파극천(巴戟天)이 좌골신경(坐骨神經) 절단(切斷)으로 유발(誘發)된 ddy 마우스 골다공증(骨多孔症) 모델의 예방효과(豫防效果)에 미치는 영향(影響) The Effect of Morindae Radix Extracts on the Sciatic Nerve Neurectomized Osteoporotic ddy Mice Model Prevention Effects원문보기
Objectives : The present study attempted to reveal the effects of Morindae Radix extracts on the sciatic nerve neurectomized osteoporotic ddy mice model. Methods : Thickness of hind limbs and their differences, absolute and relative tibia weight and thickness, bone failure load, bone mineral density...
Objectives : The present study attempted to reveal the effects of Morindae Radix extracts on the sciatic nerve neurectomized osteoporotic ddy mice model. Methods : Thickness of hind limbs and their differences, absolute and relative tibia weight and thickness, bone failure load, bone mineral density (BMD), histomorphometrical index, serum osteocalcin level, tibia calcium and phosphorus contents were monitored. Results : In sciatic neurectomized mice, thickness of hind limb, absolute and relative weights, thickness, failure loads, BMD of tibia, trabecular bone volume (TBV), thickness of trabecular bone and cortical bone thickness, length were significantly decreased. However, these changes of those dose-dependently reduced in MR extract-dosing group. Conclusions : it is considered that MR extracts have some favorable effect to prevent, the osteoporosis induced by sciatic neurectomy. However, the exact mechanism and the possibility of MR extract were remains unknown. In addition, the potential toxicity of these MR extracts were also unknown. So the further studies were needed about toxicological and pharmacological aspects.
Objectives : The present study attempted to reveal the effects of Morindae Radix extracts on the sciatic nerve neurectomized osteoporotic ddy mice model. Methods : Thickness of hind limbs and their differences, absolute and relative tibia weight and thickness, bone failure load, bone mineral density (BMD), histomorphometrical index, serum osteocalcin level, tibia calcium and phosphorus contents were monitored. Results : In sciatic neurectomized mice, thickness of hind limb, absolute and relative weights, thickness, failure loads, BMD of tibia, trabecular bone volume (TBV), thickness of trabecular bone and cortical bone thickness, length were significantly decreased. However, these changes of those dose-dependently reduced in MR extract-dosing group. Conclusions : it is considered that MR extracts have some favorable effect to prevent, the osteoporosis induced by sciatic neurectomy. However, the exact mechanism and the possibility of MR extract were remains unknown. In addition, the potential toxicity of these MR extracts were also unknown. So the further studies were needed about toxicological and pharmacological aspects.
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문제 정의
본 연구에서는 골다공증 모델 중 좌골신경 절단 ddy 마우스 골다공증 모델에서 파극천 추출물의 예방효과를 평가하기 위하여, 좌골신경 절단 3일 후부터 매일 각각 50, 100 맟 200 mg/k& 의 파극천 추출물을 6주 동안 투여하고, 여러가지 변화를 관찰하고자 하였다.
본 연구에서는 좌골신경 절단 ddy 마우스 골다공증 모델에서 파극천 추출물의 예방효과를 평가하기 위하여 좌골신경 절단 3일 후부터 매일 파극천 추출물을 6주 동안 투여하고, 체중의 변화, 후지 두께의 변화, 좌골신경을 절단한 경골 중량 및 두께의 변화, 골밀도, 골강도, histomorphometiical 변화, 혈중 osteocalcin 농도의 변화, 뼈 내의 칼슘과 인의 함량 및 이들의 함량 비율의 변화를 관찰하였다.
파극천 추출물의 골다공증에 대한 예방효과를 알아보기 위해 ddy 마우스 골다공증 모델을 사용하여 관찰하였던 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
가설 설정
1) Group ID was lisicxi in Table 1. 2) Failure load was detected by automatized loacter detecter (AIKOH, Japan) as kg levels. 3) Bone mineral density was detected by dual-energy x-ray absctfptionmetry (HXImus : Lunar Medison WI) as nig/cm2 levels.
2) Failure load was detected by automatized loacter detecter (AIKOH, Japan) as kg levels. 3) Bone mineral density was detected by dual-energy x-ray absctfptionmetry (HXImus : Lunar Medison WI) as nig/cm2 levels. ** p<0.
2> TBV (%), trabe(?ular bone vfjlunK? peTcentase. 3) Cortical lhicl<ness cross cortical bone thid<ness. 4) Oc N.
제안 방법
① 지주골량 측정 : 경골의 지주골량은 홍의 방법에 따라 경골 내에서 지주골이 차지하는 비율로 계산하였으며, 자동 조직분석장치 (analysis image processing ; Soft Image System, GermanyX 이용흐)" 여 백분율 단위로 산출하였다.
④ 지주골 두께 측정 : 지주골의 두께는 홍w의 방법에 따라 한 경골 표본 상에 존재하는 지주골 중 가장 넓은 지주골의 두께를 조직분석장치를 이용하여 p m 단위로 측정한 후 그 평균으로 산출하였다.
⑤ 지주골 길이 측정 : 지주골의 길이는 흥川의 방법에 따라 한 경골 표본 상에 존재하는 지주골 중 가장 긴 지주골의 길이를 조직분석장치를 이용하여 mm 단위로 측정한 후 그 평균으로 산출하였다.
경골 두께의 변화를 관찰하기 위하여, 최종 부검 일에 모든 실험동물을 희생 한 다음 좌골신경을 절단한 쪽의 경골을 적출하고 주위 근육 및 연 조직을 제거하고, 경골의 두께를 측정하였다. 경골의 두께는 골두, 골 몸체 및 종자골 부분으로 구분하고 vernier calipers를 이용하여 각각 mm 단위로 측정하였다.
경골의 강도 변화를 관찰하기 위하여, Huuskonen 등以의 방법에 준하여 최종 부검 일에 모든 실험동물을 희생 한 다음 좌골신경을 절단한 쪽의 경골을 적출하고 주위 근육 및 연 조직을 제거하고, 경골의 강도를 골강도 측정기 (AIKOH, Japan)를 이용하여 골이 골절되는 순간의 강도를 kg으로 표시하여 측정하였다.
경골의 골밀도 변화를 관찰하기 위하여, Iwamoto 등(1)의 방법에 따라 최종 부검 일에 모든 실험동물을 희생 한 다음 좌골신경을 절단한 쪽의 경골을 적출하고 주위 근육 및 연 조직을 제거하고, 경골의 골밀도를 dual-energy x-ray absorptionmetiy (PIXImus : Lunar Medison WIX 이용하여 mg/cm2 단위로 측정하였다.
경골의 두께를 측정하였다. 경골의 두께는 골두, 골 몸체 및 종자골 부분으로 구분하고 vernier calipers를 이용하여 각각 mm 단위로 측정하였다.
경골의 무게를 측정하였다. 경골의 무게는 절대 중량치와 상대 중량치로 구별하여 측정하였다. 체중 차이에 의한 경골 무게의 변화를 줄이기 위하여 아래의 공식을 이용하여 절대 중량치를 부검 당일의 체중에 대한 백분율로 계산하였다.
종아리부위에서 측정하였다. 또한 좌골신경을 절단한 쪽과 절단하지 않은 쪽과의 차이를 아래의 공식을 이용하여 mm 단위로 관찰하였다.
뼈 내에 존재하는 칼슘과 인의 함량을 측정하기 위하여, 좌골신경을 절단한 쪽의 경골을 적출한 다음, 주위 연조직 및 근육조직을 제거하고, 경골을 120笆 에서 8시간동안 건조시킨 후 furnace (한국종합기기제작소, Korea)에서 800℃, 6시간동안 가열하여 탄화시키고 질산에 완전히 용해시켰다. 이것을 증류수로 적정농도 희석한 다음, 탄화골 무게당 칼슘과 인의 양을 측정하였다.
질산에 완전히 용해시켰다. 이것을 증류수로 적정농도 희석한 다음, 탄화골 무게당 칼슘과 인의 양을 측정하였다. 칼슘량은 Tuukkanen 등打>의 방법에 준하여 ortho-cresolphthalein complexon 발색법 (칼슘측정용 kit.
, Korea) 1 을 근육 주사하여 마취시킨 다음, 대조군 및 파극천 추출물 투여군에서는 오른쪽 둔부를 절개하여 천둔근을 노출시킨 다음 천둔근의 가운데 부분을 다시 절개하여 이 근육의 중앙을 지나가는 좌골신경을 노출시켰다. 이후 노출된 좌골신경을 약 1 mm 정도 절제하고 일반적인 외과적 방법에 준하여 피부와 근육을 동시에 봉합하였다. 수술 10일 후 모든 실험동물의 피부 봉합사를 제거하였다.
좌골신경 절단 흐, 홍川의 방법에 따라 後肢의 두께 변화를 vernier calipers를 이용하여 mm 단위로 양쪽 종아리부위에서 측정하였다. 또한 좌골신경을 절단한 쪽과 절단하지 않은 쪽과의 차이를 아래의 공식을 이용하여 mm 단위로 관찰하였다.
좌골신경을 절단하였다. 즉, 실험동물은 1주일 간의 적응기간을 거친 후, xylazine hydrochloride (Yuhan Corp., Korea) 0.2 ㎎/㎏을 근육 주사하여 진정시키고, ketamine hydrochloride (Yuhan Corp., Korea) 1 을 근육 주사하여 마취시킨 다음, 대조군 및 파극천 추출물 투여군에서는 오른쪽 둔부를 절개하여 천둔근을 노출시킨 다음 천둔근의 가운데 부분을 다시 절개하여 이 근육의 중앙을 지나가는 좌골신경을 노출시켰다. 이후 노출된 좌골신경을 약 1 mm 정도 절제하고 일반적인 외과적 방법에 준하여 피부와 근육을 동시에 봉합하였다.
경골의 무게는 절대 중량치와 상대 중량치로 구별하여 측정하였다. 체중 차이에 의한 경골 무게의 변화를 줄이기 위하여 아래의 공식을 이용하여 절대 중량치를 부검 당일의 체중에 대한 백분율로 계산하였다.
최종 부검일에 좌골신경을 절단한 쪽의 경골을 절취하고 절취 즉시 10% 중성 포르말린에 24시간 이상 고정하였으며, 탈회 액 (244% fonnic acid, and 0.5N sodium hydroxide) 에 매일 액을 교환하면서 5일간 탈회하였다’ 탈회 완료 후, ethanol 계열로 탈수시키고, 통상적인 방법 델만법으로 paraffin 포매를 실시하여, 3-4 剛의 연속절편을 제작하였으며, Hematoxylineosin 염색을 실시하고 광학현미경하에서 조직학적 변화를 관찰하였다.
한 그룹에 10 마리씩 정상군 (sham), 대조군 (control)과 파극천 추출물 (MR extract) 50 (DI), 100 (D2) 및 200 (D3) ㎎/㎏ 투여군의 5개 군으로 구분하였으며, 각 군의 특징은 Table 1에 기록하였다.
대상 데이터
감압.농축하여 점조성의 추출물을 얻은 다음 programmable freeze dryer (IlShin Lab., Seoul, Korea)를 사용하여 동결 건조시켜 총 38.44g (수율 6.41%의 물 추출물을 얻어 실험에 사용하였다.
중국산 파극천을 약재상(조흥 약업사, 대구)으로부터 구입하여 사용하였으며, 구입한 파극천 중 HPLC를 이용하여 유기인제와 무기인제제와 같은 살충제 성분의 잔존여부를 확인하고, 불순물의 농도가 1%이하인 파극천 만을 선정하여 사용하였다. 모든 약재는 습기가 없는 desicator에 추출물 제조 전까지 보관 후 사용하였다.
사용하였다. 체중 25-27 g의 6주령 ddy 마우스를 사육상자에 10마리씩 수용하여, 주위 환경에 약 1주일간 순화시킨 후 사용하였다.
총 50마리의 암컷 ddy 마우스(SLC, Japan)를 본 실험에 사용하였다. 체중 25-27 g의 6주령 ddy 마우스를 사육상자에 10마리씩 수용하여, 주위 환경에 약 1주일간 순화시킨 후 사용하였다.
데이터처리
모든 수치는 평균 土 표준편차로 계산하였으며, Mann-Whitney U- Wilcoxon Rank Sum W test (M-W test)를 이용하여 군간의 유의성을 검사하였고, p value가 0.05 이하일 경우 유의성을 인정하였다 통계처리는 SPSS for Windows (SPSS Inc., USA)를사용하였다.
이론/모형
③ 파골세포 수 측정 : 파골세포의 수적변화는 홍'" 의 방법에 따라 1 mm, 내의 조직에 존재하는 수를 자동 조직분석장치를 이용하여 number/mm2 단위로 산출하였다.
② 피질골 두께 측정 : 피질골의 두께는 홍의 방법에 따라 골 몸체부분에서 자동 조직분석장치를 이용하여 网단위로 산출하였다.
경골 무게의 변화는 홍”'의 방법에 따라 최종 부검 일에 모든 실험동물을 희생 한 다음 좌골신경을 절단한 쪽의 경골을 적출하고 주위 근육 및 연 조직을 제거하고, 경골의 무게를 측정하였다. 경골의 무게는 절대 중량치와 상대 중량치로 구별하여 측정하였다.
실험동물은 변형된 Sakai 둥如의 방법에 따라 오른쪽 좌골신경을 절단하였다. 즉, 실험동물은 1주일 간의 적응기간을 거친 후, xylazine hydrochloride (Yuhan Corp.
이것을 증류수로 적정농도 희석한 다음, 탄화골 무게당 칼슘과 인의 양을 측정하였다. 칼슘량은 Tuukkanen 등打>의 방법에 준하여 ortho-cresolphthalein complexon 발색법 (칼슘측정용 kit. ASAN, Korea)을 사용하였으며, 인량은 Tarvainen 등®의 방법에 준하여 효소법 (무기인 측정용 kit. ASAN, Korea)을 이용하여 mg/g bone 단위로 측정하였다.
, Korea) 1 ㎎/㎏을 근육 주사하여 마취시킨 다음, 복강을 절개한 후 복대정맥을 노출시킨 후, 1 ml의 혈액을 채취하고, 채혈한 혈액은 실온에서 24시간이상 방치시킨 다음 3000 rpm에서 此분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청 중 osteocalcin 함량은 Iwamoto 등w의 방법에 따라 RIA Kit를 사용하여 자동분석장치 (ICN Co., USA)> 이용하여 re/ml 단위로 측정하였다.
성능/효과
1- 후지의 두께는 신경절단을 실시한 대조군에서 정상군에 비해 유의성 있게 감소되었으며, 양쪽 후지의 두께 차이 역시 대조군에서 정상군에 비해 유의성 있게 증가되었다. 파극천 추출물 투여군에서는 용량 의존성으로 대조군에 비해 유의성 있게 경감되었다.
3. 경골내 단위면적당 파골세포의 수, 혈중 osteocalcin의 함량은 신경절단는 신경절단을 실시한대 조군에서 정상군에 비해 유의성 있게 증가된 반면, 파극천 추출물 투여군에서는 용량의존성으로 대조군에 비해 유의성 있게 경감되었다.
4. 경골내 칼슘 및 인의, 비율은 모든 실험군에서 유사한 수치를 나타내었다.
01) 감소하였다. D1 군에서는 1.17 ± 0.04 mm로 관찰되어 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.05) 증가되었고, D2와 D3 군에서는 각각 L20 ±0.01 및 L27 ±0.04 mm로 관찰되어, 두 군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 경골 몸체의 두께 증가가 인정되었다 (Table 6).
D2, D3군에서는 좌골신경을 절단한 우측 후지의 두께는 각각246 + 0.27 mm, 2.60 ± 0.14 mm로 관찰되어 대조군에 비해 유의성 있는 증가가 인정되었고, 정상군에 비해서는 여전히 유의성 있게 감소되었으며, 좌우 측 후지의 두께 차이 역시 각각 0.90 + 0.28 mm, 0.72 ±0.22 mm로 관찰되어 대조군에 비해서 유의성 있게(p<0.01) 감소하였고, 정상군에 비해서는 여전히 유의성 있게 (p<0.01) 증가되었다.(Table 2).
01) 감소하였다. D2와 D3 군에서 각각 1.21 ± 0.02 및 1.25 + 0.04 mm로 관찰되어 두 군 모두 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 경골 종자골 부위의 두께 증가가 인정되었다 (Table 4).
01) 감소하였다. D2와 D3 군에서는 각각 1.99 + 0.07 및 2.07 ± 0.13 mm로 관찰되어, 두군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 (p<Q01) 경골 골두 두께의 증가가 인정되었다 (Table 6).
01) 감소되었다. D2와 D3 군에서는 각각 32.20 ± 2.39 및 32.69 ±3.26 ym로 관찰되어, 두 군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 지주골 두께의 증가가 인정되었다 (Table 7).
01) 감소되었다. D2와 D3 군에서는 각각 47.75 ±3.34 및 51.66 ±2.13 mg/g bone으로 관찰되어, 두 군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05 또는 p<0.01) 경골내 칼슘 함량의 증가가 인정되었다 (Table 9).
01) 감소하였다. D3 군에서 0.22 ± 0.01%로 관찰되어 대조군에 비해서 유의성 있는 (p<0.01) 증가가 관찰되었다 (Table 3).
01) 현저히 감소되었다. DI, D2, D3 군에서 각각 1.06 ±0.20 mm, 1.19 ±0.17 mm, 1.29 ±0.12 mm로 관찰되어 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.05) 증가되었다 (Table 7).
01) 감소하였다. DI, D2, D3 군에서 각각 1.26 ± 0.13 kg, 1.24 ± 0.09 kg, 1.32 + 0.06 kg으로 관찰되어 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.01) 증가되었다 (Table 5).
01) 현저히 감소되었다. DI, D2, D3 군에서 각각 136.57 ± 20.01 iim, 153.36 ± 17.09 pm, 172.03 ±14.68 iim로 관찰되어 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.01 또는 p<0.05) 증가되었다 (Table 6).
01) 현저히 감소되었다. DI, D2, D3 군에서 각각 26.41 ±3.71%, 32.13 ± 2.70%, 36.18 + 4.63%로 관찰되어 대조군에 비해 유의성 있게(p<0.01 또는 p<0.05) 증가되었다 (Table 6).
01) 현저히 증가되었다. DI, D2, D3 군에서 각각 30.55 ± 1.83 ng/ml, 27.89 ±2.46 ng/ml, 27.28 ±2.95 ng/ml로 관찰되어 대조군에 비해 유의성 있게 (p<0.05) 감소되었다 (Table 8).
2. 경골의 절대 중량치, 상대 중량치, 두께, 강도, 골밀도, 지주골량, 피질골 두께 지주골 길이와 두께, 칼슘과 인의 함량은 신경절단을 실시한 대조 군에서 정상군에 비해 유의성 있게 감소된 반면, 파극천 추출물 투여군에서는 용량의존성으로 대조군에 비해 유의성 있게 경감되었다.
두께 감소가 초래된다고 보고하였다. 본 실험의 결과 신경을 절단한 ddy 마우스에서는 지주 골의 길이 및 폭이 현저히 감소했으며, 정상군에 비해 현저한 지주골량의 감소 및 피질골 두께의 감소가 신경을 절단한 쪽의 경골에서 관찰되었다. 이러한 조직학적 또는 histomorphometrical 변화들이 파극천 추출물 투여에 의해 용량 의존성으로 경감되었다.
27皺. 본 연구에 의하면 현저한 경골 강도의 저하가 신경절단 후 초래되었으나, 이러한 경골 강도의 저하는 파극천 추출물 투여에 의해 용량 의존성으로 경감되었다.
유발 정도를 파악할 수 있다. 본 연구의 결과 좌골신경을 절단한 모든 실험동물에서 현저한 골밀도의 감소가 초래되었고, 파극천 추출물 투여에 의해 용량 의존성으로 경감되었다.
차이의 증가 역시 인정되었다. 신경절단 후 초래되는 후지의 두께 차이의 변화는 좌골신경 절단에 따른 근육 및 뼈 등의 불용성 위축에 의한 것으로 생각되며, 본 실험의 결과 파극천 추출물의 투여에 의해 이러한 일련의 변화가 용량 의존성으로 경감되었다. 골 중량은 신경절단 수술 후 현저한 감소가 초래된다고 알려져 있다(2)倔%河 본 실험의 결과 좌골신경을 절단한 쪽의 경골 중량 및 경골의 부위별 두께가 현저히 감소하여 이전의 보고들과 일치하였으며, 이러한 경골의 중량 및 두께의 감소가 파극천 추출물투여에 의해 용량 의존성으로 경감되었으므로, 파극천 추출물이 신경절단에 의한 불용성 골다공증에 유효한 예방효과를 나타낼 것으로 생각되나, 6주 후에도 완전히 정상 수치로 회복되지 않는 점으로 보아 좀 더 장기적인 투여 또는 다른 약물과의 병용이 요구될 것으로 생각된다.
정상군의 경우, 경골내 인 함량은 40.05 ± 8.32 mg/g bone으로 관찰되었으나, 대조군에서는 25.89 ±4.34 mg/g bone으로 관찰되어 정상군에 비해 유의성 있게 (p<0.01) 감소되었다 D2와 D3 군에서는 각각 30.86 ±0.53 및 35.42 ±2.25 mg/g bone으로 관찰되어, 두 군 모두에서 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 경골내 인 함량의 중가가 인정되었다 (Table 9).
정상군의 경우, 오른쪽 경골의 피질골 두께는 207.70 ± 14.65 um로 관찰되었으나, 대조군에서는 105.21 + 16.15 iim로 관찰되어 정상군에 비해 유의성 있게 (p<0.01) 현저히 감소되었다. DI, D2, D3 군에서 각각 136.
따라서 경골 내 인 함량의 변화는 신경절단 모델에서 골다공증의 유발 정도를 평가할 수 있는 하나의 중요한 지표가 되고 있다. 좌골신경을 절단한 모든 실험동물에서 현저한 뼈 내인 함량의 감소가 초래되었고, 파극천 추출물 투여에 의해 용량 의존성으로 경감되었다.
따라서 신경절단 후 초래되는 벼내 칼슘의 함량 저하는 하나의 중요한 지표로 이용되고 있다. 좌골신경을 절단한 모든 실험동물에서 현저한 뼈내 칼슘 함량의 감소가 초래되었고, 파극천 추출물 투여에 의해 용량 의존성으로 경감되었다..
후속연구
신경절단 후 초래되는 후지의 두께 차이의 변화는 좌골신경 절단에 따른 근육 및 뼈 등의 불용성 위축에 의한 것으로 생각되며, 본 실험의 결과 파극천 추출물의 투여에 의해 이러한 일련의 변화가 용량 의존성으로 경감되었다. 골 중량은 신경절단 수술 후 현저한 감소가 초래된다고 알려져 있다(2)倔%河 본 실험의 결과 좌골신경을 절단한 쪽의 경골 중량 및 경골의 부위별 두께가 현저히 감소하여 이전의 보고들과 일치하였으며, 이러한 경골의 중량 및 두께의 감소가 파극천 추출물투여에 의해 용량 의존성으로 경감되었으므로, 파극천 추출물이 신경절단에 의한 불용성 골다공증에 유효한 예방효과를 나타낼 것으로 생각되나, 6주 후에도 완전히 정상 수치로 회복되지 않는 점으로 보아 좀 더 장기적인 투여 또는 다른 약물과의 병용이 요구될 것으로 생각된다.
이상에서 여러가지 방법으로 좌골신경 절단으로 유발된 ddy 마우스 골다공증 모델에 대한 파극천 추출물의 예방효과를 관찰하였던 바, 파극천 추출물이 어느 정도의 골다공증에 대한 예방효과를 가지고 있는 것으로 관찰되었으나, 비교적 장기간의 투여로 생각되는 6 주간의 투여 후에도 여전히 정상군에 비해 골다공증이 진행된 점으로 보아 좀더 장기간의 약물투여 또는 다른 치료 약물과의 병용투여가 필요할 것으로 생각되었고, 파극천 추출물에 대한 유효용량과 치유 기간을 설정하기 위한 연구가 진행되어야 할 것으로 생각되었다.
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