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문제 정의
- 각 바이러스의 항혈청에 대한 이종항원 중화능을 확인하기 위하여 임상증상 관찰을 마친 SPF 닭에서 14DPI에 개체별 항혈청을 취한 후, 바이러스 접종군별 항혈청을 혼합하여 MS96접종군 HI titer 64, ADL0401 접종군 HI titer 32를 준비하였다. 각각의 항혈청과 4HAiunit MS96, ADL0401 virus를 Cross-Hemagglutination inhibition Reaction 하여 동종항원과 이 종항원에 대한 중화능을 비교하여 백신후보 주로의 ADL0401의 항원성을 평가하고자 하였다. 두바이러스간의 항원성의 차이를 검증하기 위한 /■값은 두 종류의 항원과 항혈청을 혈청학적으로 서로 교차반응하였을 때 항원성의 차이 범위를 단일 숫자로 나타내어 주는 개념이다{Archetti and Horsfall, 1950).
- 본 연구에서는 LPAI로 인한 경제적 손실을 효과적으로 방제할 수 있는 사독백신을 개발하기 위해 LPAI 국내 표준주인 MS96 virus (A/chicken/ Anyang/ MS96; H9N2) 와 비교하며 백신후보주로서의 국내 분 리 주 인 ADL0401 virus(A/chicken/ Cheongju/ADL0401;H9N2)의 생물학적 특성, 면역원성 및 안전성을 평가하고자 하였다.
- 본 연구에서는 LPAI로 인한 경제적 손실을 효과적으로 방제할 수 있는 사독백신을 개발하기 위해 LPAI 국내 표준주인 MS96 바이러스와 비교하며 백신 후보 주로서의 국내 분리 주 인 ADL0401 바이러스의 생물학적 특성, 면역원성 및 안전성 평가 실험을 수행하였다.
제안 방법
- 바이러스 RNA는 Viral Gene-Spin™ Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON biotechnology, Korea)의 지침 에 따라 추출하였으며 추출한 바이러스 RNA는 I-AIV(H9) Detection Kit (iNtRON biotechnology, Korea)로 RT-PCR-g- 진행하였다. 방법으로는 enzyme mix 8µL 에 RNA template 2 "L를 첨가하여 진단 용액을 넣은 후 최종 반응액을 20µL로 조정한 후 잘 섞어주고 Reverse transcription(45 ℃/30min), Pre-PCR(94℃/5min), PCR(denaturation 94℃/30sec, annealing 50℃/30sec, extension 72℃/40sec, 40cycles) 그리고 post-PCR(72℃/5min)을 핵산 증 폭기(ThermoHybaid PCR machine)를 사용하여 실시하였다. 반응 산물은 1.
- 공시된 불활화제를 MS96(64HA), ADL0401(32HA)의 바이러스에 불활화 효능시험과 마찬가지로 6시간까지 1시간 범우!, 그리고 이후에 12시간과 24시간째에 4℃와 37笆의 서로 다른 온도 조건에서 반응하여 HA 역가 변화를 불활화제처리 전과 비교 관찰하였다.
- A~G의 첫 번째 well에 항원시료를 50 µL씩 분주하고, H well에는 음성대조군을 두어 각각 2진 단계 희석하였다. 1% 닭적혈구 부유액을 전 well에 50 분주하여 30초간 잘 흔들어준 다음 실온에서 40분간 정치시킨 후 45° 정도 세워 흘러내리지 않는 최대 희석배수를 End Point로 판독하였다.
- 01M의 농도로 조정한 후 온도를 4℃와 37℃로 달리하여 잘 흔들어 반응시킨다. 6시간까지 1시간 범위로 반응 시간을 두었으며, 이후 12시간과 24시간째에 각각 ImL 시료를 취하여 사용된 BEI의 10% 용량으로 Na2S2O3 용액을 가하여 반응을 정지시킨 후 공시하였다.
- Formalin 원액(Junsei, Japan)을 멸균 증류수에 1%로 희석한 후 바이러스 부유액에 대한 10%의 용량을 가하여 0.1% 농도로 BEI와 같은 온도시간별로 실험을 수행하였다.
- 시험백신에 사용된 바이러스는 lOeEIDMmL의 바이러스를 함유한 ADL0401O]며, 6주령 인플루엔자 음성닭에 근육 경로로 접종하여 2주간 임상증상 및 폐사율을 관찰하였으며, 3주째에 혈액을 채취하여 항체가를 조사하였다.「1차 실험으로 SEPPIC(Paris, France)사에서 개발한 ISA 70, ISA 763, IMS 1312 adjuvant를 동일 조건에서 항체가를 비교하였고, 2차 실험에선 1차 실험에서 가장 좋은 효과 를 나타낸 ISA70과 현재 국내외에서 상용화되고 있는 Drakeol 6VR(Penreco, USA)을 접종량을 달리하여 비교하였으며, 최종적으로 ISA 70 adjuvant 백신으로 대조군과 함께 확정 실험을 실시하였다.
- 각 바이러스의 항혈청에 대한 이종항원 중화능을 확인하기 위하여 임상증상 관찰을 마친 SPF 닭에서 14DPI에 개체별 항혈청을 취한 후, 바이러스 접종군별 항혈청을 혼합하여 MS96접종군 HI titer 64, ADL0401 접종군 HI titer 32를 준비하였다. 각각의 항혈청과 4HAiunit MS96, ADL0401 virus를 Cross-Hemagglutination inhibition Reaction 하여 동종항원과 이 종항원에 대한 중화능을 비교하여 백신후보 주로의 ADL0401의 항원성을 평가하고자 하였다.
- 국내 분리 표준주인 MS96과 백신 후보 주인 ADL0401 을 충북대학교 수의과대학에 설치되어 있는 차폐장치인 양압 Isolator(Three shine, Keumsan, Korea)에서 4주령 SPF 닭에 MS96 바이러스는 lO87EID5o/mL, ADL0401 바이러스는 10財 EDX/mL을 기관을 통하여 O.lmL씩 접종하여 10일간 임상증상, 폐사율 관찰 및 바이러스 재분리를 실시하였고, 각각 대조군을 두어 비교시험하였다 . 임상증상, 폐사율 시험은 OIE 규정에 따라 그룹별 8마리씩 별도로 수행하였으며, 재분리율 조사는 접종군별로 15마리씩 사육하며 2일 간격으로 3마리씩 공시하였다(Table 1).
- 농장 및 야외에서 채취한 분변을 멸균면봉을 이용하여 최대한 여러 부분에서 취한 후 15mL conical tube에 옮겨 분변의 무게를 측정하였다. 여기에 항생제가 첨가된 Phosphate Buffed Saline(PBS), pH 7.
- 재분리 여부는 각 장기별로 항생제 처리된 유제상층액을 인플루엔자 음성 일반산란종란에 3개씩 접종하여 4일간 바이러스를 증식시킨 후요막강액을 실험 재료로 하여 HA 검사로 혈구응집 여부를 확인한 후, 응집을 보인 시료에 대하여 각각의 virus 항혈청을 이용하여 HI 검사로서 바이러스 존재를 확인하였다. 또한 별도 채취된 장기의 유제 상층액으로 RT-PCR을 시행하여 바이러스 분리 능과 비교하였다.
- 방법으로는 enzyme mix 8µL 에 RNA template 2 "L를 첨가하여 진단 용액을 넣은 후 최종 반응액을 20µL로 조정한 후 잘 섞어주고 Reverse transcription(45 ℃/30min), Pre-PCR(94℃/5min), PCR(denaturation 94℃/30sec, annealing 50℃/30sec, extension 72℃/40sec, 40cycles) 그리고 post-PCR(72℃/5min)을 핵산 증 폭기(ThermoHybaid PCR machine)를 사용하여 실시하였다. 반응 산물은 1.2% agarose gel(Invitrogen, USA) 상에서 전기영 동한 뒤 5X loading dye로 염색하여 band를 확인하였으며 증폭된 H9 유전자 크기는 1 kb plus DNA Ladder(Invitrogen, USA)를 같이 전기 영동함으로써 확인하였다.
- lmL를 접종하여 37E에서 7일 간 부란 하면서 계태아의 치사 상태를 검사하였다. 배양한 후요막강액의 HA test에서 적혈구응 집 유무에 따라 불활화 여부를 확인하였다.
- 분리된 바이러스를 국립수의과학검역원에 의뢰하여 HI test 및 NI assay를 실시하여 혈청형을 동정하였으며, HA 단백질 분절 부위의 염기서열을 분석하였다.
- 사독백신 제조에 사용될 효과적인 불활화제를 선정하기 위하여 0.0 IM BEI (Binary ethylenimine)와 0.1% formalin을 서로 다른 온도 조건(37℃, 4℃)에서 불활화 효과를 비교 실험 하였다.
- 시험생산한 백신에 대하여 생체안전성 실험과 면역형성능을 평가하고자 여러 종류의 adjuvant를 사용한 백신과 접종량을 달리하며 3차에 걸쳐 시험하였다. 시험백신에 사용된 바이러스는 lOeEIDMmL의 바이러스를 함유한 ADL0401O]며, 6주령 인플루엔자 음성닭에 근육 경로로 접종하여 2주간 임상증상 및 폐사율을 관찰하였으며, 3주째에 혈액을 채취하여 항체가를 조사하였다.「1차 실험으로 SEPPIC(Paris, France)사에서 개발한 ISA 70, ISA 763, IMS 1312 adjuvant를 동일 조건에서 항체가를 비교하였고, 2차 실험에선 1차 실험에서 가장 좋은 효과 를 나타낸 ISA70과 현재 국내외에서 상용화되고 있는 Drakeol 6VR(Penreco, USA)을 접종량을 달리하여 비교하였으며, 최종적으로 ISA 70 adjuvant 백신으로 대조군과 함께 확정 실험을 실시하였다.
- 시험생산한 백신에 대하여 생체안전성 실험과 면역형성능을 평가하고자 여러 종류의 adjuvant를 사용한 백신과 접종량을 달리하며 3차에 걸쳐 시험하였다. 시험백신에 사용된 바이러스는 lOeEIDMmL의 바이러스를 함유한 ADL0401O]며, 6주령 인플루엔자 음성닭에 근육 경로로 접종하여 2주간 임상증상 및 폐사율을 관찰하였으며, 3주째에 혈액을 채취하여 항체가를 조사하였다.
- 실험동물로는 병원 성 실험으로 4주령 specific pathogenic free(SPF) 닭 63수와, 안전성 및 면역원 성 실험으로 6주령 인플루엔자 음성 닭 75수를 Isolator 계사온도 20~25 ℃를 유지하며, 사료와 물을 충분히 공급하여 관찰하였다.
- 2mL를 접종하여 4일간 배양시켰다. 이후 냉장과정을 거쳐 요막강액 (Allantoic cavity fluid : ACF) 을 채취하여 HA, HI test 및 RT-PCR을 실시하였다.
- lmL씩 접종하여 10일간 임상증상, 폐사율 관찰 및 바이러스 재분리를 실시하였고, 각각 대조군을 두어 비교시험하였다 . 임상증상, 폐사율 시험은 OIE 규정에 따라 그룹별 8마리씩 별도로 수행하였으며, 재분리율 조사는 접종군별로 15마리씩 사육하며 2일 간격으로 3마리씩 공시하였다(Table 1).채취장기로는 LPAI의 표적장기 인 기관, 총배설강, 신장에서 분리를 시도하였고, 기관과 총배설강에서는 면봉채취를 병행하였다.
- 채취장기로는 LPAI의 표적장기 인 기관, 총배설강, 신장에서 분리를 시도하였고, 기관과 총배설강에서는 면봉채취를 병행하였다. 재분리 여부는 각 장기별로 항생제 처리된 유제상층액을 인플루엔자 음성 일반산란종란에 3개씩 접종하여 4일간 바이러스를 증식시킨 후요막강액을 실험 재료로 하여 HA 검사로 혈구응집 여부를 확인한 후, 응집을 보인 시료에 대하여 각각의 virus 항혈청을 이용하여 HI 검사로서 바이러스 존재를 확인하였다. 또한 별도 채취된 장기의 유제 상층액으로 RT-PCR을 시행하여 바이러스 분리 능과 비교하였다.
- 정해진 시간과 온도에서 불활화한 바이러스 재료를 11일령의 인플루엔자 음성 일반산란종란 5개씩에 O.lmL를 접종하여 37E에서 7일 간 부란 하면서 계태아의 치사 상태를 검사하였다. 배양한 후요막강액의 HA test에서 적혈구응 집 유무에 따라 불활화 여부를 확인하였다.
- 임상증상, 폐사율 시험은 OIE 규정에 따라 그룹별 8마리씩 별도로 수행하였으며, 재분리율 조사는 접종군별로 15마리씩 사육하며 2일 간격으로 3마리씩 공시하였다(Table 1).채취장기로는 LPAI의 표적장기 인 기관, 총배설강, 신장에서 분리를 시도하였고, 기관과 총배설강에서는 면봉채취를 병행하였다. 재분리 여부는 각 장기별로 항생제 처리된 유제상층액을 인플루엔자 음성 일반산란종란에 3개씩 접종하여 4일간 바이러스를 증식시킨 후요막강액을 실험 재료로 하여 HA 검사로 혈구응집 여부를 확인한 후, 응집을 보인 시료에 대하여 각각의 virus 항혈청을 이용하여 HI 검사로서 바이러스 존재를 확인하였다.
- 2을 분변량의 2배 정도 넣고 섞어주었다. 항생제는 Streptomycin, Penicillin G, Kanamycin(SPK)을 첨가하였고, 각각 S(2mg/mL), P(2000IU/mL), K(0.25mg/mL) 의 농도를 사용하였다.
대상 데이터
- LPAI의 특성을 가지고 있는 표준주로서 A/Chicken/Anyang/ MS96 (H9N2) virus를 국립수의과학검역원(NVRQS, Anyang, Korea)으로부터 분양받았으며, 백신후보 주로 야외 분변시료로부터 분리한 A/Chicken/Cheongju/ADL0401 (H9N2) virus를 공시하였다.
이론/모형
- 바이러스 RNA는 Viral Gene-Spin™ Viral DNA/RNA Extraction Kit(iNtRON biotechnology, Korea)의 지침 에 따라 추출하였으며 추출한 바이러스 RNA는 I-AIV(H9) Detection Kit (iNtRON biotechnology, Korea)로 RT-PCR-g- 진행하였다. 방법으로는 enzyme mix 8µL 에 RNA template 2 "L를 첨가하여 진단 용액을 넣은 후 최종 반응액을 20µL로 조정한 후 잘 섞어주고 Reverse transcription(45 ℃/30min), Pre-PCR(94℃/5min), PCR(denaturation 94℃/30sec, annealing 50℃/30sec, extension 72℃/40sec, 40cycles) 그리고 post-PCR(72℃/5min)을 핵산 증 폭기(ThermoHybaid PCR machine)를 사용하여 실시하였다.
성능/효과
- 3차례에 걸쳐 adjuvant, 접종량 및 실험계수를 달리하여 실험한 결과 1차 실험에선 ISA 70 adjuvant를 사용한 백신에서 4.20±0.84로 가장 높은 항체 역가를 보였다. 이 백신을 접종량을 달리하여 그동안 국내외에서 보편적으로 사용되어온 Drakeol 6VR adjuvant와 비교실험했을 때, 0.
- , 2000) . ADL0401의 아미노산 염기서열 또한 마찬가지로 국내 표준주인 MS96과 상당히 일치하였기에 LPAI 바이러스의 특성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 01M BEI와 비교하여 보다 좋은 효과를 나타내었다. Hue는{1957) BEI 불활화제가 For- malin에 비해 항원성 면에서 우수하다고 밝힌 바 있으나, 본 연구에선 Formalin에서 좋은 효능을 보였고, 현재 BEI 제조 시약의 수입이 규제되어 있는 것으로 파악이 되어 향후 검증 실험이나 활용도면에서 힘들 것으로 사료되었으며, 'Formalin 처리로도 충분한 면역능을 얻을 수 있음을 본 실험을 통해 확인할 수 있었다.
- 재분리율 조사에서는 부화란 접종 실험 결과, 후보 주인 ADL0401은 접종 2일에서 4일 후까지 기관에서 바이러스가 분리되었으며, 접종 6일 후부터는 분변으로 배출을 시작하여 접종 10일 후까지 지속되었다. MS96도 유사한 양상을 보였으나 총배설강의 8DPI에서는 분리가 되지 않아, 총배설 강의 재분리율 면에서는 ADL0401 이 높은 것으로 나타났다(Table2).
- 01M BEI에 비하여 1시간 먼저 역가 저하를 나타냈다(Table 6). 결과적으로 백신 후보 주인 ADL0401의 경우로만 보았을 때 0.01M BEI에서는 12시간까지도 불활화가 이루어지지 않았으나, 0.1% formalin에서는 1시간 만에 약간의 역가 저하를 나타내며 쉽게 불활화가 이루어짐을 알 수 있었다.
- 국립수의과학검역원에서 백신후보 주인 ADL04이에 대한 혈청형 동정실험으로 HI test 및 NI assay 결과 혈청형은 H9N2로 확인되었고, HA 단백질 분절 부위에 대한 염기서열 분석 결과 HPAI 바이러스의 특성인 염기성 아미노산의 배열이 존재하지 않은 LPAI 바이러스의 구조를 갖고 있음이 판명되었다.
- 그러나 RT-PCR 실험 결과 전반적인 바이러 스 검출양상은 부화란 접종 실험과 유사하였으나, 총배설 강에서 MS96은 접종 6일 후에 3수, 8일후 1수 10일후 2수가 양성으로 ADL0401의 접종 6일후 수 8일 후 1수 양성에 비해 보다 높은 검출율을 나타냈다. 기관에서는 부화란 접종 실험에서 ADL0401은 접종 2일후 3수, 4일후 3수, MS96은 접종 2일후 3수, 4일후 1수가 재분리된 것에 비해 RT-PCR에서는 두바이러스 공히 접종 2일후 1수, 4일후 2수가 검출되어 재분리율이 상대적으로 낮게 나타났다 (Table 3, Fig.
- 그러나 RT-PCR 실험 결과 전반적인 바이러 스 검출양상은 부화란 접종 실험과 유사하였으나, 총배설 강에서 MS96은 접종 6일 후에 3수, 8일후 1수 10일후 2수가 양성으로 ADL0401의 접종 6일후 수 8일 후 1수 양성에 비해 보다 높은 검출율을 나타냈다. 기관에서는 부화란 접종 실험에서 ADL0401은 접종 2일후 3수, 4일후 3수, MS96은 접종 2일후 3수, 4일후 1수가 재분리된 것에 비해 RT-PCR에서는 두바이러스 공히 접종 2일후 1수, 4일후 2수가 검출되어 재분리율이 상대적으로 낮게 나타났다 (Table 3, Fig. 1, Fig. 2). 이는 부화란 접종 실험의 경우에는 면봉채취 시료의 분리율이 포함된 결과이므로 재분리율에 다소 차이를 보였다고 판단되었다.
- 두 실험의 결과를 종합적으로 살펴봤을 때 두바이러스간의 분리 양상은 상당히 유사하였으며, 백신후보 주인 ADL0401은 약 병원성 조류인플루엔자의 특성을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
- 다른 두 개의 국내 분리주의 경우에서도 5일간만의 관찰 결과 이지만 기관 분리율이 총배설 강의 분리율보다 높게 나타나는 본 실험과 같은 결과를 나타내었다. 따라서 ADL0401 분리주는 LPAI의 특징을 갖고 있으며, 국내 공인 LPAI 바이러스인 MS96과 상당히 유사한 생물학적 특성을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
- 그러나 국내 분리주가 아닌 Ck/Bei/1/94(H9N2)에서는 80%까지의 폐사율을 나타내기도 하였으나, 이는 유전자 병원성변이에 의해 HA 분절 부위에 다염기성 아미노산을 포함함으로써 고병원성을 획득한 것으로 확인되었다. 따라서 국내 분리주를 접종한 결과에서 폐사율이 없던 결과는 본 실험의 결과와 일치하였고, 재분리율에선 MS96의 경우에는 접종 후 3일에서도 총배설 강에서 분리되는 등 본 실험과의 다른 결과를 나타내었지만, 접종 후 7일에 기관에서 바이러스 분리가 되지 않고 분변에서의 분리율이 높아지는 등 전반적인 분리 양상은 본 실험과 일치하였다. 다른 두 개의 국내 분리주의 경우에서도 5일간만의 관찰 결과 이지만 기관 분리율이 총배설 강의 분리율보다 높게 나타나는 본 실험과 같은 결과를 나타내었다.
- 백신 후보 주를 이용하여 개발된 백신의 안전성 및 면역원성을 실험한 결과, 백신 접종 계군에 대해선 폐사 및 임상증상을 발견할 수 없었으며, 면역증강제로 ISA 70 adjuvant(Seppic, France)를 사용하였을 때에 가장 우수한 면역능을 형성하였다. David 등(2001)은 혈청형 이 H5인 여러 개의 LPAI를 이용한 백신으로 사람에서 유래한 HPAI A/Hong Kong/156/97 (H5N1)과 HPAI A/Hong Kong/483/97(H5Nl)를 공격 접종하였을 때, 바이러스의 증식과 배출을 완전히 막진 못하였지만, 어느 정도 임상증상 및 바이러스 증식을 감소시켜 사독백신의 효능을 확인한 바 있다.
- 병원 성 실험에서는 두바이러스 접종군 모두 폐사는 없었으며 임상증상으로 접종 후 3~4일경에 두바이러스 접종군 에서 모두 심한 우울증세를 보인 다음 다음날 빠르게 회복하였고, 바이러스 재분리율 면에서는 접종 후 4일까지 기관에서 바이러스가 머물러 있다가 접종 후 6일부터 분변으로 배출을 시작하여 10일까지 지속되었다. Lee 등(2000)의 MS96 바이러스를 이용한 실험에서는 접종시 폐사는 없었으며, 접종 후 4~5일경에 비강 접종군에서 중등도의 우울증세와 정맥 접종군에서의 심한 우울증세를 나타내 본 실험에서와 같은 LPAI의 임상증상을 나타내었다.
- 본 연구의 바이러스 생물학적 특성 및 백신의 안전성, 면역원성 실험 결과를 종합하여 볼 때 ADL0401 분리주는 LPAI에 감염된 계군에 대해 임상증상 및 바이러스 배출을 감소시킬 수 있는 사독백신주로 사용되어질 수 있음을 확인하였다. 향후 생산된 사독백신의 실험 실적 및 야외 효능, 안전성 실험이 수행되어야 할 것이며, 또한 야외감염계와 백신 접종 계의 감별을 위한 진단법도 개발되어 빠른 시일 내에 현장 양계 농가로의 보급이 이루어져 현재의 막대한 경제적 손실로부터 농가보호에 기여할 수 있기를 기대하는 바이다.
- 분리된 백신 후보 주인 ADL0401 바이러스의 병원성을 결정짓는 HA 당 단백질 분절 부위의 유전자 분석 결과 HPAI 바이러스에서 볼 수 있는 다 염기성 아미노산 배열은 없었다. 국내 약병원성 인플루엔자 분리 주인 Cㅏ/Kor/006/96과 Ck/Kor/ 323/96의 HA 유전자 조사가 이루어진 바 있고(Guan et al.
- 불활화제 선정실험에서는 ADL0401은 0.1% Formalin, 37 ℃ 에서 바이러스 활성에 큰 영향을 주지 않으면서 1시간이 내에 쉽게 불활화가 이루어져 0.01M BEI와 비교하여 보다 좋은 효과를 나타내었다. Hue는{1957) BEI 불활화제가 For- malin에 비해 항원성 면에서 우수하다고 밝힌 바 있으나, 본 연구에선 Formalin에서 좋은 효능을 보였고, 현재 BEI 제조 시약의 수입이 규제되어 있는 것으로 파악이 되어 향후 검증 실험이나 활용도면에서 힘들 것으로 사료되었으며, 'Formalin 처리로도 충분한 면역능을 얻을 수 있음을 본 실험을 통해 확인할 수 있었다.
- 1/8 수(13%)가, 총배설강은 7/8수(88%)가 분리되었으며, 접종 후 7일에는 기관에선 분리가 되지 않았고, 총배설 강에서 7/8수(88%)가 분리되었다. 비강 접종 결과로는 기관에서는 전혀 분리가 이루어지지 않았으며, 총배설 강에서는 접종 후 3일에는 분리되지 않았고, 접종 후 7일엔 3/8 (38%) 수가 분리되었다. 정맥접종 시 접종 3일 후에 총배설 강에서의 분리율이 높았던 것은 혈관 접종에 따른 빠른 바이러스 분리가 이루어진 것으로 판단되었으며, 비강 접종에서 기관 분리가 전혀 이루어지지 않은 점에선 본 실험과 차이를 보였다.
- 야외 주인 MS96과 백신 후보 주로서의 ADL0401의 이종항 원에 대한 중화능 실험을 한 결과 r value = 0.기로 동종항원 (r value = 1)에 비하여 다소 낮은 중화능을 나타내었지만, 두바이 러스 간의 항원성엔 큰 차이가 없음을 알 수 있었다. 이와 같이 인플루엔자 바이러스의 분리 주간의 항원성에 차이가 있을 수 있다는 사실은 이미 오래전에 증명이 된 바 있다.
- 시간 만에 불활화가 이루어졌다. 온도 조건별로는 4℃에 비하여 37℃ 조건으로 처리하였을 때 불활화 효력의 현저한 차이를 나타내었으며, 두바이러스 모두 0.01M BEI보다 0.1% formalin에서 빠르게 불활화가 진행되었다(Table 5).
- 84로 가장 높은 항체 역가를 보였다. 이 백신을 접종량을 달리하여 그동안 국내외에서 보편적으로 사용되어온 Drakeol 6VR adjuvant와 비교실험했을 때, 0.5mL 접종시 Drakeol 6VRe 7.0QW.67, ISA 70은 7.5(±).76의 항체가를 나타내 ISA 70 adjuvant 백신에서 보다 좋은 면역능을 형성하였고, ISA 70 adjuvant의 경우에서 접종량으로 볼 때는 0.5mL 접종시 항체가 7.50±0.76으로서, 0.2mL 접종 시 항체가 7.67±1.12에 비해 표준편차값이 적은 결과를 나타냈다. 확정 실험으로 ISA 70 adjuvant 백신을 대조군을 두면서 0.
- 4로 항원성의 차이는 거의 없는 것으로 확인하였으나, SH와 965간의 경우에선 r=1/8로 현저한 항원성의 차이를 나타내었다. 이와 같이 같은 인플루엔자 A 바이러스라 하더라도 다양한 항원성을 나타내듯이 본 실험에서의 두바이러스 사이에서는 동종 항원에 비해 다소 낮은 r값을 나타내었지만, 현저한 차이를 드러내지 않은 것으로서 ADL0401 분 리주는 야외감염으로부터 임상증상 및 바이러스의 분변 배출을 감소시킬 수 있는 사독백신주로 사용되어질 수 있음을 알 수 있었다.
- 재분리율 조사에서는 부화란 접종 실험 결과, 후보 주인 ADL0401은 접종 2일에서 4일 후까지 기관에서 바이러스가 분리되었으며, 접종 6일 후부터는 분변으로 배출을 시작하여 접종 10일 후까지 지속되었다. MS96도 유사한 양상을 보였으나 총배설강의 8DPI에서는 분리가 되지 않아, 총배설 강의 재분리율 면에서는 ADL0401 이 높은 것으로 나타났다(Table2).
- 비강 접종 결과로는 기관에서는 전혀 분리가 이루어지지 않았으며, 총배설 강에서는 접종 후 3일에는 분리되지 않았고, 접종 후 7일엔 3/8 (38%) 수가 분리되었다. 정맥접종 시 접종 3일 후에 총배설 강에서의 분리율이 높았던 것은 혈관 접종에 따른 빠른 바이러스 분리가 이루어진 것으로 판단되었으며, 비강 접종에서 기관 분리가 전혀 이루어지지 않은 점에선 본 실험과 차이를 보였다. 또한 Guo 등(2000)은 국내 분리 주인 CK/Kor/323/96과 Ck/Kor/006/96에서 병원 성 실험을 하여 마찬가지로 폐사율은 나타내지 않았으며, 5일 동안 12주령의 닭에서의 바이러스 재분리 실험을 한 결과 CkKor/323/ 96은 기관에서 8수 모두가 분리되었고 (100%), 총배설 강에서는 4/8 수가 분리되었으며(50%), CVKor/ 006/96의 경우엔 기관에서는 4/9 수가(44%), 총배설 강에서는 2/9수 가(22%) 분리되는 등 접종 초기에서의 본 실험과 같은 분리 양상을 나타내었다.
- 표준야외 주인 MS96과 백신후보 주로서의 ADL0401의 이종항원에 대한 중화능 실험을 한 결과 r value = 0.기로 동종 항원(r value = 1)에 비하여 다소 낮은 중화능을 나타내었지만, 두바이러스간의 항원성에는 큰 차이가 없음을 알 수 있었다(Table 4).
- 12에 비해 표준편차값이 적은 결과를 나타냈다. 확정 실험으로 ISA 70 adjuvant 백신을 대조군을 두면서 0.5mL 용량으로 1회 근육 접종하여 안전성 및 면역원성을 확인해 본 결과, 백신 접종 전후로 폐사율 및 임상증상은 전혀 관찰되지 않았으며, 7.40±1.06으로 높은 수준의 항체 역가를 형성함을 재확인할 수 있었다(Table 7).
후속연구
- 1 log의 HI 역가를 나타내었으며, 공격 접종 시에 비강에서는 바이러스 재분리가 이루어지지 않았고 분변에서 15마리 중 1개의 바이러스만 분리되는 등 백신을 통하여 임상증상 및 바이러스 배출을 감소시킬 수 있음이 인정되었다. ISA 70은 현재 국내외에서 상용화되어 있는 Drakeol 6VR에 비해 가격이 비싼 단점은 있으나 실험 결과에서와 같이 보다 우수한 면역능을 보여주었고, 또 한 국 외에서의 성공적인 사례로 살펴봤을 때 국내 활용 면에서도 적극 고려해 보아야 할 때라고 생각된다.
- 본 연구의 바이러스 생물학적 특성 및 백신의 안전성, 면역원성 실험 결과를 종합하여 볼 때 ADL0401 분리주는 LPAI에 감염된 계군에 대해 임상증상 및 바이러스 배출을 감소시킬 수 있는 사독백신주로 사용되어질 수 있음을 확인하였다. 향후 생산된 사독백신의 실험 실적 및 야외 효능, 안전성 실험이 수행되어야 할 것이며, 또한 야외감염계와 백신 접종 계의 감별을 위한 진단법도 개발되어 빠른 시일 내에 현장 양계 농가로의 보급이 이루어져 현재의 막대한 경제적 손실로부터 농가보호에 기여할 수 있기를 기대하는 바이다.
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