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문제 정의
- 그러므로, 한약재 중 비교적 수분함량이 높은 생지황를 연구대상으로 하였다. 따라서, 본 연구는 한약재의 가공, 저장 및 유통을 위한 안전한 衞生化 기술로 감마선 照射技術의 적용 가능성을 검토하기 위해 감마선 照射 생지황 한약재의 지표물질인 catap1)에 감마선 照射를 각 흡수 선량별로 실시하여 이들 지표물질의 변화정도를 관찰하고자 한다.
- 그러므로, 생지황 한약재의 catapol성분 안전성을 HPLC 로 변화를 확인하고, 이에 따른 유전독성학적 안전성을 평가하고자 Salmonella typhimurium을 이용한 복귀돌연변이 시험과 배양된 Chinese hamster lung fibroblast (CHL) 세포를 이용한 소핵유발 시험을 실시하여 유의성을 확인하기 위해 본 연구를 진행하였고, 생약재의 위생화를 위한 감마선 조사기술의 이용가능성을 검토하고, 유효성분의 변화를 확인하고, 유전독성학적 안전성을 평가하고자, 1차적으로 Salmonella typhimurium을 이용한 복귀돌연변이시험을 실시하였다.
- 본 연구는 한약재의 가공, 저장 및 유통을 위한 안전한 衞生化 기술로 감마선 照射技術의 적용 가능성을 검토하였다. 생약재는 보관, 보존의 관리 소홀로 세균, 해충의 번식이 용이한 점에 대한 위생화, 원료의 안전공급, 효율적 제조공정 등에 이용되어온 기존 위생화 방법인 화학약품(훈증제 등)처리 방법의 여러가지 문제점이 제기되고 있다.
제안 방법
- 감마선 照射 - 표준품과 시료의 감마선 조사는 한국 원자력연구소의 연구실에서 감마선 조사시설(선원 : Co-60 10만 Ci)을 이용하여 , 실온에서 시간당 10 kGy의 선량율로 5, 10, 15, 20 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 하였다. 흡수선량을 확인하기 위해 free radical dosimeter와 ceric cerous dosimeter를 이용한 결과, 총 흡수선량의 오차는 ±0.
- 현탁액을 메스플라스크에 옮긴 다음, 메탄올을 넣어 약 100 m/가 되었을 때 때때로 흔들면서 1시간 30분 동안 초음파 진탕 추출한 다음 전량을 100 m/로 하고, 그 액 1ml에 물을 넣어 정확히 10ml로 흐}여 검액으로 하였다. 또 검액을 여지로 여과한 다음 HryLC로 시험하였다.
- 나타내었다. HPLC UV/VIS-DetectorS 사용하여 PDA 방법으로 각 표준물질의 200-500 nm 파장 범위에서 吸光度를 분석하여 최대 흡수 파장을 측정하였다. 이후 확립된 분석조건에 따라 표준물질들에 대한 농도별 표준곡선을 작성하였고, 표준물질 용액과 각 시료에 대한 감마선 照射시 농도의 변화를 관찰하였다.
- HPLC UV/VIS-DetectorS 사용하여 PDA 방법으로 각 표준물질의 200-500 nm 파장 범위에서 吸光度를 분석하여 최대 흡수 파장을 측정하였다. 이후 확립된 분석조건에 따라 표준물질들에 대한 농도별 표준곡선을 작성하였고, 표준물질 용액과 각 시료에 대한 감마선 照射시 농도의 변화를 관찰하였다.
- Catapol 표준액에 γ-線 照射전후 변화량 - catapol 표준 액 일정량을 취하여 감마선 조사(0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5 15, 20, 30 kGy)를 실시하여 검량선을 작성하였으며, 표준액에서의 조사전후의 catapol의 변화량을 확인하였으며, 生地黃 에 감마선 조사(0, 5, 10, 15, 20 kGy)전후의 catapol의 변화량을 확인하였다.
- 추출 시료를 이용하여 HPLC 기기조건에서 시판 catapol 표준품과의 peak 일치 여부를 확인하였다.
- catap이 표준액 및 생지황의 γ-線 照射전후 변화 - catapol 표준액을 각 흡수선량 단계별로 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 20, 30 kGy로 감마선 조사를 실시하여 표준액에서의 감마선 조사에 의한 변화에 따른 검량선을 작성하였다(Fig. 4). HPLC UV/VIS-Detector> 사용하여 PDA 방법으로 표준물질의 210nm 파장 범위에서 최대 흡수 파장에서 분석하였다(Fig.
- 4). HPLC UV/VIS-Detector> 사용하여 PDA 방법으로 표준물질의 210nm 파장 범위에서 최대 흡수 파장에서 분석하였다(Fig. 3). 시험 결과 표준액에서 감마선 照射전후 catapol 변화는 각 단계별 감마선 조사량에 따라 점차적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Table III).
- 생지황의 catapol성분 안정성 검증 - 방사선 조사 생지황의 유효성분 안정성을 검증하기 위해 생지황에 많이 함유된 catapol성분을 추출하였다. HPLC 기기의 columne capcellpak MG C18 (1.
- 독성학적 안전성 평가 - 1) Salmonella typhimurium을 이용한 복귀돌연변이 시험 30 kGy로 감마선 照射된 생지황 열수 추출물의 세균에 있어서의 돌연변이 유발여부를 검색하기 위하叫 S. typhimwinm의 histidine 요구성 균주 TA98, TA100, TA1535 및 TA1537를 이용하여 복귀돌연변이 시험을 실시하였다.
- 확인하였다. 따라서 본 실험에서는 의약품 등의 독성 시험 기준(식품의약품안전청 고시 제 1999-61호, 1999 년 12월 22일)에 의하여 최고농도를 5mg/plate로 하여, 대사활성계 미적용(-S) 및 적용(+S) 하에 공비를 2로 한 5단계 농도군으로 시험하였다. 시험결과 복귀변이 집락수의 평균과 표준편차로 나타내었고, 복귀변이 집락수가 음성대조군의 2배 이상이면서 용량의존성을 갖는 경우를 양성으로 판정하였다.
- 30 kGy에서 감마선 照射된 생지황 열수추출물의 유전독성을 평가하고자 수컷 마우스(ICR) 골수세포를 이용한 소핵시험을 실시하였다. 투여 용량은 용해 한계 상한선을 최고 용량으로 하였다.
- 약 7주령의 수컷 마우스에 시험물질을 0, 500, 1000, 2000 ㎎/㎏의 용량을 단회 경구 투여하고, 투여 후 약 24시간에 골수세포를 수거하여 소핵 유발과 세포독성을 평가하였다.
대상 데이터
- 절단 한약재의 경우 완전 건조가 이루어지지 않아 수분함량이 높고, 특히 온도가 높아지면 자체 발열로 효소작용이 왕성해져 변질의 우려가 있다. 그러므로, 한약재 중 비교적 수분함량이 높은 생지황를 연구대상으로 하였다. 따라서, 본 연구는 한약재의 가공, 저장 및 유통을 위한 안전한 衞生化 기술로 감마선 照射技術의 적용 가능성을 검토하기 위해 감마선 照射 생지황 한약재의 지표물질인 catap1)에 감마선 照射를 각 흡수 선량별로 실시하여 이들 지표물질의 변화정도를 관찰하고자 한다.
- 실험재료 - 실험에 사용한 지황류는 경상북도 의성에서 재배한 생지황를 직접 구입하여 식품의약품안전청 생약평가부에서 감정한 것을 본 실험에 사용하였다.
- 시약 및 기기 - 실험에 사용한 시약은 일급 또는 특급으로써 catapole 和光純藥工業株式會社(wako, Japan)에서 제조된 것을 구입하였으며, acetontrile과 MeOH, EtOHe Merck tt(GERMANY) 제조한 HPLC용을 사용하였으며, Ames test 시험에 사용한 제품은 oriental yeast (Japan), oxiod nutrient broth, 소핵시험에 사용■한 시약은 GIBCO BRL(USA)제품을 사용하였다.
- 에서 구입하였다. 시험에 사용한 S. typhimurium TA98, TA100은 한국화학연구원에서 분양받았으며 histidine 요구성, deep rough (冼)특성, UV에 대한 민감도 (uvrB 돌연변이), R-fhctor에 의한 ampicillin 또는 teracycline 내성 등의 유전형질을 확인한 후 시험에 사용하였다.
- (2)소핵세포 시험 - 시험에 사용된 Chinese hamster lung fibroblast (CHL) 세포는 염색체가 25개이며, 세포주기는 15 시간으로서 염색체이상 시험에 적합한 조건을 갖춘 세포로서 국립독성연구원에서 분양 받았다. 배지는 io% fetal bovine serum, 100 U/m/ penicilin, 100streptomyocin, 5 x 10-5 M 2-mercaptoehtanol 및 20 mM HEPES buffer를 첨가시킨 Eagle's minimal essential medium을 사용하였으며 모두 GIBCO BRL, Inc.
- 국립독성연구원에서 분양 받았다. 배지는 io% fetal bovine serum, 100 U/m/ penicilin, 100streptomyocin, 5 x 10-5 M 2-mercaptoehtanol 및 20 mM HEPES buffer를 첨가시킨 Eagle's minimal essential medium을 사용하였으며 모두 GIBCO BRL, Inc. (USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 따라서 본 실험에서는 의약품 등의 독성 시험 기준(식품의약품안전청 고시 제 1999-61호, 1999 년 12월 22일)에 의하여 최고농도를 5mg/plate로 하여, 대사활성계 미적용(-S) 및 적용(+S) 하에 공비를 2로 한 5단계 농도군으로 시험하였다. 시험결과 복귀변이 집락수의 평균과 표준편차로 나타내었고, 복귀변이 집락수가 음성대조군의 2배 이상이면서 용량의존성을 갖는 경우를 양성으로 판정하였다.
성능/효과
- 20 kGy의 총 흡수선량을 얻도록 하였다. 흡수선량을 확인하기 위해 free radical dosimeter와 ceric cerous dosimeter를 이용한 결과, 총 흡수선량의 오차는 ±0.2 kGy이었다.
- 3). 시험 결과 표준액에서 감마선 照射전후 catapol 변화는 각 단계별 감마선 조사량에 따라 점차적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Table III). 생약재 생지황에서 catapol 함량 변화는 γ-線 照射전후 각 단계별(0, 5, 10, 15, 20 kGy) 변화를 확인하였으며, 동결과는 표준품과 같이 감마선 조사량에 따라 점차적으로 감소하는 것을 확인하였다(Table Ⅲ, Fig.
- 시험 결과 표준액에서 감마선 照射전후 catapol 변화는 각 단계별 감마선 조사량에 따라 점차적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Table III). 생약재 생지황에서 catapol 함량 변화는 γ-線 照射전후 각 단계별(0, 5, 10, 15, 20 kGy) 변화를 확인하였으며, 동결과는 표준품과 같이 감마선 조사량에 따라 점차적으로 감소하는 것을 확인하였다(Table Ⅲ, Fig. 5, 6).
- 생지황의. 감마선 照射(5, 10, 15, 20 kGy)군과 비조사(0 kGy)군의 유효성분 정량결과(Table Ⅲ), 감마선 照射 생지황에서 catalpol의 함량이 5 kGy에서 비조사군보다 50% 이상 감소하였고, 10 kGy, 15 kGy, 20 kGy에서는 조금씩 각 단계별로 감소하였다. 표준품의 chromatogram pattern 은 비조사군과 조사군에서 미세하게 감소 변화하였다(Table II).
- 생지황에서 감마선 비조사군과 5 kGy 照射後 catapol 성분량이 50% 이상 급격하게 감소되었으며(Table III) 최초 照射후 성분량이 급격하게 감소된 요인은 여러 가지의 이화학적인 요인으로 볼 수 있으나 특히 수분의 감소로 인하여 여러 성분들 상호변이에 의하여 발생한 것으로 사료되고, 10 kGy이상에서는 미세하게 감소됨을 알 수 있었다.
- 대상시료가 균주생장 억제를 거의 나타내지 않음을 예비실험에서 확인하였다. 따라서 본 실험에서는 의약품 등의 독성 시험 기준(식품의약품안전청 고시 제 1999-61호, 1999 년 12월 22일)에 의하여 최고농도를 5mg/plate로 하여, 대사활성계 미적용(-S) 및 적용(+S) 하에 공비를 2로 한 5단계 농도군으로 시험하였다.
- 시험 결과 음성대조군의 복귀변이 집락수는 문헌치4) 범위 이내였고, 양성대조 화합물에 의해 복귀변이 집락 수가 현저히 증가하여 본 시험이 적절히 행하여졌음을 알 수 있다. 시험물질을 처리한 균주의 모든 농도군에서는 집락 수의증가 경향은 나타나지 않아, 본 시험 조건하에 사용한 균주들에 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 사료된다.
- 음성대조군의 경우 2,000개의 binucleated cells 중에 형성된 소핵은 22.0±5.7개로 문헌치의 수준6)이었고, 양성대조화합물에 의해 소핵 수가 현저히 증가하여 본 실험이 적합하게 행하여졌음을 알 수 있었다. 대사 활성화시키지 않은 경우와 시킨 경우 모두에서 감마선 照射 지황추출물에 의한 소핵수의 증가를 인정할 수 없었으며 각 용량 단계에서 모두 3%이하의 소핵빈도를 보여 음성으로 판정되었다.
- 7개로 문헌치의 수준6)이었고, 양성대조화합물에 의해 소핵 수가 현저히 증가하여 본 실험이 적합하게 행하여졌음을 알 수 있었다. 대사 활성화시키지 않은 경우와 시킨 경우 모두에서 감마선 照射 지황추출물에 의한 소핵수의 증가를 인정할 수 없었으며 각 용량 단계에서 모두 3%이하의 소핵빈도를 보여 음성으로 판정되었다.
- 개체당 2,000개의 다염성적혈구(Polychromatic Erythrocyte, PCE) 중에 나티나는 소핵을 가진 다염성적혈구(Micronucleated Polychromatic Eiythrocyte, MNPCE)의 수를 계수한 결과 시험물질을 투여한 모든 투여군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 증가는 나타나지 않았으며, 총적혈구 중다염성적혈구 비율에서도 시험물질을 투여한 모든 투여군에서 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의성은 없었다.
- 등, 5)조7)의 실험결과와 일치하고 있다. 이와 같은 결과를 토대로 생지황의 유효성분이 10 kGy의 감마선 조사에서는 파괴되지 않고 안전하게 유지되며, 또한 유전 독성학적실험에서 감마선 照射 생지황이 직접변이원이나 간접 변이원으로서 작용하지 않음을 알 수 있었다. 이는 감마선 照射에 의하여 유해물질 생성 가능성이 없음을 간접적으로 확인할 수 있는 결과라고 사료된다.
- 이상의 결과로 보아 한약재 생지황을 감마선으로 照射한 후에도 생지황내 유효성분이 그대로 보전되는 것으로 사료되며, 이러한 결과에서 생지황은 20 kGy까지 감마선 照射 에도 유효성분의 변화가 거의 없는 것을 인정할 수 있었다. 또한 감마선 照射 생지황 추출물의 독성 학적 안전성에 대하여 앞으로 생체내 유전독성시험, 만성독성 및 생식독성시험 등의 연구가 진행되어야 할 것으로 생각한다.
후속연구
- 이는 감마선 照射에 의하여 유해물질 생성 가능성이 없음을 간접적으로 확인할 수 있는 결과라고 사료된다. 한편, 앞으로 독성 학적인 평가는 만성독성실험 및 생식독성실험 등의 지표가 다른 여러 가지 시험에서 얻은 결과로부터 종합적으로 판정되어야 할 것으로 생각된다.
- 있었다. 또한 감마선 照射 생지황 추출물의 독성 학적 안전성에 대하여 앞으로 생체내 유전독성시험, 만성독성 및 생식독성시험 등의 연구가 진행되어야 할 것으로 생각한다.
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