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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 MC3T3-E1 골아세포의 증식 에 대한 genistein, daidzein 및 resveratrol의 효과를 확인하고, 이들식 물성 에스트로겐의 효과가 성장인자인 IGF-1의 생성 과 관련된 것인지를 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 사용하였다.MC3T3-E1 세 포는 10% FBS (Fetal bovine serum)를 함유하는 a -MEM( a -Modified Eagle Medium; sodium bicarbonate, 100 U/mL penicillin, 100 Ug/mL streptomycin) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하고 배지는 3일마다 교환하였다. 17(3-EstTadiol과 식물성 에스트로겐인 genistein, daidzein 및 resveratrol의 세포 투여 농도를 결정하기 위 해 다양한 농도별로 세포 증식에 미치는 효과를 확인한 결과, 17P-estradiol의 효과는 10-9 M에서 가장 큰 것으로 나타났으며 , genistein, daidzein, 및 resveratrol의 경우에 는 10 5 M에서 가장 큰 효과를 나타내었기 때문에 각각 10” M과 10~5 M 농도로 세포에 첨가하였다.
- 배양하였다. 24시간 경과 후, 새로운 배지 에 1邓-est「adiol(10「아 M), geni-steindO-5 M), daidzein(10 ° M) 및 resveratroKIO 3 M)을 첨가하여 48시간 더 배양하였다. 배양 후 세포 monolayer는 PBS-EDTA로 2회 세 척 하고 trypsin 처리 하여 세 포를 회 수하였다.
- 배양 후 세포 monolayer는 PBS-EDTA로 2회 세 척 하고 trypsin 처리 하여 세 포를 회 수하였다. 회 수한 세포는 Brightline hemacytometer(Hausser Scientific, USA)를 이용하여 전자현미경 (OLYMPUS, Japan) 하에서 총 세포 수를 측정하였다.
- 살아있는 세포 수를 측정하여 세포 증식을 평 가하기 위 해 MTT assay을 변형한 MTS assay를 사용하여 실험하였다. MTS assay는 실험 조건별로 처리한 세포에 tetrazolium compound인 MTS를 투여하고 일정 시간동안 배양하여 세포 내 미토콘드리아에 존재하는 succinate dehydrogenase 에 의해 생성된 수용성 farmazan의 양을490nm에서 비색 정량하여 세포의 증식을 확인하는 방법이다.
- MC3T3-E1 세 포를 10% FBS를 함유하는 a -MEM 배 지에서 배양하고 FBS가 없는 a -MEM 배지로 교환하여 24시간 배양한 다음, 세포의 일정한 영역을 면도칼로 긁어 빈 공간을 만든 후, 17p-estradiolf genistein, daidzein 및 resveratrol을 첨가하여 48시 간동안 배양하였다. 48시간 경과 후, 배지를 제거한 다음 세포를 PBS-EDTA로 2회 씻 어 내고 methanoic 고정하였다.
- 첨가하여 48시 간동안 배양하였다. 48시간 경과 후, 배지를 제거한 다음 세포를 PBS-EDTA로 2회 씻 어 내고 methanoic 고정하였다. 고정된 세포는 Harris hematoxylin으로 염색하여 절단면 아래로 내려온 세포의 핵을 전자현미경 하에서 계수하였다.
- 48시간 경과 후, 배지를 제거한 다음 세포를 PBS-EDTA로 2회 씻 어 내고 methanoic 고정하였다. 고정된 세포는 Harris hematoxylin으로 염색하여 절단면 아래로 내려온 세포의 핵을 전자현미경 하에서 계수하였다.
- 6)를 넣고 얼음 위 에서 scrapping하여 cell lysate를 회수하였다. Cell lysate는 ice bath에서 60초간 sonicatiorr하고 원심분리하여 그 상청 액을 다시 회수하였고 회수한 각 처리군 별 cell lysate의 ALP 활성은 ALP 측정용 kit(신양화학, Korea)를 사용하여 측정하였다.
- MC3T3-E1 세포를 각 처리 군 별로 48시간 배 양하여 회 수한 배 양액과 cell lysate에서 IGFT의 농도는 two-site immunoradiometric assay(IRMA) kit(DSL-5600 ACTIVE IGF-I Coated-Tube IRMA kit, USA)를 사용하여 측정하였다. 배양액과 cell lysate에 extraction solution을 가하여 실온에서 30분간 방치 하고 원심 분리 하여 InsulirHike Growth Factor binding protein(IGFBP)i- 제거 하였다.
- 측정하였다. 배양액과 cell lysate에 extraction solution을 가하여 실온에서 30분간 방치 하고 원심 분리 하여 InsulirHike Growth Factor binding protein(IGFBP)i- 제거 하였다. IGFBP 제거 후, neutralizing solution으로 중화시 켜 anti-IGF-I coated tubes에 넣고 坯1으로 표지한 antiTGFT 免agent를 첨가하여 실온에서 3시 간동안 shaking incubation(180 rpm)하였다.
- IGFBP 제거 후, neutralizing solution으로 중화시 켜 anti-IGF-I coated tubes에 넣고 坯1으로 표지한 antiTGFT 免agent를 첨가하여 실온에서 3시 간동안 shaking incubation(180 rpm)하였다. 3시간 경과 후, anti-IGF-I coated tubes 내의 반응액을 제거하고 탈이 온수로 3번 세척한 다음 gamma counter(Wallac 1470 wizard, Amersham Pharmacia Biotech, England)로 radio activity를 측정하였다.
- 에스트로겐의 효과를 17。-estradiol의 효과와 비교하여 살펴보았다.
- 178-Estradiol, genistein, daidzein 및 resveratrol ° 1 MC3T3-E1 세포의 증식 과 성 장에 미 치 는 효과는 cell migration 분석을 통해서도 살펴보았다. Fig.
- MC3T3-E1 세포의 배양액 에 17P-estradiol(10-9 M), genistein(10 5 M), daidzein(10 3 M) 및 resveratroKIO 3 M)을 첨가하여 48시 간동안 배 양한 후, 배 양액과 cell lysate내에 존재하는 IGFT의 농도를 immunoradiometric 분석방법으로 (IRMA) 측정한 결과는 각각 Fig. 6A와 B에 나타내었다. 배양액 중의 IGF-I 생성은 178-estradiol 처리에 의해 40.
대상 데이터
- Sodium bicarbonate, BSA(bovine serum albumin), trypsin-EDTA, protease inhibitor, 17~estradiol, genistein, daidzein 및 resveratrole- Sigm@(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)와 USB(Amersham Pharmacia bioscience, England) 제품을 사용하였다. ECL-westem immuno blot에 사용한 protein standard marker는 rainbow high molecular marker(Amersharm Pharmacia bioscience, England) 를 사용하였고 detection reagent는 Pierce(Pierce, Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
- Louis, MO, USA)와 USB(Amersham Pharmacia bioscience, England) 제품을 사용하였다. ECL-westem immuno blot에 사용한 protein standard marker는 rainbow high molecular marker(Amersharm Pharmacia bioscience, England) 를 사용하였고 detection reagent는 Pierce(Pierce, Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. 세포 배양용 용기와 기구는 Com-ing(Corning, NY, USA)과 Falcon(Becton Dickinson Lab ware, Franklin Lakes, NJ, USA) 제품을 사용하였고 세포의 RNA는 Introndntron Biotechnology, Inc.
- ECL-westem immuno blot에 사용한 protein standard marker는 rainbow high molecular marker(Amersharm Pharmacia bioscience, England) 를 사용하였고 detection reagent는 Pierce(Pierce, Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. 세포 배양용 용기와 기구는 Com-ing(Corning, NY, USA)과 Falcon(Becton Dickinson Lab ware, Franklin Lakes, NJ, USA) 제품을 사용하였고 세포의 RNA는 Introndntron Biotechnology, Inc., Korea) 제품인 Easy blue로 추출하였다. 전기 영동용 agarose는 SeaKem LE agarosetBMA, Rockland, ME, USA)를 사용하였고 그 외 RNA와 DNA 실험 용 시 약은 molecular biology용으로 Sigma 제품과 특급시약을 사용하였다.
- , Korea) 제품인 Easy blue로 추출하였다. 전기 영동용 agarose는 SeaKem LE agarosetBMA, Rockland, ME, USA)를 사용하였고 그 외 RNA와 DNA 실험 용 시 약은 molecular biology용으로 Sigma 제품과 특급시약을 사용하였다.
- MC3T3-E1 세 포는 경 희 대 학교 의 과대 학 내 분비 연구실 에서 분양 받아 본 실험실에서 배양하면서 사용하였다.MC3T3-E1 세 포는 10% FBS (Fetal bovine serum)를 함유하는 a -MEM( a -Modified Eagle Medium; sodium bicarbonate, 100 U/mL penicillin, 100 Ug/mL streptomycin) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하고 배지는 3일마다 교환하였다.
- MC3T3-E1 세포배 양에 사용된 tz -MEM( [2 -Modified Eagle's Medium), FBS(Fetal bovine serum)는 Gibco BRL (Life Technologies, Gibco BRL, Gaitherberg, MD) 제품을 사용하였다. Sodium bicarbonate, BSA(bovine serum albumin), trypsin-EDTA, protease inhibitor, 17~estradiol, genistein, daidzein 및 resveratrole- Sigm@(Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 실험의 분석결과는 각각의 처리별로 평균치와 표준편차 (mean土SD)를 사용하여 표기하였으며, 유의성 검정에는 Student's f-test를 이용하였다.
이론/모형
- IGFT의 mRNA 발현 분석 에는 digoxigenin(DIG)으로 표지 하여 화학발광방법으로 mRNA를 확인하는 non-radioac-tive DIG northern blot 방법을 사용하였다. 각 처리 조건별로 배 양하여 추출한 MC3T3-E1 세포의 total RNA 20 Hg을 1.
- 6A). 이들의 처리에 의해 나타났던 IGF-I 생성 증가가 IGF-I mRNA 발현과 관련된 것인지를 northern hybridization 방법으로 분석하였다(Fig. 7).
성능/효과
- MC3T3-E1 세 포는 10% FBS (Fetal bovine serum)를 함유하는 a -MEM( a -Modified Eagle Medium; sodium bicarbonate, 100 U/mL penicillin, 100 Ug/mL streptomycin) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하고 배지는 3일마다 교환하였다. 17(3-EstTadiol과 식물성 에스트로겐인 genistein, daidzein 및 resveratrol의 세포 투여 농도를 결정하기 위 해 다양한 농도별로 세포 증식에 미치는 효과를 확인한 결과, 17P-estradiol의 효과는 10-9 M에서 가장 큰 것으로 나타났으며 , genistein, daidzein, 및 resveratrol의 경우에 는 10 5 M에서 가장 큰 효과를 나타내었기 때문에 각각 10” M과 10~5 M 농도로 세포에 첨가하였다.
- Genistein, daidzein 및 resveratrol에 의해 총 세포 수는 각각 34.8%(p[0.001), 51.4%(p[0.001), 31.8%(p[0.001) 증가하였으며, 176-estradiol에 의해 49.1%(p[0.001) 증가한 것으로 나타났다(Fig. 1). MTS assay로 살아있는 세포 수를 확인한 결과(Fig.
- 1). MTS assay로 살아있는 세포 수를 확인한 결과(Fig. 2)에서 는 daidzein과 resveratrol 처리군의 경우 대조군에 비해 각각 20.2%(p[0.001)와 14%(p[ 0.001)의 세포 수 증가를 나타내어 13.4% (p[ 0.001)의 증가를 보인 176-estradiol보다 세포 증식에 미치는 효과가 크다는 것을 알 수 있었다. Genistein의 경우에는 11.
- 3은 176-estradioI과 각각의 식물성 에스트로겐 처리에 의해 절단면 아래로 증식한 세포사진을 나타낸 것이다. 17-Estradiol의 첨가에 의해서는 대조군에 비해 증식이 74.8%(p[0.001) 향상된 상태임을 확인할 수 있었으며, genistein과 daidzein에 의해서는 각각 16.5% (p[0.01)와 43.2%(p[0.01)의 증가를 보였다. Resveratrol 투여에 의해서는 176-estradiol의 효과에는 미치지 못하지만 58.
- 4). 이상으로 식물성 에스트로겐인 genistein, daidzein 및 resveratrol이 세포의 증식과 성장에 미치는 효과를 살펴본 결과, 이들이 에스트로겐인 17。迫stradiol과 마찬가지로 MC3T3-E1 골아세포의 증식과 성장을 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 난소 절제 쥐의 골 손실에서 daidzeine genistein보다 효과적이라는 in vivo 결과(29)와 마찬가지로 MC3T3-E1 세포를 이용한 본 연구에서도 실험에 따른 차이는 있으나 daidzein과 resveratrol의 효과는 genistein보다 큰 것으로 나타났다.
- 이상으로 식물성 에스트로겐인 genistein, daidzein 및 resveratrol이 세포의 증식과 성장에 미치는 효과를 살펴본 결과, 이들이 에스트로겐인 17。迫stradiol과 마찬가지로 MC3T3-E1 골아세포의 증식과 성장을 유도한다는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 난소 절제 쥐의 골 손실에서 daidzeine genistein보다 효과적이라는 in vivo 결과(29)와 마찬가지로 MC3T3-E1 세포를 이용한 본 연구에서도 실험에 따른 차이는 있으나 daidzein과 resveratrol의 효과는 genistein보다 큰 것으로 나타났다.
- 6A와 B에 나타내었다. 배양액 중의 IGF-I 생성은 178-estradiol 처리에 의해 40.1% (p[0.001) genistein, daidzein 및 resveratrol에 의해서는 각각 28.3%(p[0.001), 32.0%(p[0.001), 24.2%(p[0.001) 증가한 것으로 나타났다(Fig. 6A). Cell lysate에서 IGF-I의 농도는 세포에서 생성된 후, 배양액으로 분비되고 남은 양으로서 배양액보다 전체적으로 낮은 경향을 보였으며(Fig.
- 6A). Cell lysate에서 IGF-I의 농도는 세포에서 생성된 후, 배양액으로 분비되고 남은 양으로서 배양액보다 전체적으로 낮은 경향을 보였으며(Fig. 6B), 17P-estradiol, genistein 및 resveratrol에 의해 각각 2.5% (p[0.05), 7.6%(p[0.001), 2.3%(p[0.05)의 증가를 나타내었고 daidzein 처리에 의해서는 2.8%(p[0.05) 감소한 것으로 나타났다.
- 식 물성 에스트로겐의 투여 에 의해 IGF-I의 농도가 증가하였다는 보고는 없었다. 그러나 본 실험 결과, 17Pestradiol 뿐만 아니라 식 물성 에스트로겐 인 genistein, daidzein 및 resveratrol 또한 IGFT의 생 성 을 증가시 키 는 것 으로 나타났다. 이러한 결과로부터 앞서 살펴본 genistein, daidzein 및 resveratrol。] MC3T3-E1 골아세포의 증식, 그리고 골 형성과 관련된 대사 활성 증진에 미치는 효과에는 이들의 처리에 의해 국소적으로 생성이 증가된 세포 성장인자인 IGF-I의 작용이 관여하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- IRMA로 IGFT의 농도를 측정한 결과, 178-estradiol과 genistein, daidzein 및 resveratrole MC3T3-E1 세포에서 IGF-I 생성을 증가시킨 것으로 나타났다(Fig. 6A). 이들의 처리에 의해 나타났던 IGF-I 생성 증가가 IGF-I mRNA 발현과 관련된 것인지를 northern hybridization 방법으로 분석하였다(Fig.
- Densitometor로 IGF-I mRNA 밴드를 정 량한 결과(Fig.7B), IGF-I mRNA의 발현은 170-esBadio!에 의해 20.6% 증가하였으며 genistein, daidzein 및 resveratrol-^ 처리에의 해서는 각각 24.2%, 48%, 32.7% 증가한 것으로 나타났다. IGF-I mRNA는 모든 처리 군에서 증가한 것으로 나타나 앞서 확인한 IGF-1의 증가는 IGF-I 생산 증가를 나타내는 지표(37, 38)인 IGF-I mRNA 발현 수준을 반영하는 것임을 알 수 있었다.
- 7% 증가한 것으로 나타났다. IGF-I mRNA는 모든 처리 군에서 증가한 것으로 나타나 앞서 확인한 IGF-1의 증가는 IGF-I 생산 증가를 나타내는 지표(37, 38)인 IGF-I mRNA 발현 수준을 반영하는 것임을 알 수 있었다. 그러나 IGF-1 mRNA 발현 수준과 IGF-I 단백질 생성 수준이 완전히 일치하지는 않았다.
- 그러나 본 실험 결과, 17Pestradiol 뿐만 아니라 식 물성 에스트로겐 인 genistein, daidzein 및 resveratrol 또한 IGFT의 생 성 을 증가시 키 는 것 으로 나타났다. 이러한 결과로부터 앞서 살펴본 genistein, daidzein 및 resveratrol。] MC3T3-E1 골아세포의 증식, 그리고 골 형성과 관련된 대사 활성 증진에 미치는 효과에는 이들의 처리에 의해 국소적으로 생성이 증가된 세포 성장인자인 IGF-I의 작용이 관여하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 그러나 IGF-1 mRNA 발현 수준과 IGF-I 단백질 생성 수준이 완전히 일치하지는 않았다. 이러한 결과는 genistein, daidzein 및 resveratrol의 처리에 의한 IGFT의 생성이 유전자 발현을 나타내는 전사 단계에서 조절될 뿐만 아니라 전사 후 번역 단계인 단백질 합성수준에서도 조절될 것이라는 가능성을 제시하는 것으로서 이에 대해서는 앞으로 더 많은 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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