT의 억제 실험들이 뒤따라야 할 것이다.
- 따라서 이러한 세포군에 대한 연구를 위해서는 향후 효율이 높은 viral vector를 이용한 실험이나 inducible promotor를 가진 plasmid vector를 이용한 실험이 필요할 것으로 생각된다. 또한, FHIT 유전자를 transfection 시킨 후 관찰된 이상의 실험결과들이 FHIT 발현과 직접적인 관련이 있는지를 확인하기 위한 FHIT의 억제 실험들이 뒤따라야 할 것이다.
- 본 연구의 제한점은 FHIT 발현에 상대적으로 resistant한 폐암 세포를 대상으로 한 연구라는 점이다. NCI-H358 세포에 FHIT 유전자를 stable transfection 시킨 후 시행한 실험이므로, selection 과정에서 FHIT 발현 자체에 의해 apoptosis가 일어난 세포, 즉 FHIT 발현에 상대적으로 sensitive한 세포는 이미 제거되었을 것이다.
- 유력한 폐암억제유전자인 FHIT가 apoptosis를 유발하는 기전을 규명한다면, 이에 대한 이해를 바탕으로 유전자 치료 등의 새로운 치료 방법의 소재로서 중요한 기여를 할 수 있을 것으로 생각된다.
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