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문제 정의
- 본 연구는 농진청 Biogreen 21사업의 특용작물사업단의 일부 연구지원금에 의해서 수행되었으며 이에 대해 심심한 감사를 표하는 바이다.
- 인삼의 경우에 생육 기간이 길어 포장에서 염류내성 인삼계통을 선발하기 위해서는 장시간이 요구되기 때문에 염류내성을 나타내는 유용 유전자를 인위적으로 도입하는 방법으로 염류내성을 나타내는 신품종의 육성법은 효율적으로 단기간에 대량으로 유묘를 생산할 수 있는 이점도 있다. 본 연구에서는 애기장대풀 (Arabidopsis)에서 Li*의 독성을 완화 (Quintero et al., 1996}시키는 역할을 하여 염류 내성 유전자로 분리된 SAL] (U40433, 3, (2, , 5, -bis- phosphate nucleotidase) 유전자를 인삼에 도입하여 염류 내성을 나타내는 인삼의 분자육종을 할 목적으로 수행되었으며, 그 결과를 보고하고자 한다.
- 이처럼 식물의 염류피해는 다양하게 나타나는데 인삼의 경우에는 수확량의 감소와 인삼의 품질 저하의 주된 원인이 되고 있다. 본 연구에서는 인삼의 염류 내성을 증진시킬 목적으로 Arabidopsis 유래의 염류내성 유전자인 을 인삼에 성공적으로 도입하였으며 현재 선발된 형질전환 인삼 유식물체의 토양적응실험을 하고 진행하고 있다. 성공적으로 이들 유식물체로 부터 뿌리가 정상적으로 생장이 되어 인삼형태의 주근으로 발달할 것인지, 또한 지상부가 없어지고 이듬해에 다시 새로운 잠아가 형성되어 지상부의 생장 여부와 3~4년 생장 후 정상적인 종자의 결실여부와 F1 에서의 SAL1 gene에 의한 염류내성 형질의 획득 가능여부는 금후 지속적으로 검토를 하여야 할 것으로 생각된다.
제안 방법
- Arabidopsis 분리한 SAL1 gene에 의하여 인삼을 형질전환 시키기 위해서 수확직후 인삼 종자를 모래에 약 3개월간 층적처리하여 개갑시킨 후 다시 4℃의 냉장고에 옮겨 저온 처리하여 휴면을 타파시켰다. 인삼접합자배의 장축이 약 6 mm 이상으로 충분히 성숙하였을 때 형질전환을 위한 배양재료로 사용하였다.
- Arabidopsis 에서 cloning 한 SAL1 (3'(2‘), 5'-bisphosphate nucleotidase) 유전자를 인삼에 도입하고자 형질전환용 vectoi에재조합하였다. 인삼 발현용 promoter는 35S-35S-AMV promoter!- 사용하고 terminatore Tnos를 사용하였다 (Fig.
- 우선 식물발현용 promoter (35S-35S-AMV promoter)가 함유된카셋트 백타 524Xba에 도입하기 위해서 제한효소 site Ncol 위치를 primer제작에 의해서 mutation시켰다. Primer는 sense 로 당초 5, -GATnACAATGGACGTTCGC-3, 이 것을 5'- GATTIACCATGGACGTT-CGW으로 변이시켜 사용하였다. 합성된 primer로 증폭된 SAL1 gene의 ORF영역은 식물발현용 백 타 (524Xbal)에서 재조합되어 확인되었으며, E.
- SAL1 gene를 함유하고 있는 Agmbacterium tumefaciens MP90/Sall을 이용하여 인삼자엽으로부터 형질전환을 유도하였다. 인삼자엽을 식물호르몬을 첨가하지 않은 배지에서 체세포 배를 발생시킨 대조구에서는 약 90% 배양 재료에서 체세포 배가 발생되었으며 주로 자엽의 기부에서 형성되었으나(Fig.
- 5 mg/l kinetin의 식물호르몬을 첨가한 배지에 옮겨준 경우에는 74% 의 형질전환율을 보였다. 발생한 체세포배는 초기에 250 mg/C 의 cefotaxime이 첨가된 MS배지에서 3주간 배양한 후 100 mg/ I kanamycin과 250 mg/l cefotaxime이 첨가된 MS 배지에 계대배양하여 선발하였다. 자엽단계로 발달한 체세포 배들은 발아시키기 위해서 50 mg/1 kanamycin과 10 mg/C 지베렐린이 첨가된 MS 배지로 옮겨 선발하였다.
- 식물형질전환용 binary vectoi인 pRD400에 다시 재조합하기 위해서 상기 식물발현용 vector에 재조합된 SAL1 gene를 Xba I으로 절단하여 pRD400 (Fig. 2A)에 ligation하여 E. coli에형질전환시킨 후 X-gal 및 IPTG가 함유된 선택배지에서 white colony를 선발하였다. 형성된 colony를 다시 50gg// kanamycin이 함유된 배지에서 배양후 다시 plasmid를 추출하여 Xba I으로 절단하여 SAL1 gene를 확인하였다 (Fig.
- 전배양 후 선발 배지로서 MS기본 배지에 250 mg/ l cefatoxime과 100 mg/l kanamycin을 첨가한 고체 배지에 인삼자엽을 옮겼다. 약 14일 간격으로 계대배양한 후에 인삼 자엽으로부터 형질전환된 체세포배의 발생률을 조사하였다 . 형질전환되었다고 추정되는 체세포배의 자엽일부 또는 초기생장 시 정상적인 식물체로 전환되지 않을 것 같은 체세포배는다시 이로부터 이차배를 유도하였다.
- 염류내성 유전자로 알려진 Arabidopsis에서 분리한 SALJ (3'(2'), 5'-bis-phosphate nucleotidase) 유전자를 인삼에 도입하기 위해서 식물형질전환용 binary vectoi에 재조합하였다. 우선 식물발현용 promoter (35S-35S-AMV promoter)가 함유된카셋트 백타 524Xba에 도입하기 위해서 제한효소 site Ncol 위치를 primer제작에 의해서 mutation시켰다.
- 우선 식물발현용 promoter (35S-35S-AMV promoter)가 함유된카셋트 백타 524Xba에 도입하기 위해서 제한효소 site Ncol 위치를 primer제작에 의해서 mutation시켰다. Primer는 sense 로 당초 5, -GATnACAATGGACGTTCGC-3, 이 것을 5'- GATTIACCATGGACGTT-CGW으로 변이시켜 사용하였다.
- 유전자 도입여부를 확인하기 위해서 재분화된 인삼 유스] 물체로부터 DNA를 추출한 후에 일차적으로 NPT II 유전자의 존재 여부를 확인하기 위해서 PCR을 수행하였다. PCR을 위한 DNA추출방법은 Dellaporta 등 (1993)의 방법에 준하여 수행하였으며 PCR조건은 96℃에서 2분간 predenaturation 한 후, 94℃에서 3Q초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분으로 하여 36 cycle을 반응시켰으며, 이어서 72℃에서 15분간 post-extension 시킨 후 0.
- 인삼에 염류내성을 증진시키기 위해서 Arabidopsis6^-^ 분리 한 SAL1 (3'(2'), 5'-bis-phosphate nucleotidase) 유전자를 Agrobacterium tumefaciense: 이용하여 인삼자엽으로부터 형질전환체를 유도하였다. Agmbacterium과 공동배양 후 식물호르몬 무첨가 선발배지 (kanamycin 100 mg/l )에 치상한 결과 10% 미만의 자엽에서 형질전환 인삼체세포배가 발생되었으나, Agmbacterium과 공동배양 후 1.
- 최종적으로 재조합된 binary vector는 선발마커인 kanamycin내성유전자 (NPT U) 와염류내성을 나타내는 SAL1 gene를 함유하고 있는 유전자로 구성되었다. 인삼에 유전자를 도입하기 위해서 disarmed Ti- vector를 가지고 있는 Agmbacterium tumefaciens MP 90을 사용하였으며, tri-parental mating 방법에 의하여 형질전환 벡터를 도입하고 AB배지 및 kanamycin함유 배지에서 conjugant 인 Agmbacterium tumefaciens MP90/Sall을 선발하여 인삼의 형질전환에 이용하였다.
- 인삼접합자배의 장축이 약 6 mm 이상으로 충분히 성숙하였을 때 형질전환을 위한 배양재료로 사용하였다. 인삼종자를 약 70% 에탄올에 약 1분간 침지시킨 다음 2% 차아염소산 나트륨으로 약 30분간 멸균시킨 후 멸균된 증류수로 3회 수세하였다. 형질전환할 배양 재료는 인삼 접합자 배의 자엽을 사용하였고 체세포배의 유도를 위해서 식물호르몬을 첨가하지 않은 MS (Murashige & Skoog, 1962) 배지에 5% sucrose를 첨가한 고체 배지를 사용하였다.
- Primer는 sense 로 당초 5, -GATnACAATGGACGTTCGC-3, 이 것을 5'- GATTIACCATGGACGTT-CGW으로 변이시켜 사용하였다. 합성된 primer로 증폭된 SAL1 gene의 ORF영역은 식물발현용 백 타 (524Xbal)에서 재조합되어 확인되었으며, E. coli에 도입하여 증식하였다. Primer mutation에 의해서 유도된 SAL1 gene을 PCR로 주줄하여 가장 적게 나온 PCR product# 다시 templates.
- coli에형질전환시킨 후 X-gal 및 IPTG가 함유된 선택배지에서 white colony를 선발하였다. 형성된 colony를 다시 50gg// kanamycin이 함유된 배지에서 배양후 다시 plasmid를 추출하여 Xba I으로 절단하여 SAL1 gene를 확인하였다 (Fig. 2B). 약 11 kb 의 pRD400 binary vector 와 SAL1 gene 과 promoter 및 terminator가 도입된 약 2 kb 밴드를 확인할 수 있었다 (Fig.
- 형질전환할 배양 재료는 인삼 접합자 배의 자엽을 사용하였고 체세포배의 유도를 위해서 식물호르몬을 첨가하지 않은 MS (Murashige & Skoog, 1962) 배지에 5% sucrose를 첨가한 고체 배지를 사용하였다. 형질 전환을 위해서는 유전자를 함유하고 있는 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens MP90/Sall)을 인삼 자엽과 MS 액체배지에서 24시간 공동 배양한 다음 인삼 자엽을 멸균된 필터 페이퍼에 올려놓아 잔여 배지를 제거한 후 생장조절제가첨가되지 않고 5% 설탕이 첨가된 MS기본배지에 3일간 전 배양하였다. 전배양 후 선발 배지로서 MS기본 배지에 250 mg/ l cefatoxime과 100 mg/l kanamycin을 첨가한 고체 배지에 인삼자엽을 옮겼다.
- 인삼종자를 약 70% 에탄올에 약 1분간 침지시킨 다음 2% 차아염소산 나트륨으로 약 30분간 멸균시킨 후 멸균된 증류수로 3회 수세하였다. 형질전환할 배양 재료는 인삼 접합자 배의 자엽을 사용하였고 체세포배의 유도를 위해서 식물호르몬을 첨가하지 않은 MS (Murashige & Skoog, 1962) 배지에 5% sucrose를 첨가한 고체 배지를 사용하였다. 형질 전환을 위해서는 유전자를 함유하고 있는 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens MP90/Sall)을 인삼 자엽과 MS 액체배지에서 24시간 공동 배양한 다음 인삼 자엽을 멸균된 필터 페이퍼에 올려놓아 잔여 배지를 제거한 후 생장조절제가첨가되지 않고 5% 설탕이 첨가된 MS기본배지에 3일간 전 배양하였다.
대상 데이터
- 2). SAL1 gene의 식물형질전환용 binary vector는 상기 cassette vector가 조립이 매우 양호하며 border sequence를 가지고 있는 pRD400 binary vector를 사용하였다. 최종적으로 재조합된 binary vector는 선발마커인 kanamycin내성유전자 (NPT U) 와염류내성을 나타내는 SAL1 gene를 함유하고 있는 유전자로 구성되었다.
- 휴면을 타파시켰다. 인삼접합자배의 장축이 약 6 mm 이상으로 충분히 성숙하였을 때 형질전환을 위한 배양재료로 사용하였다. 인삼종자를 약 70% 에탄올에 약 1분간 침지시킨 다음 2% 차아염소산 나트륨으로 약 30분간 멸균시킨 후 멸균된 증류수로 3회 수세하였다.
- 발생한 체세포배는 초기에 250 mg/C 의 cefotaxime이 첨가된 MS배지에서 3주간 배양한 후 100 mg/ I kanamycin과 250 mg/l cefotaxime이 첨가된 MS 배지에 계대배양하여 선발하였다. 자엽단계로 발달한 체세포 배들은 발아시키기 위해서 50 mg/1 kanamycin과 10 mg/C 지베렐린이 첨가된 MS 배지로 옮겨 선발하였다. Kanamycin 첨가배지에서 선발된 체세포배들은 특이 프라이머로 PCR 증폭을 통하여 최종적으로 형질전환체를 확인하였으며, 줄기와 뿌리가 잘 발달된 형질전환체들은 성공적으로 토양에 순화시켰다.
이론/모형
- 2B). Ligation이 확인된 binary vector를 disarmed Ti- plasmid를 함유한 Agmbacterium tumefaciens MP90에 도입하기 위해서 tri-parental mating 방법에 의해서 Agmbacterium tumefaciens MP90에 SAL1 gene를 함유한 binary vector를 도입하여 인삼 형질전환에 이용하였다.
- 확인하기 위해서 PCR을 수행하였다. PCR을 위한 DNA추출방법은 Dellaporta 등 (1993)의 방법에 준하여 수행하였으며 PCR조건은 96℃에서 2분간 predenaturation 한 후, 94℃에서 3Q초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분으로 하여 36 cycle을 반응시켰으며, 이어서 72℃에서 15분간 post-extension 시킨 후 0.7% agarose gel로 전기영동하여 확인하였다. 이때 사용한 primer는 5'-GTGGAGAGGCIATTCGGClA-3'와 5'- CCACCA TGATATTCGGCAAG-3, 을 사용하였다.
성능/효과
- 유도하였다. Agmbacterium과 공동배양 후 식물호르몬 무첨가 선발배지 (kanamycin 100 mg/l )에 치상한 결과 10% 미만의 자엽에서 형질전환 인삼체세포배가 발생되었으나, Agmbacterium과 공동배양 후 1.0 mg/l 2.4-D와 0.5 mg/l kinetin의 식물호르몬을 첨가한 배지에 옮겨준 경우에는 74% 의 형질전환율을 보였다. 발생한 체세포배는 초기에 250 mg/C 의 cefotaxime이 첨가된 MS배지에서 3주간 배양한 후 100 mg/ I kanamycin과 250 mg/l cefotaxime이 첨가된 MS 배지에 계대배양하여 선발하였다.
- 자엽단계로 발달한 체세포 배들은 발아시키기 위해서 50 mg/1 kanamycin과 10 mg/C 지베렐린이 첨가된 MS 배지로 옮겨 선발하였다. Kanamycin 첨가배지에서 선발된 체세포배들은 특이 프라이머로 PCR 증폭을 통하여 최종적으로 형질전환체를 확인하였으며, 줄기와 뿌리가 잘 발달된 형질전환체들은 성공적으로 토양에 순화시켰다.
- 4B). 그러나 식물호르몬 무첨가 선발배지에서 유도된 체세포 배는 비록 형질전환 빈도는 낮았지만 정상적인 shoot를 형성하였으며 (Fig. 4C), 형성된 일부 형질전환 식물체의 일부분을취호) 여 SAL1 유전자의 존재 유무를 확인한 결과 SAL1 유전자가 들어 있음을 확인할 수 있었다 (Fig. 5 lane 8~9).
- 2B). 약 11 kb 의 pRD400 binary vector 와 SAL1 gene 과 promoter 및 terminator가 도입된 약 2 kb 밴드를 확인할 수 있었다 (Fig. 2B). Ligation이 확인된 binary vector를 disarmed Ti- plasmid를 함유한 Agmbacterium tumefaciens MP90에 도입하기 위해서 tri-parental mating 방법에 의해서 Agmbacterium tumefaciens MP90에 SAL1 gene를 함유한 binary vector를 도입하여 인삼 형질전환에 이용하였다.
- 인삼자엽을 식물호르몬을 첨가하지 않은 배지에서 체세포 배를 발생시킨 대조구에서는 약 90% 배양 재료에서 체세포 배가 발생되었으며 주로 자엽의 기부에서 형성되었으나(Fig. 3A), Agmbacterium과 공동배양 후 식물호르몬 무첨가 선발 배지 (kanamycin 100 mgU )에서는 형성빈도가 매우 감소되어다만 10% 미만의 자엽에서 형질전환 인삼체세포배가 발생되었다 (Fig. 3B). 그러나 Agrobacterium과 공동배양 후 L0 mg/« 2.
후속연구
- 본 연구에서는 인삼의 염류 내성을 증진시킬 목적으로 Arabidopsis 유래의 염류내성 유전자인 을 인삼에 성공적으로 도입하였으며 현재 선발된 형질전환 인삼 유식물체의 토양적응실험을 하고 진행하고 있다. 성공적으로 이들 유식물체로 부터 뿌리가 정상적으로 생장이 되어 인삼형태의 주근으로 발달할 것인지, 또한 지상부가 없어지고 이듬해에 다시 새로운 잠아가 형성되어 지상부의 생장 여부와 3~4년 생장 후 정상적인 종자의 결실여부와 F1 에서의 SAL1 gene에 의한 염류내성 형질의 획득 가능여부는 금후 지속적으로 검토를 하여야 할 것으로 생각된다.
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