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제안 방법
- Nitrite 양의 측정 - Macrophage로부터 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2" 의 형태로서 측정하였다. 즉 세포배양 상등액 100 μg와 Griess 시 약 [1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid 와 0.
- IR spectrum은 Bomem MB-100 FT-IR spectrometer KBr disk법으로 측정하였으며, 질량 스펙트럼은 Finnigan Mat TSQ-700으로 70 eV의 에너지로 이온화하였다. '1H- 및 13C-NMR spectrum은 내부표준물질 tetram ethylsilane (TMS)를 첨가하여 Broker AM-300 spectrometer 로 측정하였다.
- ??-hexane-EtOAc( 1 : 1)로 정제하여 1.3 g의 methylpaeon이을 얻었으며 구조화인을 위한 각종 기기를 즉정하였다.
- 추출된 단백질은 8%의 SDS-polyarylamide gel 에 전기영동시킨 후 Nitro cellulose membrane)로 gel의 단백질을 blot 시켰다. 5% skim milk로 하루 밤 동안 blocking 한 후 1 : 500의 비율로 iNOS와 COX-2 antibody를 3시간 동안 상온에서 배양한 후 TTBS로 2회 15분 간격으로 세척하였다. 1 : 1000의 비율 희석한 rabbit와 goat secondary antibody를 1시간동안 상온에서 배양 시켰다.
- 기 기 및 시 약 - 융점은 Electrothermal digital melting point apparatus를 사용하여 측정하였으며 보정하지 않았다. 선광도 측정은 JASCO DIP-360 digital polarimeter^ 25°C 에서 측정 하였다.
- 냉각된 반을물을 식힌 다음 반량으로 농축하였으며 증류수와 EtOAc로 분배하였으며 EtOAc 가용부를 소량의 증류수로 2회 세 척 하였다 EtOAc 가용부를 농축시키고 silica gel cohjinri에서 ??-hexane-EtOAc( 1 : 1)로 정제하여 1.3 g의 methylpaeon이을 얻었으며 구조화인을 위한 각종 기기를 즉정하였다.
- 높은 수율로 얻어진 paeonol0] phenolic OH를 가지고 있음에 착안하여 이를 dimethylsulfkte로 메틸화하였다. 얻어진 화합물은 IR spectrum에서 수산기에 의한 피크가 나타나지 않았으며, !H-NMR spectrum에서 두개의 OCH3에 의 한 피크가 8h 3.
- 1 : 1000의 비율 희석한 rabbit와 goat secondary antibody를 1시간동안 상온에서 배양 시켰다. 다시 TTBS로 3회 15분 간격으로 씻어낸 후 chemilundnescence로 현상하였다.
- 또한 두 성분이 NO 및 PGE2와 같은 염증인자의 생성과 관련된 iNOS 및 COX-2의 단백질 유전자 발현을 억제하는지를 실험하였다. LPS에 의해 iNOS 단백질은 뚜렷하게 증가하였으며 paeonol과 methylpaeonol은 농도의존적으로 발현을 저해하였다(Fig.
- 형태로서 측정하였다. 즉 세포배양 상등액 100 μg와 Griess 시 약 [1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid 와 0.1% (w/v) naphtylethylenediamine-HCl] 100 μg를 혼합하여 96 well plates에서 10분동안 반응시킨 후 550nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출 및 분리 - 목단피 1000 g을 수증기증류장치에서 8시간씩 증류하였고 증류물을 동량의 diethyl ether로 3회 분획 추출하였으며 분획 물을 무수황산나트륨으로 탈수하였다 . 그 후 에테르 가용부를 40°C에서 증발시키고 잔류물을 수거하여 목단피 정유 16 g을 얻었다.
대상 데이터
- Life Technologie에서 구입하였다. 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tertazo-lium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO), sulfanilamide, aprotinin, leupeptin, phenylmethylsulfonylfluride, dithiothreitol, NG- mono-methyl-arginine (NMA), E. coli lipopolysaccaride (LPS)는 Sigma Chemical Co. (MO, U.S.A.)에서 구입하여사용하였고 COX-2와 iNOS monoclonal antibodies 및 peroxidase conjugated secondary antibody는 Santa Cruz Biotechnology (CA, U.S.A.)에서 구입하였다.
- RPMI 1640 medium, fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin은 Life Technologie에서 구입하였다. 3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tertazo-lium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO), sulfanilamide, aprotinin, leupeptin, phenylmethylsulfonylfluride, dithiothreitol, NG- mono-methyl-arginine (NMA), E.
- 식물재료 - 강원도 원주시 천일약업사에서 판매하는 목단피를 구입하여 상지대학교 자원식물학과 임상철 교수에 의뢰하여 동정한 후 사용하였다.
이론/모형
- 선광도 측정은 JASCO DIP-360 digital polarimeter^ 25°C 에서 측정 하였다. IR spectrum은 Bomem MB-100 FT-IR spectrometer KBr disk법으로 측정하였으며, 질량 스펙트럼은 Finnigan Mat TSQ-700으로 70 eV의 에너지로 이온화하였다. '1H- 및 13C-NMR spectrum은 내부표준물질 tetram ethylsilane (TMS)를 첨가하여 Broker AM-300 spectrometer 로 측정하였다.
- 저자는 목단피의 paeonol0] in vitro 힝염효과를 macrophage RAW 264.7 cell이 생성하는 NO 생성에 대한 효과를 nitrite assay로, inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2 에 대한 활성을 western blotting으로 측정 하였다. 한편 paeonol0] 2-hydroxy・5-methoxyacetophenone의 구조를 가짐 에 따라 수산기를 메틸화하여 기능기를 차단한 화합물인 2,5-dimethoxyacetophenone (methylpaeonol)^ 제조하여 그 활성을 비교하였을 때 지견을 얻었으므로 보고한다.
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