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문제 정의
- [2000]). 븐 연구진 또한 PAHs로 오염된 준설 퇴적물 처리를 위한 효율적인 bioslurry reactor를 개발하기 위해 다양한 생분해 조건들을 최적회하기 위한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 3이 되도록 하였다(강 등 [2004]). 30℃에서 일정기간(0, 2, 4, 6일) 배양 후 시료를 채취하여 전자전달계(ETS) 활성도와 PAHs 농도의 변화, 접종균주의 유지여부 및 군집구조 변화를 분석하였다.
- PAHs 분해율을 분석하기 위해 배걍 초기와 4일 배양 뒤 검출한계 값 이상의 농도를 보인 13 PAHs(Naphthalene, 2-Methylnaphthalene, 1 -Methylnaphthalei ie, Biphenyl, Acenaphthylene, Acenaphthene, Fluorene, Phenanthrene, Anthracene, Fluoranthene, Pyrene, Benz[a]anthracene, Chrysem) 잔류 농도를 즉정하여 4일 후의 잔류 비율을 표시하였다(Fig. ::). 모든 비멸균실험구에서는 PAHs의 분해가 없는 것으로 나타났나<Fig.
- (1998)의 방법에 따랐다. PCR 저해 물질로 알려진 humic acid는 GENECLEAN® Turbo Kit(QBIOgene)를 이용하여 제거하였다. 추출한 핵산으로부터 16S rDNA 증폭 과정 및 이에 사용된 primer의 구성은 기존(한국해양연구소 [1999])의 방법에 따라 시행하였다.
- 4. Profiles of T-RFs in some nonsterilized(A-D) and sterilized(E) sediment microcosms during 6 days of incubation (A: Uninoculated control at initial phase, B: Inoculated)y US6-1 only at initial phase, C: Inoculated by US6-1 accompanied with 1% M-CD after 6 days, D: Inoculated by US6-1 only after 2 days, E: Inoculated by US6-1 only at initial phase).
- 실험구는 크게 멸균한 퇴적토를 사용한 그룹과 멸균하지 않은 퇴적토를 사용한 그룹으로 나누었다. 또한 각 그룹은 대조구, M-CD 1%((주)두산콘프로덕츠코리아)와 yeast extract 0.01%를 첨가한 실험구, 앞의 실험구에 (NH4)2SO4와 KH2PO4의 형태로 N, P(C:N:P=100:10:l)를 첨가한 실험구로 나누었다. 각각의 실험구는 다시 균주접종 여부에 따라 균주가 들어가지 않은 대조구, 한 가지 또는 세 가지 혼합 균주를 함께 접종한 실험구의 세 가지로 구성된다.
- 전자전달계 활성값은 아래에 있는 방정식을 사용하여 계산하였다. 메탄올과 INT만 첨가된 blank와 INT 반응 전에 포르말린을 첨가한 killed control을 두어 ETS 활성값 계산에 이용하였다.
- 증폭된 유전자는 4 염기서열을 인지하는 제한효소 HaeⅢ(Promega) 5unit를 사용하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 Haem 5unit를 더 넣어 주고 2시간 동안 추가 반응시켰다. 반응이 끝난 후 생성된 말단제한절편(T-RF; terminal restriction fragment)의 크기는 자동염기서열 분석장치(모델 ABI 3100 Automated sequencer, Applied Biosystems Instrument)와 GeneScan 프로그램(ver. 3.7)을 이용하여 분석하였다.
- 제거하였다. 수분이 제거된 시료를 잘게 갈아주고 dichloromethane(DCM) 50 μl 에 내부표준물질(Internal standard)로 dg-naphthalene, dio-phenanthrene, di2-perylene(Sigma Aldrich)을 각각 5 μg씩을 녹여 첨가하였다. 20 ml의 DCM을 시 료가 들어있는 flask에 첨 가하고 ultrasonic bath(Branson 8210)에서 10분간 처리한 후 용매를 sodium sulfate 적당량이 얹혀진 GF/F filter에 여과시켜 퇴적물 입자와 잔여 수분을 걸러주었다.
- 89 ppm)를 이용하였고 멸균해수를 첨가하여 30%(v/v) slurry로 만들었다. 실험구는 크게 멸균한 퇴적토를 사용한 그룹과 멸균하지 않은 퇴적토를 사용한 그룹으로 나누었다. 또한 각 그룹은 대조구, M-CD 1%((주)두산콘프로덕츠코리아)와 yeast extract 0.
- 이 과정을 10 ml의 DCM으로 2번 반복하고 회수된 DCMe 자동시료농축장치 (TurboVap®)를 이용하여 1ml 정도로 농축시켰다. 외부표준물질로 DCM 50 μl에 녹인 decafluorobiphenyl (Sigma Aldrich) 5 μg을 첨가하고 2 ml 용량의 autosampler vial에 옮긴 뒤 GC/MS (Varian CP3800 GC, Varian Saturn 2000 MS)로 분석하였다. 분석 방법 및 조건은 Table 1과 같다.
- cyclodextrin(M-CD)이 효과적으로 B-HPCD를 대체할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라 본 연구에서는 경제성을 고려하여 B-HPCD를 M-CD로 대체 하였다. 이와 같은 연구에 기반하여 30% slurry 농도에서 미생물의 전자전달계 활성도와 PAHs 잔류량 및 미생물 군집구조 변화를 조사함으로써 PAHs 분해균주의 접종 유무, 토착미생물의 존재유무, M-CD 첨가 유무 및 무기영양원의 첨가 유무가 PAHs 제거에 미치는 영향을 분석하였다.
- 이에 따라 본 연구에서는 경제성을 고려하여 B-HPCD를 M-CD로 대체 하였다. 이와 같은 연구에 기반하여 30% slurry 농도에서 미생물의 전자전달계 활성도와 PAHs 잔류량 및 미생물 군집구조 변화를 조사함으로써 PAHs 분해균주의 접종 유무, 토착미생물의 존재유무, M-CD 첨가 유무 및 무기영양원의 첨가 유무가 PAHs 제거에 미치는 영향을 분석하였다.
- 현장퇴적토는 PAHs 오염이 심한 광양만의 퇴적토(total PAHs concentration: 12.06±1.89 ppm)를 이용하였고 멸균해수를 첨가하여 30%(v/v) slurry로 만들었다. 실험구는 크게 멸균한 퇴적토를 사용한 그룹과 멸균하지 않은 퇴적토를 사용한 그룹으로 나누었다.
대상 데이터
- [2004]), Kytococccus sedentarius PAH5, Bacillus aquimaris YSR9이다. PAH5, YSR9 균주는 ZoBell 액체배지에서, US6-1 균주는 M-CD 1%가 첨가된 ZoBell 액체배지에서 1일간 전배양한 후 사용하였다. 최종 접종 농도는 배양액 기준 OD660=0.
- 실험에 사용된 균주는 N. pentaromativorans US6-l(Shon et al. [2004]), Kytococccus sedentarius PAH5, Bacillus aquimaris YSR9이다. PAH5, YSR9 균주는 ZoBell 액체배지에서, US6-1 균주는 M-CD 1%가 첨가된 ZoBell 액체배지에서 1일간 전배양한 후 사용하였다.
이론/모형
- 핵산 추출 과정의 기본적인 방법은 Kuske et al.(1998)의 방법에 따랐다. PCR 저해 물질로 알려진 humic acid는 GENECLEAN® Turbo Kit(QBIOgene)를 이용하여 제거하였다.
- PAHs 분해균주로 선발된 US6-1, PAH5 및 YSR9 균주를 PAHs 로 오염된 퇴적토에 접종하였을 때 접종균주의 유지여부 및 토착미생물과의 상관관계를 T-RFLP 방법을 이용하여 분석하였다. 접종된 세 균주의 16S rDNA를 제한효소 Haelll로 잘랐을 때 생성되는 T-RF는 US6-1 균주 226bp, YSR9 균주 310bp, PAH5 균주는 231bp이다.
- 세균군집의 다양성은 미생물 다양성의 지문분석 방법 (Fingerprinting method) 중 민감도가 높고 분석시간이 짧은 말단 제한 절편 다형성(T-RFLP: Terminal restriction fragment length polymorphism) 방법을 이용하여 조사하였다(Liu et al. [1997]). 배양 2일 후와 6일 후 시료 1 ml를 채취하여 lxPBS(pH8.
- PCR 저해 물질로 알려진 humic acid는 GENECLEAN® Turbo Kit(QBIOgene)를 이용하여 제거하였다. 추출한 핵산으로부터 16S rDNA 증폭 과정 및 이에 사용된 primer의 구성은 기존(한국해양연구소 [1999])의 방법에 따라 시행하였다. 증폭된 유전자는 4 염기서열을 인지하는 제한효소 HaeⅢ(Promega) 5unit를 사용하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 Haem 5unit를 더 넣어 주고 2시간 동안 추가 반응시켰다.
성능/효과
- 이는 유기 영양원의 고갈에 따라 급격한 군집구조 변화가 생긴 것이 원인으로 추정된다. M-CD가 첨가되지 않은 비멸균실험구에서 PAHs 분해가 일어나지 않았던 결과와 비교하면 토착미생물의 PAHs 분해력은 매우 낮은 반면 접종 균주는 토착미생물과의 경쟁으로 성장이 제한됨으로 인해 PAHs 분해가 진행되지 못한 것으로 사료된다.
- (2002)은 탄화수소로 오염된 토양에 무기 영양염을 첨가하는 생물정화 작업과정에서 미생물 군집 구조가 단순하게 변화했다는 보고를 참조할 때, 본 연구에 사용한 M-CD는 탄소원으로 미생물의 활성과 토착미생물의 군집구조에 영향을 미치는 것으로 판단된다. M-CD를 첨가하지 않은 실험구에서는 접종한 PAHs 분해균주의 T-RFs는 검출되지 않았으며, 균주의 접종유무에 상관없이 초기 시료에서는 비율이 높지 않았던 552~556bp의 T-RFs를 보이는 미생물 군집이 20% 이상으로 급격히 증가되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 4D). 이는 유기 영양원의 고갈에 따라 급격한 군집구조 변화가 생긴 것이 원인으로 추정된다.
- M-CD를 첨가한 퇴적토에 PAHs 균주를 접종하고 2일 배양하였을 때 접종균주의 비율은 초기값에 비해 43~45%로 증가되었으나, 시간이 경과됨에 따라 접종 균주의 비율은 18~23%로 감소하였고 다른 다양한 T-RFs들의 비율이 높아져 토착미생물들이 성장하였음을 알 수 있었다(Fig. 4C). 이는 토착미생물의 존재가 접종균주의 성장을 제한할 수 있다는 가정을 뒷받침하는 결과이다.
- 멸균실험구의 경우 균주를 접종하지 않은 대조구는 유효한 분해율을 보이지 않았고 균주를 접종한 실험구에서 US6-1 간을 접종했을 때 9-20%, 혼합 균주를 접종했을 때 24~37%의 븐해율을 보였다. PAHs 분해율은 M-CD를 첨가한 실험구에서 침가하지 않은 실험구에 비해 높은 값을 보였으며 N, P를 추가로 첨가하는 것은 PAHs 분해에 영향을 미치지 않았다(Fig. 2b). 멸균실험구 #5에서 배양전과 4일배양 후의 PAHs 분해율을 비교하면 타 PAHs에 비해 농도가 높았던 fluoranthene, pyrene, benz[a]anthracene, chrysene등의 중 고분자 PAHs 분해율이 높게 나타났다(Fig.
- 4A). US6-1 균주만 접종한 실험구의 초기에 227bp 의 T-RF는 32%의 비율을 보였고 그 외에 토착미생물의 절편이 다수 검출되었으며(Fig. 4B), 본 연구에는 표기하지 않았으나 세균주를 접종한 실험구의 초기에 227bp는 25%, 310bp는 23%의 비율을 보였다.
- 이에 따라 강 등(2004)은 B-HPCD를 대체할 수 있는 보다 저렴한 물질을 탐색하였고 혼합.cyclodextrin(M-CD)이 효과적으로 B-HPCD를 대체할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라 본 연구에서는 경제성을 고려하여 B-HPCD를 M-CD로 대체 하였다.
- (2004)은 PhHs의 생분해 연구과정에서 PAHs 분해 미생물인 Novosphingobium .xntaromativorans US6-1 균주와 2-hydroxypropyl-B-cyclodextrin(B-HI'CD)-s 처리할 경우 benzo [a]pyrene(BaPX 비롯한 고분자 PAH;의 분해율을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 그러나 B-HPCD의 경우 kg당 십 만원이 넘는 높은 가격으로 인하여 실제로 biosluny reactor에 사용하기에는 무리가 있다.
- 16 (ig-OMnl/hour로 낮지만 ETS 활성이 나타났는데 이것은 퇴적물에 잔류하는 환원물질의 영향으로 사료된다. 균주를 접종한 실험구는 M-CD 및 N, P를 첨가하였을 때 ETS 활성이 2일 배양 후 4.99±0.39 μg-O2/ml/hour, 6.07±1.37 ng-O2/ml/hour(N, P 첨가구), 4일 배양 후 3.03±0.22 μg- O2/ml/hour, 3.73±1.33 gg-O2/ml/hour(N, P 첨가구)로 M-CD 및 무기 영양염을 첨가하지 않은 실험구의 ETS 활성값 2.13±1.05 μg-O2/ ml/hour(2일 배양), 1.59±0.22 ug-C)2/ml/hour(4일 배양) 보다 2배 이상 높게 나타났으며 배양 기간이 경과함에 따라 감소하는 경향을 보였다. 멸균실험구 중 M-CD와 N, P를 첨가한 후 혼합 균주를 접종한 실험구의 2일차 ETS 활성값이 7.
- 22 ug-C)2/ml/hour(4일 배양) 보다 2배 이상 높게 나타났으며 배양 기간이 경과함에 따라 감소하는 경향을 보였다. 멸균실험구 중 M-CD와 N, P를 첨가한 후 혼합 균주를 접종한 실험구의 2일차 ETS 활성값이 7.04±0.44 gg-O2/ml/hour로 가장 높은 값을 나타내었다(Fig. 1b).
- 균주를 접종하지 않은 실험구에서는 DNA가 추출되지 않아 검출할 수 없었다. 멸균실험구에서 접종한 PAHs 분해균주는 시간이 경과하여도 균주의 비율이 비멸균실험구와 달리 유지되는 것을 확인할 수 있었다. PAHs 분해균주가 접종된 각 실험구에서 부분적으로 비특이적인 T-RFs가 검출되었는데 이는 PCR 후 제한효소 반응 단계에서 불완전한 반응에 의해 발생한 오류로 추정된다.
- 2a). 멸균실험구의 경우 균주를 접종하지 않은 대조구는 유효한 분해율을 보이지 않았고 균주를 접종한 실험구에서 US6-1 간을 접종했을 때 9-20%, 혼합 균주를 접종했을 때 24~37%의 븐해율을 보였다. PAHs 분해율은 M-CD를 첨가한 실험구에서 침가하지 않은 실험구에 비해 높은 값을 보였으며 N, P를 추가로 첨가하는 것은 PAHs 분해에 영향을 미치지 않았다(Fig.
- 멸균처리 하지 않은 퇴적토 slurry에서 M-CD의 첨가에 따라 ETS 활성도는 증가한 반면 분해균츠의 접종 여부에 관계없이 PAHs의 분해는 관찰할 수 없었다. 한 M-CD가 첨가되지 않을 경우 ETS 활성도도 낮게 유지되는 것을 볼 때 M-CD는 퇴적토 내 미생물의 성장원으로 작용한 것으로 생각된다.
- 접종된 세 균주의 16S rDNA를 제한효소 Haelll로 잘랐을 때 생성되는 T-RF는 US6-1 균주 226bp, YSR9 균주 310bp, PAH5 균주는 231bp이다. 비멸균실험구에서 균주를 접종하지 않은 초기 퇴적토에서 약 35개의 T-RFs가 검출 되었으나 각각의 비율은 10% 미만으로 나타났다(Fig. 4A). US6-1 균주만 접종한 실험구의 초기에 227bp 의 T-RF는 32%의 비율을 보였고 그 외에 토착미생물의 절편이 다수 검출되었으며(Fig.
- 비멸균실험구의 경우 ETS 활성도가 동일 조건의 멸균 실험 구와 유사한 수준이었지만(Fig. 1) PAHs의 분해율은 매우 낮게 나타났다(Fig. 2). Ramadan et al.
- 세균의 성장과 활성을 간접적으로 타나내는 지표인 ETS 활성도를 측정한 결과 토착미생물이 살아있는 비멸균실험구에서는 분해균주의 접종 여부가 ETS 활성도에 별다른 영향을 미치지 않았다. M-CD가 첨가되지 않은 실험구에서 2일 배양 후 ETS 활성도는 1.
- 이상의 결과로 볼 때 멸균실험구에서 접종된 균주는 탄소원이 있을 경우와 경쟁 대상이 없는 경우 기속적으로 높게 유지되었으며, 이에 따라 접종 균주가 토착미생물과의 경쟁 혹은 포식압에의해 적절한 수준으로 증가하지 못한 비멸균실험구에서와는 달리 PAHs 분해가 진행된 것으로 사료된다.
- 접종 균주의 수는 ETS 활성값에 영향을 미치지 않은 반면 M-CD가 첨가된 모든 실험구에서 ETS 값이 크게 증가한 것으로 볼 때 접종한 균주와 토착미생물 모두 M-CD를 탄소원으로 이용해 성장한 것으로 판단된다. M-CD가 첨가된 실험구의 경우 비멸균실험구의 ETS 활성값이 멸균실험구의 ETS 활성값에 비해 2일 배양 후에는 낮게 나타났으나 4일 배양 후에는 유사한 수준을 보였다.
- 또한 T-RFLP 방법으로 수행한 군집분석 녈과로 볼 때 토착 미생물은 접종균주의 성장을 억제하는 요인으로 작용한 것으로 사료된다. 한편 포식자와 토착미생물이 존재하지 않는 멸균실험구의 경우 분해균주와 M-CD 및 N, P를 첨가한 실험구에서 ETS 활성도가 높게 나타났으며 접종한 균주가 지속적으로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 이들 실험구에서는 PAHs 분해율 도 높게 나타났다.
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