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문제 정의
- 굴로부터 비-이러스의 검출을 위해 PEG를 처리하는 것은 바 이러스를 농축해주는 효과가 있으나 PEG 단계를 거치면서 바 이러스의 손실도 생기고 시간도 많이 걸리는 step이다. 따라서 PEG 처리 횟수를 I회만 할 경우와 2회 할 경우 바이러스 검 출에 어떤 영향을 주는 지를 확인해 보았다. 그 결과 PEG 처 리횟수와 관계없이 둘 다 약 20배 희석에서 비슷한 강도의 band를 확인할 수 있었다(Fig.
- 우리나라의 경우도 굴 등에 대해 검출 기술 개발을 시도하 고 있고 양^장 등에 적용하고 있으나 연구결과가 문헌으로 보 고된 바는 없다. 본 연구에서는 통영산 양식 굴에 폴리오바이 러스를 인위적으로 오염시킨 후 이로부터 폴리오바이러스를 검 출하는 방법을 개발해보고자 하였다.
제안 방법
- RT-PCR-t- 위해서는 총 20)iL의 반응액에 ONE-STEP RT- PCR preMix 8|.iL, 각 primer 일정량(폴리오바이러스의 경우 DG172 lOOpmol과 DG173 200pmol을, 노로바이러스의 경우 NLVII184U23 200pmol과 NLVII738L20 lOOpmol을 사용함)과 RNA 주형이 함유되도록 하였다. 45。。에서 30분간 역전사 반응 후 증폭 cycle을 시작하기 전에 941에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 cycle로 진입하게 하였다.
- 45。。에서 30분간 역전사 반응 후 증폭 cycle을 시작하기 전에 941에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 cycle로 진입하게 하였다. 각 cycle은 94°C 45초, 55°C 45초, 72°C 45초로 하였으며 30 cycle 후 72°C 7분간 연장 반응 시킨 후 반응을 종료하였다.
- 증폭 cycle로 진입하기 전에 941에서 5분간 DNA를 변성시킨 후 각 cycle로 진입하게 하였다. 각 cycle은 94°C 45초, 55°C 45초, 72°C 45초로 하였으며 30 cycle후 72°C 7분간 연장 반응 후 반응을 종료하였다.
- 굴 3 g에 접종한 660 RT-PCR unit의 노로바이러스를 접종하 여 추출한 RNA를 20 卩[, 에 녹여 이중 1 卜iL를 사용하여 RT- PCR을 행하며 RT-PCR 반응액중 절반만 gel loading에 사용하 므로 이를 감안하면 50배 희석하여 RT-PCR을 행하여 확인한 band는 약 0.33 RT-PCR unit에 해당하였다. 이는 굴의 성분들 이 바이러스 RNA 분리 시 carrier로 작용하여 RNA 회수를 오 히려 도와주었음을 의미한다.
- 노로바이러 스는 국립보건연구원 소화기 바이러스과로 부터 PBS(phosphate buffered saline)에 희석된 환자의 분변을 얻어 사용하였다. 노로 바이러스의 titer는 바이러스의 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 행 하여 결정하였다. 노로바이러스의 RNA를 RT-PCR로 증폭한 후 agarose gel(ethidium bromide 염색)로 확인할 수 있는 RNA의 최대 희석배율을 RT-PCR unit로 정의하였다.
- II)된 바와 같이 굴에는 PCR 방해물질이 존재하여 RT-PCR을 방해했기 때문으로 보인다. 다음으로 굴의 량을 약 3 g(굴의 무게가 통상 3-5 g 정도 되므로 굴 3 g은 작 은 굴 1마리에 해당함) 까지 늘려 바이러스의 검출을 실행하 여 보았다. 굴 3 g에 660 RT-PCR unit의 노로바이러스를 오염 시킨 후 RNA를 추출한 후 분석한 결과도 희석하지 않은 RNA 를 사용하는 경우 band가 확인되지 않았으나 이를 5배, 10배, 20배 희석하면 band의 확인이 가능하였으며 (Fig.
- 그러나 PCR을 방해하는 물질이 전체 조직과 소화기에 고루 존재하는 지 아니면 특정 부위에 농축되어 있는지는 아직 명확하지 않 다. 따라서 굴 전체조직을 사용하거나 소화기만을 분리하여 노 로바이러스를 인위적으로 접종하여 노로바이러스의 검출에 차 이가 있는지를 비교하여 보았다(Fig. 5). 그 결과 굴 전체를 사 용할 경우와 소화기 부위만을 사용할 경우 둘 다 비슷한 양상을 보였으며 3, 300 RT-PCR unit의 노로바이러스가 seed될 경우 100배 희석까지(Fig.
- 굴로부터 오염된 바이러스를 농축하고 검출하는 방법이 개발 되었다. 바이러스를 인위적으로 굴 추출물에 접종시킨 후 polyethylene glycol(PEG) 로 침전시키고 chlorofbrm 또는 Freon으로추출한 후 다시 peg로 침전시켜 바이러스를 농축하였다. 각 단 계별로 회수되는 폴리오바이러스의 량을 plaque assay를 이용하 여 측정한 결과 처음 접종한 바이러스의 16.
- 바이러스의 농축정도를 보다 정량적忐 확인하기 위해 plaque assay를 이용하여 확인하여 보았다(Table 2). 이번에 사용된 방 법에 의하면 TRlzoM] 의한 RNA 추출 이전 단계까지 처음 접 종된 폴리오바이러스 중 16.
- 1 g)에 1 mL의 TRIz이을 넣고 vortex한 후 200 皿 의 chlorofbrm을 넣고 tumbling을 45 min 동안 행하였다. 원심 분리 후 상등액을 새 tube에 옮겨 chlorofbrm을 1회 더 처리한 후 추출된 바이러스 RNA를 isopropanol을 이용하여 침전시키 고 70% ethanol로 세척한 후 diethyl pyrocarbonate(DEPC) 처리한 물에 녹여 이중 1 »iL 또는 이에 해당하는 량의 RNA를 사 용하여 RT-PCR을 행하였다.
- 굴로부터 바이러스 추출 시 Freon 대 신 chlorotbrm을 사용하여 비록 바이러스의 농축율은 Freon보 다 낮으나 검출은 더 잘 된다는 보고가 있다(15). 이를 바탕으 로 굴 3 g으로부터 노로바이러스 농축 과정에 2가지 용매를 사 용하여 그 효능을 비교해 보았다. 굴 3 g에 660 RT-PCR unit의 노로바이러스를 오염시킨 다음 나머지 과정은 동일하게 하되프레온 처리(Fig.
- 이AGEN사의 QIAshredderTz Homogenizer이 상추와 햄버거등의 식품에 내재하는 PCR 방해물질£ 효과적으로 제거할 수 있다는 보고가 있고(13), silica gel membrane이 굴에 존재하는 PCR 방해물질을 효과적으로 제거한다는 보고가 있다(II). 이를확인해 보기 위해 QIAGEN사의 QIAshredder™ Homogenizer, 인트론바이 오테크놀로지 사의 Viral gene-spin viral DNA/RNA extraction kit, Promega사의 SV total RNA isolation system을 사용하여 PCR 방해물질이 효과적으로 제거될 수 있는지를 0」 g의 굴에 20, 000 pfu의 폴리오바이러스를 접종하여 확인해 보았 다(Fig. 1). 二L 결과 상치와 햄버거 물질에서는 PCR 방해물질 을 효과적으로 제거하는 것으로 알려진 이Ashredde/M 니omog- enizer가 굴에서는 별로 효과가 없었다(Fig.
- 이후 12, 000rpm에서 원심분리 하여 침전된 pellet을 물300)山에 현탁 시킨 후 TRIzol 1 mL을 사용하여 RNA를 추출 하였다. 이후 isopropanol로 RNA를 침전시키고 RNA pellet을 물에 녹여 이중 1 卜iL 또는 이에 해당하는 량의 RNA를 사용하 여 RT-PCR을 행하였다.
- 폴리오바이러스는 백신주인 Sabin type 1 cDNA를 COS-1 세 포에 transfection하여 얻은 다음 계대하여 사용하였다. 폴리오 바이러스의 titer는 plaque assay를 하여 결정하였다. 노로바이러 스는 국립보건연구원 소화기 바이러스과로 부터 PBS(phosphate buffered saline)에 희석된 환자의 분변을 얻어 사용하였다.
대상 데이터
- ONE-STEP RT-PCR PreMix 와 Viral Gene-spin™ Viral DNA/RNA Extraction kit는 인트론바이오테크놀로지(iNtRON Biotechnology, inc.)로부터 구입하였다. TRIzol은 Invitrogen사 (Carlsbad, CA, USA)의 제품을, SV Total RNA Isolation Sys- tem은 Promega(Madison, WI, USA)의 제품을, QIAshredder™ Homogenizer는 QIAGEN사(www.
- )로부터 구입하였다. TRIzol은 Invitrogen사 (Carlsbad, CA, USA)의 제품을, SV Total RNA Isolation Sys- tem은 Promega(Madison, WI, USA)의 제품을, QIAshredder™ Homogenizer는 QIAGEN사(www.qiagen.com)의 제품을 사용하 였다. 나머지 제품은 Sigma사(St.
- com)의 제품을 사용하 였다. 나머지 제품은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)으〕제품을사용하였다.
- 폴리오 바이러스의 titer는 plaque assay를 하여 결정하였다. 노로바이러 스는 국립보건연구원 소화기 바이러스과로 부터 PBS(phosphate buffered saline)에 희석된 환자의 분변을 얻어 사용하였다. 노로 바이러스의 titer는 바이러스의 RNA를 추출한 후 RT-PCR을 행 하여 결정하였다.
- 본 실험에 사용된 primer는 DG172, DG173, DG213, DG214, NVLIH184U23과 NWLII738L20이었으며 제노텍(주)에서 구입하 였다 (Table 1).
- 본 실험에 사용된 굴은 통영에서 양식중인 것을 공급받는 굴 전문 음식점으로부터 구입하여 폴리오바이러스 또는 노로바이 러스에 감염되지 않은 것을 확인한 후 증류수(Miiiipoie와 1:1 로 섞어 blender로 갈아 분주하여 -7(TC에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 폴리오바이러스는 백신주인 Sabin type 1 cDNA를 COS-1 세 포에 transfection하여 얻은 다음 계대하여 사용하였다. 폴리오 바이러스의 titer는 plaque assay를 하여 결정하였다.
성능/효과
- 1). 二L 결과 상치와 햄버거 물질에서는 PCR 방해물질 을 효과적으로 제거하는 것으로 알려진 이Ashredde/M 니omog- enizer가 굴에서는 별로 효과가 없었다(Fig. 1의 lane 3괴- 6 비 교). 그러나 silica gel membrane 계통인 Viral gene-spin viral DNA/RNA extraction kit오卜 SV total RNA is이ation system은 효과적으로 PCR 방해물질을 제거할 수 있었다(Fig.
- 바이러스를 인위적으로 굴 추출물에 접종시킨 후 polyethylene glycol(PEG) 로 침전시키고 chlorofbrm 또는 Freon으로추출한 후 다시 peg로 침전시켜 바이러스를 농축하였다. 각 단 계별로 회수되는 폴리오바이러스의 량을 plaque assay를 이용하 여 측정한 결과 처음 접종한 바이러스의 16.4-26.0%가 회수됨을 알 수 있었다. 검출을 위해서는 농축된 바이러스를 TRIzol로 추 출한 후 바이러스의 RNA를 희석하거나 silica gel membrane을 이용하여 capture한 후 RT-PCR로 확인할 수 있었다.
- 0%가 회수됨을 알 수 있었다. 검출을 위해서는 농축된 바이러스를 TRIzol로 추 출한 후 바이러스의 RNA를 희석하거나 silica gel membrane을 이용하여 capture한 후 RT-PCR로 확인할 수 있었다. 그러나 상 추와 햄버거에서 RT-PCR 방해물질을 효과적으로 제거하는 QIAshreddeF'' Homogenizer는 굴에 존재하는 방해물질을 제거호卜 지 못하였다.
- 굴 0.1g에 폴리오바이러스 20, 000 pfu를 집종시킨 후 RNA 를 추출하여 이 를 20 卩L 물에 녹여 이 중 1 卩L를 사용하여 분 석한 결과 폴리오바이러스 RNA를 희석하여 RT-PCR을 행하는 것이 희석하지 않은 RNA를 사용하는 것보다 더 잘 검출되었다(Fig. 1 lanes 3-5). 같은 현상을 굴 0.
- 다음으로 굴의 량을 약 3 g(굴의 무게가 통상 3-5 g 정도 되므로 굴 3 g은 작 은 굴 1마리에 해당함) 까지 늘려 바이러스의 검출을 실행하 여 보았다. 굴 3 g에 660 RT-PCR unit의 노로바이러스를 오염 시킨 후 RNA를 추출한 후 분석한 결과도 희석하지 않은 RNA 를 사용하는 경우 band가 확인되지 않았으나 이를 5배, 10배, 20배 희석하면 band의 확인이 가능하였으며 (Fig. 2A lanes 2-5, Fig. 2B lanes 2-5) 50배 까지 희석하여도 band를 관찰할 수 있 었다(data not shown). 바이러스 확인을 위해 필요한 희석 배율 은 시행에 따라 다소 차이가 있었으나 일반적으로 5배 정도의 희석으로 band를 확인하는 것이 가능하였고 10배 정도의 희석 에서 가장 진한 band를 관찰할 수 있었다.
- 따라서 PEG 처리 횟수를 I회만 할 경우와 2회 할 경우 바이러스 검 출에 어떤 영향을 주는 지를 확인해 보았다. 그 결과 PEG 처 리횟수와 관계없이 둘 다 약 20배 희석에서 비슷한 강도의 band를 확인할 수 있었다(Fig. 4). 그러나 여러 차례의 실험 결과 PEG를 2회 처리한 것이 일반적으로 더 나은 band를 보였으며 (data not shown) pellet을 물에 녹일 때 2회 처리한 것은 잘 현 탁 되는 반면 1회만 처리한 것은 다음 step의 RNA 추출을 위 해 300 “L의 물에 현탁 시키는 것이 용이하지 않아 굴의 량 이 현행 3 g보다 많아질 경우 PEG를 2회 처리하는 것이 나을 것으로 판단되었다.
- 5). 그 결과 굴 전체를 사 용할 경우와 소화기 부위만을 사용할 경우 둘 다 비슷한 양상을 보였으며 3, 300 RT-PCR unit의 노로바이러스가 seed될 경우 100배 희석까지(Fig. 5 lane 7과 14 비교) 비슷한 강도의 band 로 검출이 가능하였다. 따라서 본 결과로부터 PCR 방해물질은 전체조직과 소화기에 고루 존재하는 것으로 판단되었다.
- 4). 그러나 여러 차례의 실험 결과 PEG를 2회 처리한 것이 일반적으로 더 나은 band를 보였으며 (data not shown) pellet을 물에 녹일 때 2회 처리한 것은 잘 현 탁 되는 반면 1회만 처리한 것은 다음 step의 RNA 추출을 위 해 300 “L의 물에 현탁 시키는 것이 용이하지 않아 굴의 량 이 현행 3 g보다 많아질 경우 PEG를 2회 처리하는 것이 나을 것으로 판단되었다.
- 5 lane 7과 14 비교) 비슷한 강도의 band 로 검출이 가능하였다. 따라서 본 결과로부터 PCR 방해물질은 전체조직과 소화기에 고루 존재하는 것으로 판단되었다. 그러 나 이는 굴의 소화기관에 PCR 방해물질이 덜 존재하는 것으 로 보고한 Atmar 등(14)등의 결과와 상치된다.
- 영국의 경우도 이와 비슷한 40% 정도가 노로바이러스에 의한 것으로 알려져 있다(5). 따라서 우리나라의 경우도 미확 인 비 세균성 식중독 중 적어도 50-60%는 바이러스성일 것으 로 추정되고 이를 고려하면 바이러스성 식중독의 전체 발생률 은 미국과 비슷한 34-40%에 이를 것으로 보인다.
- 이는 이미 보고된 검출한계 (8-10)인 굴 g당 2-20 pfii보다 나은 결과이다. 또 A형 간염 바이러스의 결과와 직접 비교하기는 어렵지만 굴 g당 8 pfii(18)에 비해서도 현저히 좋았다. 따라서 새로 개발된 이 방법은 굴로부터 효과적 으로 노로바이러스를 검출할 수 있을 것으로 기대된다.
- 2B lanes 2-5) 50배 까지 희석하여도 band를 관찰할 수 있 었다(data not shown). 바이러스 확인을 위해 필요한 희석 배율 은 시행에 따라 다소 차이가 있었으나 일반적으로 5배 정도의 희석으로 band를 확인하는 것이 가능하였고 10배 정도의 희석 에서 가장 진한 band를 관찰할 수 있었다.
- 바이러스의 농축정도를 보다 정량적忐 확인하기 위해 plaque assay를 이용하여 확인하여 보았다(Table 2). 이번에 사용된 방 법에 의하면 TRlzoM] 의한 RNA 추출 이전 단계까지 처음 접 종된 폴리오바이러스 중 16.4-26.0% 가 회수됨을 알 수 있었다. 최종 수율에 있어 2가지 procedure?)- 16.
- nested PCR은 이 방 법의 효율을 높여주었다. 전체적으로 이 방법을 사용하면 굴로 부터 오염된 노로바이러스의 검출이 가능하다고 판단된다.
- 폴리오바이러스로 실험한 결과는 굴 3 g에 5, 000 pfti 접종하 여 회수한 RNA를 20 皿에 녹여 이중 1 卩L를 이용하여 RT-PCR 을 행하면 50-125배까지 희석하여 RT-PCR을 행하여도 band의 관찰이 가능하고(data not shown) RT-PCR 반응액 중 절반만 gel loading에 사용하는 것을 감안하면 이 band는 1-2.5 pfii에 해당 한다. 폴리오바이러스 1 pfb당 30-300 입자라고 추정하면(8) nested PCR에 의존하지 않고 RT-PCR에 의한 검출한계는 굴 3g 당 30-750입자에 해당한다.
후속연구
- 또 A형 간염 바이러스의 결과와 직접 비교하기는 어렵지만 굴 g당 8 pfii(18)에 비해서도 현저히 좋았다. 따라서 새로 개발된 이 방법은 굴로부터 효과적 으로 노로바이러스를 검출할 수 있을 것으로 기대된다.
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