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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 감도 및 선택성이 높은 GC/MS를 이용하여 잎담배 중 nicotine, nomico- tine 외에 미량으로 존재하는 anatabine, anabasine, myosmine, cotinine, 2, 3'-dipyridyl, P -nicotyrine, P-nomicotyrine 및 P-formylnomico-tine에 대한 최적 추출 및 분석 방법을 검토하고, 품종별 잎담배의 알칼로이드 함량을 조사하였다.
제안 방법
- , 2003년), 중 국산(CK-B4O, 2003년)을, 버어리종으로 한국산 (BIT, 2004년), 미국산(B3F, 2004년)을, 오리엔트 종으로 그리스산 바스마 111(2003년), 카바쿨락 IV(2003년), 카테리니 IV(2003년)를 GC/MS로 분석하였다. GC/MS의 full scan mode로 분석하여 알칼로이드를 확인하였고, 알칼로이드만을 선택적으로 분석하기 위하여 Table 1에 나타난 바와 같이 특정 ion 만을 선택하여 selected ion monitoring(SIM) mode로 분석 후 알칼로이드 표준검량선을 작성하고 품종별 알칼로이드를 정량하였다(Table 3, Fig. 2).
- 알칼로이드 회수율 시험은 설정된 최적 추출법을 이용하여 4단계 농도별로 3반복 실험하였다. Nicotine 100〜1000 ug/mL, nomicotine 10〜150 Iig/mL, anatabine 5〜50 pg/mL, anabasine 5 〜50 yg/mL, myosmine 5~50 Ug/mL, cotinine 5~50 pg/mL, 2, 3'-dipyridyl l~20 pg/mL, P-nicotyrine l~20 Pg/mL, P-nomicotyrine l~20 iig/mL, P -formylnornicotine l~30 pg/mL 범위의 농도에 대하여 회수율을 시험하였다.
- Nomicotine, myosmine, anabasine, anatabine등 미량 알칼로이드들의 적절한 회수율을 얻기위하여 chloroform, ether, methanol, dichlorme thane, hexane 등의 용매에 대한 추출 효율을 다 음과 같이 시험하였다(장 등, 1991; Cai 등, 2003; Yang 등, 2002; Health Canada, 1999; CORESTA, 2005).
- 내부표준물질은 n-dodecane, n-heptadecane 및 2, 4'-dipyHdyl를 첨가하여 비교하였다.
- 본 연구는 잎담배 중 nicotine, nomicotine 외에 미량으로 존재하는 anatabine, anabasine, myosmine, cotinine, 2, 3'-dipyridyl, P-nicotyrine, P-nomicotyrine 및 p-formylnomicotine°]] 대한 최적 추출 조건을 검토한 것으로써, NaOH 알칼리 처리 후 methanol : dichloromethane( 1 :3, v/v)혼합용매를 사용하는 경우가 최적 추출 조건이었다. 또한 알칼로이드에 대한 감도 및 선택성을 높이기 위하여 GC/MS의 selected ion monitoring (SIM) mode로 분석하였다. 황색종, 버어리종, 오리엔트종 등 11종의 잎담배 알칼로이드 함량을 분석한 결과, 잎담배 종류별 알칼로이드 함량은 대체적으로 버어리종 > 황색종 > 오리엔트종 순으로 나타났다.
- 알칼로이드 회수율은 내부표준물질을 포함하여 알칼로이드 표준용액을 잎담배에 첨가한 후 추출하여 실험하였다. 또한 정확성 및 정밀도는 알칼로이 드 회수율 시험 결과를 토대로 하였다. 알칼로이드는 4단계 농도로 첨가하였고, 3반복 실험한 결과를 Table 2에 나타내었다.
- 알칼로이드 회수율 시험은 설정된 최적 추출법을 이용하여 4단계 농도별로 3반복 실험하였다. Nicotine 100〜1000 ug/mL, nomicotine 10〜150 Iig/mL, anatabine 5〜50 pg/mL, anabasine 5 〜50 yg/mL, myosmine 5~50 Ug/mL, cotinine 5~50 pg/mL, 2, 3'-dipyridyl l~20 pg/mL, P-nicotyrine l~20 Pg/mL, P-nomicotyrine l~20 iig/mL, P -formylnornicotine l~30 pg/mL 범위의 농도에 대하여 회수율을 시험하였다.
- 000 범위로 높은 직선성을 나타내었다. 알칼로이드 회수율은 내부표준물질을 포함하여 알칼로이드 표준용액을 잎담배에 첨가한 후 추출하여 실험하였다. 또한 정확성 및 정밀도는 알칼로이 드 회수율 시험 결과를 토대로 하였다.
- 잎담배 알칼로이드의 GC 분석은 FID가 부착된 Hewlett-Packard 5890 II Plus 기기를 사용하였으 며, column은 DB-5(30 m x 0.32 mm i.d., 0.5 pm film thickness, J&W, USA)를 이용하였다. Oven 온도 프로그램은 120°C에서 200°C까지 3°C/min 속도로, 250°C까지 5°C/min 속도로 승온시켰다.
대상 데이터
- (USA), Toronto Research Chemicals Inc.(Canada) 및 Acros Oragnics(USA)의 제품들을 구입하여 사용하였다.
- 또한 분석할 분자량의 범위 (*) 는 40〜350으로 설정하였다. Column은 DB-5(30 m x 0.25 mm i.d., 0.25pm film thickness, J&W, USA)를 이용하였다. Oven 온도 프로그램은 100°C에서 200°C까지 3°C/min 속도로, 250°C까지 5°C/min 속도로 승온시켰다.
- 잎담배 중 알칼로이드 함량을 분석하기 위하여 황색종은 한국산(B1O, 2004년), 미국산(C4F 2004 년), 브라질산 (KB4O, 2004년), 아르헨티나산 (ARC3, 2004년), 인도산(INC2, 2003년), 중국산 (CKB4O, 2003년)을, 버어리종은 한국산 (BIT, 2004년), 미국산 (B3F, 2004년)을, 오리엔트종은 그리스산 바스마 111(2003년), 카바쿨락 IV(2003 년), 카테리니 IV(2003년)를 각각 취하여 분석하 였다.
- 잎담배 품종별 알칼로이드 함량을 조사하기 위하여 황색종으로 한국산(B1O, 2004년), 미국산 (C4F 2004년), 브라질산(K-B4O, 2004년), 아르헨 티나산(ARC3, 2004년), 인도산(INC2, 2003년), 중 국산(CK-B4O, 2003년)을, 버어리종으로 한국산 (BIT, 2004년), 미국산(B3F, 2004년)을, 오리엔트 종으로 그리스산 바스마 111(2003년), 카바쿨락 IV(2003년), 카테리니 IV(2003년)를 GC/MS로 분석하였다. GC/MS의 full scan mode로 분석하여 알칼로이드를 확인하였고, 알칼로이드만을 선택적으로 분석하기 위하여 Table 1에 나타난 바와 같이 특정 ion 만을 선택하여 selected ion monitoring(SIM) mode로 분석 후 알칼로이드 표준검량선을 작성하고 품종별 알칼로이드를 정량하였다(Table 3, Fig.
이론/모형
- 잎담배 알칼로이드의 GC/MS 분석은 Agilent 6890N GC/5973Z MSD system(USA)를 사용하였으며, 시료의 이온화는 electron impact ionization (EI) 방법으로 행하였다. GC/MS 분석조건은 ionization voltage를 70 eV로 하였고, ion source temperature는 230°C로 하였다.
성능/효과
- 결과적으로 100% chloroform, ether, methanol, hexane의 이용은 몇몇 알칼로이드에 있어 낮은 회수율을 나타내었다. Methanol 와 dichlorome- thane를 혼합하여 용해도와 극성도를 조절한 결 과, 모든 알칼로이드에 대하여 높은 추출 효율을 나타내었으며, 이는 Yang 등(2002)의 결과와도 잘 부합되는 것이었다.
- 반면 버 어리종과 오리엔트종의 경우에는 nornicotine의 함량이 anatabine의 함량보다 높게 나타났다. 국 가별 황색종 nicotine의 함량은 브라질 > 중국 > 아르헨티나 > 미국, 한국 > 인도 순으로 인도산에서 가장 낮은 수준으로 확인되었고 대체적으로 인도산 황색종에서 모든 알칼로이드의 함량이 낮게 존재하였다.
- 국가별 황색종중 알칼로이드는 모든 시료에서 nicotine이 가장 높은 함량을 차지하였고, 나머지 알칼로이드의 함량은 대체적으로 anatabine > nomicotine> P-nicotyrine > P-formylnomicotine > myosmine > 2, 3'-dipyridyl > cotinine > anabasine > P-nomicotyrine 순이었다. 반면 버 어리종과 오리엔트종의 경우에는 nornicotine의 함량이 anatabine의 함량보다 높게 나타났다.
- 버어리종 중 미국산과 국내산을 비교해볼 때 nornicotine, myosmine 및 P-formylnomicotine 함 량은 국내산이 높게 나타났으나, nicotine 및 다른 미량 알칼로이드는 미국산이 높게 나타났다. 오리엔트종 중 nicotine, nomicotine, anatabine 및 다른 미량 알칼로이드의 함량은 대체적으로 바스마 > 카테리니 > 카바쿨락 순으로 나타났다.
- 본 연구는 잎담배 중 nicotine, nomicotine 외에 미량으로 존재하는 anatabine, anabasine, myosmine, cotinine, 2, 3'-dipyridyl, P-nicotyrine, P-nomicotyrine 및 p-formylnomicotine°]] 대한 최적 추출 조건을 검토한 것으로써, NaOH 알칼리 처리 후 methanol : dichloromethane( 1 :3, v/v)혼합용매를 사용하는 경우가 최적 추출 조건이었다. 또한 알칼로이드에 대한 감도 및 선택성을 높이기 위하여 GC/MS의 selected ion monitoring (SIM) mode로 분석하였다.
- 알카리 처리 후 chloroform으로 추출한 경우(A)에는 p-nicotyrine 및 nomicotyrine의 수율 이 낮았고, ether로 추출한 경우(B에는 nom- icotine, myosmine, p-nicotyrine 및 p-nomico- tyrine, p-formylnomicotine 등이 낮게 나타났으며, hexane으로 추출한 경우(E)에는 nicotine 외 다른 알칼로이드는 모두 낮은 함량을 나타내었다. 알카리 처리 후 methanol : dichloromethane (1:3, v/v) 혼합용매를 사용한 추출법 C 와 methanol을 사용한 추출법 D의 경우에는 다른 추출법에 비해 높은 함량을 나타내었으나, methanol 추출법 (D)는 methanol : dichloromethane 혼합용매 추출법에 비하여 P-nicotyrine, 2, 3'- dipyridyl, P-nomicotyrine, formylnornicotine이 비교적 낮은 함량을 나타내었다.
- 알카리 처리 후 chloroform으로 추출한 경우(A)에는 p-nicotyrine 및 nomicotyrine의 수율 이 낮았고, ether로 추출한 경우(B에는 nom- icotine, myosmine, p-nicotyrine 및 p-nomico- tyrine, p-formylnomicotine 등이 낮게 나타났으며, hexane으로 추출한 경우(E)에는 nicotine 외 다른 알칼로이드는 모두 낮은 함량을 나타내었다. 알카리 처리 후 methanol : dichloromethane (1:3, v/v) 혼합용매를 사용한 추출법 C 와 methanol을 사용한 추출법 D의 경우에는 다른 추출법에 비해 높은 함량을 나타내었으나, methanol 추출법 (D)는 methanol : dichloromethane 혼합용매 추출법에 비하여 P-nicotyrine, 2, 3'- dipyridyl, P-nomicotyrine, formylnornicotine이 비교적 낮은 함량을 나타내었다.
- 황색종, 버어리종, 오리엔트종 등 11종의 잎담배 알칼로이드 함량을 분석한 결과, 잎담배 종류별 알칼로이드 함량은 대체적으로 버어리종 > 황색종 > 오리엔트종 순으로 나타났다. 알칼로이드 중 nomicotine, anatabine, myosmine 및 P-formylnomicotine^]경우 다른 잎담배 종류에 비해 국내산 버어리종에서 현저하게 높은 함량을 차지하였으며, 버어리종과 오리엔트종의 경우에는 nomicotine의 함량이 anatabine의 함량보다 높게 나타나 황색종과는 다른 경향을 나타내었다.
- 알칼로이드 표준용액을 GC/MS/SIM 분석 후 검량선을 작성한 결과, 상관계수(I©은 0.995〜1.000 범위로 높은 직선성을 나타내었다. 알칼로이드 회수율은 내부표준물질을 포함하여 알칼로이드 표준용액을 잎담배에 첨가한 후 추출하여 실험하였다.
- 버어리종 중 미국산과 국내산을 비교해볼 때 nornicotine, myosmine 및 P-formylnomicotine 함 량은 국내산이 높게 나타났으나, nicotine 및 다른 미량 알칼로이드는 미국산이 높게 나타났다. 오리엔트종 중 nicotine, nomicotine, anatabine 및 다른 미량 알칼로이드의 함량은 대체적으로 바스마 > 카테리니 > 카바쿨락 순으로 나타났다.
- 8%의 범위를 나타내었다. 이상의 결과로부터 설정된 추출법으로 전처리 후 GC/MS/ SIM 분석하는 방법은 10개 알칼로이드 분석에 적용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 일반적으로 알칼로이드 분석 시 내부표준물질로는 n-dodecane, n-heptadecane, 2, 4'-dipyridyl 등이 사용되는데 이들의 알칼로이드 추출법을 이용한 잎담배 적용시험 결과, n~heptadecane은 잎 담배 중에 미량 존재하였고 2, 4, -dipyridyl 은 2, 3'-dipyridyl와 근접하여 검출되어 n-dodecane 이 내부표준물질로 가장 적합하였다.
- 잎담배 종류별 알칼로이드 함량은 대체적으로 버어리종 > 황색종 > 오리엔트종 순이었다. 알칼로이드 중 nomicotine, myosmine, 2, 3'- dipyridyl, p-formylnomicotine^| 경우 다른 잎담배 종류에 비해 버어리종에서 높은 함량을 나타내었다.
- 또한 알칼로이드에 대한 감도 및 선택성을 높이기 위하여 GC/MS의 selected ion monitoring (SIM) mode로 분석하였다. 황색종, 버어리종, 오리엔트종 등 11종의 잎담배 알칼로이드 함량을 분석한 결과, 잎담배 종류별 알칼로이드 함량은 대체적으로 버어리종 > 황색종 > 오리엔트종 순으로 나타났다. 알칼로이드 중 nomicotine, anatabine, myosmine 및 P-formylnomicotine^]경우 다른 잎담배 종류에 비해 국내산 버어리종에서 현저하게 높은 함량을 차지하였으며, 버어리종과 오리엔트종의 경우에는 nomicotine의 함량이 anatabine의 함량보다 높게 나타나 황색종과는 다른 경향을 나타내었다.
후속연구
- Methanol 와 dichlorome- thane를 혼합하여 용해도와 극성도를 조절한 결 과, 모든 알칼로이드에 대하여 높은 추출 효율을 나타내었으며, 이는 Yang 등(2002)의 결과와도 잘 부합되는 것이었다. 따라서 잎담배 중 미량으로 존재하는 알칼로이드까지도 동시에 분석하는데 methanol : dichloromethane(1:3, v/v) 혼합용매를 사용한 추출법이 적용될 수 있을 것으로 사료 된다.
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