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문제 정의
- 본 연구에서는 X-ray crystallography로 밝혀진 class B와 C에 해당하는 Bacteroides fragilis β-lactamase와 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase의 구조를 protein data bank(PDB)에서 선택하여, 먼저 FlexiDock program이 X-선 결정체 구조의 protein-ligand 상호작용을 얼마나 정확하게 재현하는지를 검증한 후, 이 단백질 구조에 위에서 제시한 입체이성체들을 docking하여 그 결합양상을 탐구함으로써 저해제의 입체구조와 β-lactamase 간의 상호작용에 대한 구조적 정보를 밝혀 생리활성과 결합양상의 상관관계를 입증하고자 하였다.
제안 방법
- X-선 결정체 구조에서 ligand를 제거한 β-lactamase 구조를 사용하여 이성체들의 docking을 수행하였다. Binding pocket은 active site 잔기들로부터 4Å 이내에 있는 잔기들을 포함시켜 지정하였고, β-lactamase의 active site 잔기들과 ligands를 모두 flexible하게 설정하였으며, hydrogen donor와 acceptor를 지정하였다.
- X-선 결정체 구조에서 ligand를 제거한 후 남은 β-lactamase 구조에 제거한 ligand를 docking하여 복합체 구조를 얻어 X-선 구조와 그 상호작용을 비교, 검토함으로써 FlexiDock docking protocol에 의해 결정체 구조가 얼마나 정확하게 재현되는지를 검증하였다.
- Binding pocket은 active site 잔기들로부터 4Å 이내에 있는 잔기들을 포함시켜 지정하였고, β-lactamase의 active site 잔기들과 ligands를 모두 flexible하게 설정하였으며, hydrogen donor와 acceptor를 지정하였다. 문헌에 근거하여 상호작용이 일어날 것이라 예상되는 잔기들과 이성체를 근접하게 preposition 시키고 50000번의 simulation을 수행하였으며, 얻어진 구조들 중 에너지가 충분히 낮고 orientation이 적절한 구조를 최종 결과로 선택하였다. Docking 결과의 신뢰성을 부여하기 위해 먼저 X-선 결정체 구조의 ligand를 제거한 후 이 ligand를 docking하여 얻은 복합체의 결합양상을 X-선 결정체 구조와 비교 분석하는 reproducibility test를 실행하였으며, X-선 결정체 구조의 ligand와 복합체 구조의 ligand 간의 root mean square deviation(RMSD)를 계산하였다.
- 본 연구에서는 다양한 β-lactamase 저해제들의 이성체를 metallo-β-lactamase인 Bacteroides fragilis β-lactamase(class B)와 serine dependent β-lactamase인 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase(class C)에 docking하여 결합양상을 규명하고 그 결과를 활성과 비교하였다. 우선 사용한 프로그램의 정확성을 입증하기 위해 reproducibility test를 선행하였고 그 결과 이 프로그램이 X-선 결정체 구조를 정확하게 재현함을 확인하였다.
- Docking 결과의 신뢰성을 부여하기 위해 먼저 X-선 결정체 구조의 ligand를 제거한 후 이 ligand를 docking하여 얻은 복합체의 결합양상을 X-선 결정체 구조와 비교 분석하는 reproducibility test를 실행하였으며, X-선 결정체 구조의 ligand와 복합체 구조의 ligand 간의 root mean square deviation(RMSD)를 계산하였다. 이성체들의 docking 결과는 active site 잔기와의 수소결합 여부, 상호 작용하는 잔기의 특정 원소와의 거리 및 방향 등을 파악해 결합양상을 규명하였다.
데이터처리
- 문헌에 근거하여 상호작용이 일어날 것이라 예상되는 잔기들과 이성체를 근접하게 preposition 시키고 50000번의 simulation을 수행하였으며, 얻어진 구조들 중 에너지가 충분히 낮고 orientation이 적절한 구조를 최종 결과로 선택하였다. Docking 결과의 신뢰성을 부여하기 위해 먼저 X-선 결정체 구조의 ligand를 제거한 후 이 ligand를 docking하여 얻은 복합체의 결합양상을 X-선 결정체 구조와 비교 분석하는 reproducibility test를 실행하였으며, X-선 결정체 구조의 ligand와 복합체 구조의 ligand 간의 root mean square deviation(RMSD)를 계산하였다. 이성체들의 docking 결과는 active site 잔기와의 수소결합 여부, 상호 작용하는 잔기의 특정 원소와의 거리 및 방향 등을 파악해 결합양상을 규명하였다.
성능/효과
- 가장 저해활성이 좋은 RRS-MP(Fig. 4a)의 결합양상을 살펴보면 β-lactam 링의 N atom과 carbonyl 기의 O atom이 각각 Ser64와 수소결합을 하였고, active site 잔기인 Lys67, Gln120, Asn152와도 수소결합을 하며 안정하게 docking 되었다. 그러나 carbonyl group의 O atom과 Ser318의 main chain N atom과의 거리는 5.
- C-3위치에는 phenyl기가, C-6위치에는 methyl기가 치환된 4개의 이성체들을 docking한 결과도 IC50 값과 높은 상관관계를 나타내었다. 가장 저해활성이 좋은 RRS-MP(Fig.
- 이는 phenyl기가 결합되어 있는 C-3의 configuration이 S일 때는 R일 때 보다 steric hindrance가 더 커져서 active site으로 잘 들어가지 못한 것이라 생각된다. Docking 연구에서 나타난 결합양상에 의하면 저해활성이 가장 좋은 RR-PC는 Ser64와 두 개, 그리고 전체적으로 5개의 수소결합을 형성하면서 active site에 안정적으로 결합되었고 활성이 없는 SRPC와 SS-PC는 β-lactamase와 전혀 수소결합을 형성하지 못함으로써 결합양상과 활성과의 상관관계를 잘 제시하였다.
- 1a). His162, Asn193, Lys184, 그리고 물 분자와 수소결합을 하여 결정체 구조와 동일한 상호작용을 하였음을 확인하였다.
- 위의 결과들은 결합양상과 IC50 값 사이에 높은 상관관계가 형성되었음을 보여주고 있다. IC50 값이 좋은 이성체는 그렇지 않은 이성체에 비해 단백질의 주요 잔기들과 좀 더 가까웠고 다수의 수소결합으로 안정화되었으며 C-6 치환기들도 active site 공간으로 잘들어가 적절하게 docking 되었음을 확인하였다.
- 우선 사용한 프로그램의 정확성을 입증하기 위해 reproducibility test를 선행하였고 그 결과 이 프로그램이 X-선 결정체 구조를 정확하게 재현함을 확인하였다. Ligands를 docking한 결과는 활성이 좋은 이성체와 그렇지 않은 이성체 간의 결합양상의 차이가 IC50 값과 높은 상관성이 있다는 것을 보여줌으로써 docking 과정에서 타당한 상호작용이 제시됨을 확인하였다. 따라서 이 연구의 결과는 입체이성체와 β-lactamase 간의 상호작용에 대한 구조적 정보를 제공함으로써 활성이 있는 이성체를 선별할 수 있는 효과적인 방법으로 활용될 수 있을 것이다.
- OPCA-α와 β-이성체, 그리고 MCCA-α와 β-이성체 모두에서 β-lactamase 저해작용이 강한 β-이성체들이 α-이성체 보다 좋은 결합양상을 보여 활성 값과 일치하는 상관관계를 나타내었다. 즉 활성이 낮은 OPCA-α(Fig.
- C-3위치에는 phenyl기가, C-6위치에는 methyl기가 치환된 4개의 이성체들을 docking한 결과도 IC50 값과 높은 상관관계를 나타내었다. 가장 저해활성이 좋은 RRS-MP(Fig. 4a)의 결합양상을 살펴보면 β-lactam 링의 N atom과 carbonyl 기의 O atom이 각각 Ser64와 수소결합을 하였고, active site 잔기인 Lys67, Gln120, Asn152와도 수소결합을 하며 안정하게 docking 되었다.
- 07Å으로 oxyanion pocket을 형성하기에는 너무 먼 거리였다. 결과적으로 IC50 값이 가장 좋은 RRSMP는 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase의 active site 잔기와 전체적으로 5개의 수소결합을 형성하였고, 특히 작용기전에 가장 중요하다고 생각되는 Ser64와의 관계를 보면 그렇지 않은 이성체에 비해 더 가깝게 위치하면서 두 개의 강한 수소결합을 형성함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 docking에 의해 나타난 결합양상과 IC50 값 사이에 밀접한 연관성을 제시하므로 활성이 좋은 이성체의 선택에 정확한 근거가 될 수 있을 것이라고 생각된다.
- 94Å으로 SSR-MP보다도 더 멀리 위치하였다. 결합위치의 약간의 차이가 결합양상의 변화를 가져오고 이로 인하여 단백질과 이성체 간의 안정적인 결합력이 약화되어 저해활성 또한 약해지는 결과를 초래한다고 해석할 수 있다. 가장 저해활성이 낮은 RSRMP(Fig.
- 본 연구에서는 다양한 β-lactamase 저해제들의 이성체를 metallo-β-lactamase인 Bacteroides fragilis β-lactamase(class B)와 serine dependent β-lactamase인 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase(class C)에 docking하여 결합양상을 규명하고 그 결과를 활성과 비교하였다. 우선 사용한 프로그램의 정확성을 입증하기 위해 reproducibility test를 선행하였고 그 결과 이 프로그램이 X-선 결정체 구조를 정확하게 재현함을 확인하였다. Ligands를 docking한 결과는 활성이 좋은 이성체와 그렇지 않은 이성체 간의 결합양상의 차이가 IC50 값과 높은 상관성이 있다는 것을 보여줌으로써 docking 과정에서 타당한 상호작용이 제시됨을 확인하였다.
- 위의 결과들은 결합양상과 IC50 값 사이에 높은 상관관계가 형성되었음을 보여주고 있다. IC50 값이 좋은 이성체는 그렇지 않은 이성체에 비해 단백질의 주요 잔기들과 좀 더 가까웠고 다수의 수소결합으로 안정화되었으며 C-6 치환기들도 active site 공간으로 잘들어가 적절하게 docking 되었음을 확인하였다.
- 14A으로 RR-PC에 비해 더 멀게 위치하였다. 즉 RS-PC는 RR-PC보다 덜 안정적으로 docking 되었으며 이런 결합양상의 차이는 활성 차이와 잘 부합되었다. 한편 β-lactamase 저해활성이 거의 없는 것으로 나타난 SR-PC(Fig.
- 치환된 4개의 3-phenyl clavams의 이성체들을 docking한 결과를 Cierpucha 등에 의해 측정된 생리활성(Table 2)과 비교한 결과,5 C-3위치에 phenyl기가 치환된 clavams의 이성체 중 가장 효과가 좋은 것으로 측정된 RR-PC(Fig. 3a)는 active site의 Ser64, Gln120 및 Asn152와 수소결합을 하였다.
후속연구
- Computer-aided molecular docking 연구는 단백질과 ligand 간의 결합양상 규명을 통해 목표 단백질과 더 잘 결합 할 수 있는 저해제를 고안하거나 후보물질들 중에서 선택함으로써 기존의 방식과는 다른 새로운 방식으로 신약개발 후보물질의 도출에 접근할 수 있게 해 준다. 따라서 앞으로 신약개발 과정에서 활성이 있는 후보물질의 선택에 본 연구에서 사용한 flexible docking program이 효율적으로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
- Ligands를 docking한 결과는 활성이 좋은 이성체와 그렇지 않은 이성체 간의 결합양상의 차이가 IC50 값과 높은 상관성이 있다는 것을 보여줌으로써 docking 과정에서 타당한 상호작용이 제시됨을 확인하였다. 따라서 이 연구의 결과는 입체이성체와 β-lactamase 간의 상호작용에 대한 구조적 정보를 제공함으로써 활성이 있는 이성체를 선별할 수 있는 효과적인 방법으로 활용될 수 있을 것이다.
- 결과적으로 IC50 값이 가장 좋은 RRSMP는 Enterobacter cloacae P99 β-lactamase의 active site 잔기와 전체적으로 5개의 수소결합을 형성하였고, 특히 작용기전에 가장 중요하다고 생각되는 Ser64와의 관계를 보면 그렇지 않은 이성체에 비해 더 가깝게 위치하면서 두 개의 강한 수소결합을 형성함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 docking에 의해 나타난 결합양상과 IC50 값 사이에 밀접한 연관성을 제시하므로 활성이 좋은 이성체의 선택에 정확한 근거가 될 수 있을 것이라고 생각된다.
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