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문제 정의
- 따라서 약물의 지용성과 투과계수를 함께 고려하여 교반에 미치는 영향을 알아보았다. 투과계수(<2x10-5 ㎝/sec) 가 작은 약물들은 교반에 의해 약물의 Pgp가 영향을 받지 않았으며 투과계수와 지용성간에 상관성을 보이지 않았다.
- 본 연구에서는 선행된 연구를 바탕으로 Caco-2 세포 단층 막 투과 실험시 교반 장치로 널리 쓰이고 있는 plate shaker (shaking water bath)를 이용하여 교반을 하는 경우에도 이러한 현상이 나타나는지를 확인하고자 하였다. 교반에 의하여 겉보기 투과계수 (Papp)가 다르게 나타나는지를 알아보기 위하여 비교적 넓은 범위의 지용성과 투과력을 갖는 12개의 약물 (Table I)을 선택하여 투과 실험 시 교반을 한 경우와 교반을 하지 않은 경우의 Papp값을 비교하였다.
- 이상의 결과를 종합하여 교반, 즉 비교반수층의 효과를 결정짓는 인자가 무엇인지 조사하여 보았다. 교반에 의한 Papp의 차는 약물의 지용성 (Figure 4A), 비교반시의 투과력 (Figure 4B), 약물의 분자량 (Figure 4C)과는 유의적인 상관성이 없었다.
- 그러나 투과가 잘 되는 약물 중에서도 교반에 의해. 투과계수가 차이를 보이는 경우와 보이지 않는 경우가 있었는데 어떠한 요인에 의한 것인지를 고찰해 보았다.
제안 방법
- 1 mg/mL streptomycin# 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's medium을 사용하였다. 37"C에서 5% CO와 95% humidity 조건을 항상 유지하도록 하여 75 ㎝2 T-flask에서 배양하였으며 80 —90%의 confluencyofl 도달하면 0.02% EDTA와 0.05%의 trypsin을 사용하여 1:3 의 비율로 subculture를 하였다. Passage number/} 46-58인 Caco-2 cell 을 12-transwell 의 polycarbonate membrane 에 1.
- 4의 buffer를 사용하였다. Cell mono- layer를 transport media로 세번 washing한 후 37℃에서 30 분간 pre・incubatioii하고 TEER value를 측정하였다 (300- 600 Q , ㎝2). Transport media를 aspiration하여 제거한 후약 물 용액 0.
- Plate shaker를 이용하여 60 rpm으로 교반하면서 transport실험을 하였을 때 (shaking)와 교반을 하지 않고 transport 실험을 하였을 때 (control), 각각의 실험에서 시간에 따라 투과된 약물의 누적량을 plot하였다. 그 기울기로부터 각 약물의 Caco-2 세포 단층막 투과 속도 (dQ/dt, flux)를 비교하여 보았다.
- 4 mm)은 Coming Costar (NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. TEER 값은 EVOM™ epithelial voltohmmeter (World Precision Instrument, USA)를 사용하여 측정하였다. 투과 실험시 온도와 습도를 유지하며 교반을 하기 위해 shaking water bath (HB-205SW, Han Baek Sci.
- Loxoprofene 대화제약 (Seoul, Korea)으로부터, ranitidinee YH439는 유한양행 (Seoul, Korea)로부터 각각 지원을 받아 사용하였다. [3H]TBuMA (0.2 Ci/mmol)는 과량의 tributyl amine (Aldrich Chemical Co., Milwakee, WI, USA) 과 [3H]methyl iodide(85 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL, USA)의 첨가반응으로 합성하였다. 합성한 TB긴MA는 NMR, Mass 및 TLC로 순도와 specific activity 를 확인하였다.
- 각 약물에 대하여 두 가지 다른 교반 조건으로 Caco-2 cell monolayei에서의 투과실험을 실시하였다. 한 군은 교반을 하지 않고 (Orpm) 투과 실험을 실시하였고 다른 한 군은 plate 아iakei를 사용하여 60 rpm (apical side의 약물용은 #이 넘치지 않는 최고 rpm)으로 교반을 하여 실험하였다.
- 현상이 나타나는지를 확인하고자 하였다. 교반에 의하여 겉보기 투과계수 (Papp)가 다르게 나타나는지를 알아보기 위하여 비교적 넓은 범위의 지용성과 투과력을 갖는 12개의 약물 (Table I)을 선택하여 투과 실험 시 교반을 한 경우와 교반을 하지 않은 경우의 Papp값을 비교하였다. 또한 비교반수층의 두께에 따라 투과 정도가 다르게 나타나는 것이 약물의 어떠한 특성에 의한 것인지를 알아보기 위해 교반 여부에 따른 Papp차이와 약물의 분자량, 지용성 (분배계수), 투과력 (비교반시의 Papp) 과의 상관성을 고찰하였다.
- 약물의 누적량을 plot하였다. 그 기울기로부터 각 약물의 Caco-2 세포 단층막 투과 속도 (dQ/dt, flux)를 비교하여 보았다. 먼저 mannitol, TBuMA, benzylpenicillin, cimetidine, ranitidine, hydrocortisone의 경우 교반에 의하여 unstirred water layer의 두께변화가 예상됨에도 불구하고 flux 차이가 나타나지 않았다(Figme 1).
- 교반에 의하여 겉보기 투과계수 (Papp)가 다르게 나타나는지를 알아보기 위하여 비교적 넓은 범위의 지용성과 투과력을 갖는 12개의 약물 (Table I)을 선택하여 투과 실험 시 교반을 한 경우와 교반을 하지 않은 경우의 Papp값을 비교하였다. 또한 비교반수층의 두께에 따라 투과 정도가 다르게 나타나는 것이 약물의 어떠한 특성에 의한 것인지를 알아보기 위해 교반 여부에 따른 Papp차이와 약물의 분자량, 지용성 (분배계수), 투과력 (비교반시의 Papp) 과의 상관성을 고찰하였다.
- 먼저, 지용성이 교반에 미치는 영향을 알아보았다. 상대적으로 지용성이 낮으면서 지용성이 비슷한 약물인 TBuMA와 loxoproffen을 비교하면 비교반시의 Papp는 각각 2.
- 시간에 따라 투과된 약물의 누적량 (cumulative amounts) 을 plot하고 그 기울기로부터 투과속도 (transport flux, dQ/ dt)를 얻었다. 겉보기 투과계수(# X1/60X "4 X UC(료 계산하였고 단위는 ㎝/sec로 나타내었다.
- 즉, Caco-2 세포를 Transwell의 polycarbonate membrane 상에 배양하면 자동적으로 분화하여 단층막을 형성한다. 이렇게 형성된 Caco-2 세포 단층막을 투과하는 약물의 겉보기 투과계수 (Papp)로부터 소장에서의 흡수 정도를 예측한다.6-9) 경구로 투여된 약물은 일반적으로 소장관강에서 소장 상피를 통해 흡수되어 전신 순환혈에 도달하게 된다.
- , Milwakee, WI, USA) 과 [3H]methyl iodide(85 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL, USA)의 첨가반응으로 합성하였다. 합성한 TB긴MA는 NMR, Mass 및 TLC로 순도와 specific activity 를 확인하였다. Fetal bovine serume Hyclone Laboratories (Logan, UT, USA)로부터, hypsin-EDTA는 Gibco Laboratories (Gaithersburg, MD, USA)로부터, Dubecco's Modified Eagle's medium, non-essential amino acid solution, penicillin-streptoniycin, HBSS, HEPES 및 다른 모든 시약은 모두 Sigma Chemical Co.
대상 데이터
- Caco-2 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 배양액은 10% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acid, 100 units/mL penicillin과 0.
- Cell culture flask (Cat. No. 156499, culture area 75 ㎝2) 는 Nalge Nunc International (NY USA)로부터 구입하여사용하였고, transwell (Cat No. 3401, insert growth area 1 ㎝2, pore size 0.4 mm)은 Coming Costar (NY, USA)로부터 구입하여 사용하였다. TEER 값은 EVOM™ epithelial voltohmmeter (World Precision Instrument, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 합성한 TB긴MA는 NMR, Mass 및 TLC로 순도와 specific activity 를 확인하였다. Fetal bovine serume Hyclone Laboratories (Logan, UT, USA)로부터, hypsin-EDTA는 Gibco Laboratories (Gaithersburg, MD, USA)로부터, Dubecco's Modified Eagle's medium, non-essential amino acid solution, penicillin-streptoniycin, HBSS, HEPES 및 다른 모든 시약은 모두 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다,
- Loxoprofene 대화제약 (Seoul, Korea)으로부터, ranitidinee YH439는 유한양행 (Seoul, Korea)로부터 각각 지원을 받아 사용하였다. [3H]TBuMA (0.
- 배양액은 10% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acid, 100 units/mL penicillin과 0.1 mg/mL streptomycin# 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's medium을 사용하였다. 37"C에서 5% CO와 95% humidity 조건을 항상 유지하도록 하여 75 ㎝2 T-flask에서 배양하였으며 80 —90%의 confluencyofl 도달하면 0.
- , Seoul, Korea)를 사용하였다. 약물을 정량하기 위한 HPLC systeme Hitachi L-7110 pump (Hitachi, Japan), Hitachi L-7200 autosampler (Hitachi, Japan), Shimadzu SPD 6AV UV-Vis detector (Shimadzu, Japan)을 사용하였고, HPLC columne Inertsil ODS-3 (4.61.D. 150 mm, 5 pm particle size, GL science, Japan)를 사용하였다. 동위원소로 표지된 약물을 정량하기 위한 liquid scintillation counter는 WALLAC 1409 (Wallac, USA)를 사용하였고, LSC cocktail 은 Ultima Gold™ (Packard, Ulgersnaweg, UK)을 사용하였다.
데이터처리
- 이때 dQ/ df는 투과속도, transport flux (mmole/min)를 나타내고, A는 투과면적 (cn?)을 나타내며 Co는 약물의 초기농도(mmole/ml) 를 나타낸다. 모든 실험은 적어도 세번(n=3) 수행하였고 결과는 그 평균으로 계산하였다. 실험군 간의 차이를 검정하기 위하여 student's t・test를 사용하여 p<0.
- 모든 실험은 적어도 세번(n=3) 수행하였고 결과는 그 평균으로 계산하였다. 실험군 간의 차이를 검정하기 위하여 student's t・test를 사용하여 p<0.05인 경우에 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- 150 mm, 5 pm particle size, GL science, Japan)를 사용하였다. 동위원소로 표지된 약물을 정량하기 위한 liquid scintillation counter는 WALLAC 1409 (Wallac, USA)를 사용하였고, LSC cocktail 은 Ultima Gold™ (Packard, Ulgersnaweg, UK)을 사용하였다.
성능/효과
- 투과계수(> 2 X 10-5 ㎝/sec)가 큰 약물들은 교반 시 약물의 %pp가 비교반시에 비해 유의성있게 증가하였으며, 교반시 약물의 투과계수는 지용성이 증가함에 따라 증가하는 양상을 보였다 (Table I). 교반시의 투과계수는 교반에 의한 약물의 Papp 변화와 비교할 때 좋은 상관성을 보였다 (Figure 5). 그러나 비교반시의 투과계수는 지용성과 무관하게 유의성있는차이를 보이지 않았다.
- 대체로 투과성이 높은 지용성의 스테로이드 약물들을 대상으로 투과계수 변화를 측정한 결과 상대적으로 지용성이 낮은 약물보다 지용성이 매우 높은 약물의 경우에 교반에 의해 비교반수층이 얇아질수록 투과계수의 상승이 뚜렷히 나타났다.
- 본 연구의 결과를 종합해보면, Papp가 2x10-5 ㎝/sec 이상인 물질들은 교반시 지용성이 증가함에 따라 투과계수가 증가하는 것으로 추정되었다. 결론적으로 약물의 흡수를 연구하기 위하여 Caco-2 cell monolayer를 이용하여 투과실험을 할 때 투과가 잘 되는 약물의 경우 약물의 지용성이 높으면 교반 조건에 대해 특히 주의할 필요가 있으며 문헌치를 참고하는 경우에 있어서도 교반 조건이 상이한 경우에는 교반에 의한 영향을 고려해야 한다고 사료된다.
- ㎝/sec 이상으로 상대적으로. 투과가 잘 되는 약물의 경우에 교반이 약물의 겉보기 투과 계수에 영향을 미치는 것으로 나타났다 (Figure 2; Table I). 그러나 투과가 잘 되는 약물 중에서도 교반에 의해.
- 투과계수(<2x10-5 ㎝/sec) 가 작은 약물들은 교반에 의해 약물의 Pgp가 영향을 받지 않았으며 투과계수와 지용성간에 상관성을 보이지 않았다. 투과계수(> 2 X 10-5 ㎝/sec)가 큰 약물들은 교반 시 약물의 %pp가 비교반시에 비해 유의성있게 증가하였으며, 교반시 약물의 투과계수는 지용성이 증가함에 따라 증가하는 양상을 보였다 (Table I). 교반시의 투과계수는 교반에 의한 약물의 Papp 변화와 비교할 때 좋은 상관성을 보였다 (Figure 5).
후속연구
- 것으로 추정되었다. 결론적으로 약물의 흡수를 연구하기 위하여 Caco-2 cell monolayer를 이용하여 투과실험을 할 때 투과가 잘 되는 약물의 경우 약물의 지용성이 높으면 교반 조건에 대해 특히 주의할 필요가 있으며 문헌치를 참고하는 경우에 있어서도 교반 조건이 상이한 경우에는 교반에 의한 영향을 고려해야 한다고 사료된다.
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