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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 현재 시판되는 파클리탁셀 주사제 (Taxol®) 보다 우수한 제제를 개발하고자 이ycofuol, Solutol® HS 15 및올레인산으로 상평형도를 작성하여 이를 바탕으로 열역학적으로 안정한 파클리탁셀 나노입자수송체를 제조하였다. 제조된 나노입자 수송체의 입자크기 , 장기 안정성 및 약물의 체내 동태를 조사하여 주시제로서의 가능성을 평가하였다.
- 제조하였다. 제조된 나노입자수송체의 입자크기 , 장기 안정성 및 약물의 체내 동태를 조사하여 주사제로서의 가능성을 평가하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 1. 상평형도 실험 결과 glycofuol(또는 올레인산와 glycofurol), Solutol® HS 15 및 물의 비를 34:40:26으로 미셀과 마이크로에멀젼을 제조하였다.
- 230〜260 g의 수컷 Sprague Dawley계 흰쥐를 사용하여 대퇴정맥과 동맥에 three way cock 이 달린 PE-10 tube를 삽입하여미셀(A-l, A-2)과 마이크로에멀젼 제제(B-1)를 파클리탁셀로서 5 mg/kg의 용량이 되도록 주사하였다. 투여 후, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 및 120 분에 500 以씩 채혈하여 즉시 3, 000 rpm에서 10 분간 원심분리시켜 혈장을 얻었으며 분석할 때까지 냉동 보관하였다.
- 검액은 표준혈장용액과 동일한 방법으로 조제하였으며 얻어진 표준혈장 용액을 질소가스로 건조시킨 후, 메탄올에 녹여 HPLC 로 분석하여 파클리탁셀 피크면적酔)과 내부표준물질(IS)의 피크 면적 비(EA/IS)로 검량선을 작성하고 이를 이용하여 검액의 약물농도를 측정하였다.
- 그리고 중성인 pH 7 이상에서는 약물의 분해속도가 현저히 증가함을 보여주었다. 따라서 파클리탁셀 주사제를 제조할 때 적절한 산을 가하여 제제의 pH를 5.0~5.5로 조정하였다.
- B-2). 또한 친유성 항산화제로 D-a-토코페롤을 6% 함유하도록 첨가하여 제조하였다(C-2).
- 물리적인 안정성을 평가하기 위하여 0과 24시간 후에 동적 광 산란법을 이용한 ELS-8000을 사용하여 평균입자크기와 입도 분포를 측정하였다.】京6)
- 미리 작성된 상평형도에 따르는 안정한 영역을 바탕으로 Table I의 처방에 따라 glycofurol, Solutol® HS 15, 생리식염수를 사용하여 Scheme 1과 같은 방법으로 제조하였다. 즉 파클리탁셀을 glycofurol에 용해시켜 pH 4.
- 미셀 시스템에서는 용해 보조제로 glycoforol, 계면활성제로 Solutol® HS 15, 수상으로는 생리식염수를 사용하였다. 파클리탁셀을 포함하는 glycofurol과 Solutol® HS 15의 비율을 고정시킨 후 수상을 첨가하면서 안정한 미셀이 형성되는 영역을 관찰하였으며, 1*3)형성된 미셀을 생리식염수에 io배 희석하였을 때 24시간 동안 침전이 일어나지 않는 영역을 선택하여 상평형도를 작성하였다.
- 상온과 40°C에서 0, 6, 13, 20 및 30일째마다 제조된 제제 0.5 g을 정확히 취하고 메탄올 50mZ를 가하여 희석시킨 다음, 0.45 nm 세공의 막 여과기로 여과시킨 후 HPLC로 약물의 잔존량을 측정하였다.
- 상평도에 의하여 Table I의 처방에 따라 유상으로 올레인산과 glycofurol에 약물을 가용화시켜 미셀과 동일한 방법으로 제조하였다(B-l, B-2). 또한 친유성 항산화제로 D-a-토코페롤을 6% 함유하도록 첨가하여 제조하였다(C-2).
- 안정한 pH에서 파클리탁셀 주사제를 제조하기 위해서 pH 변화에 따른 파클리탁셀의 안정성을 시험하였다.
- 이상의 결과를 바탕으로 미셀은 용해보조제, 계면활성제 및 물의 비를 각각 34: 40 : 26으로 마이크로에멀젼은 오일, 용해보조제, 계면활성제와 물의 비를 6:28:40:262로 하여 제조하였다.
- 파클리탁셀 나노입자수송체를 제조하였다. 제조된 나노입자 수송체의 입자크기 , 장기 안정성 및 약물의 체내 동태를 조사하여 주시제로서의 가능성을 평가하였다.
- 제조된 미셀과 마이크로에멀젼 제제를 상온과 40°C에서 0, 6, 13, 20 및 30일째의 약물의 잔존량을 측정하여 Eble II에 나타내었다. 즉 미셀과 마이크로에멀젼 제제는 상온과 40°C에서 각 제제 간의 큰 차이가 없이 97% 이상의 잔존율을 나타내며 매우안정하였다.
- 용량이 되도록 주사하였다. 투여 후, 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 및 120 분에 500 以씩 채혈하여 즉시 3, 000 rpm에서 10 분간 원심분리시켜 혈장을 얻었으며 분석할 때까지 냉동 보관하였다. 파크리탁셀을 메탄올에 용해시키고 적당한 농도로 희석하여 표준용액을 제조하였다.
- 5 로 조정하여 60°C에서 10분간 가온하고 3시간 동안 교반하여 제조하였다(A-l, A-2). 특히 제제의 안정성을 개선하기 위하여 친수성 항산화제로 sodium bisulfte와 금속이온의 킬레이트제인 EDTA sodium을 각각 0.01%씩 함유하도록 첨가하여 제조하였다 (C-1).
- 파클리탁셀 30mg을 glycofiirol/Solutol® HS 15/생리식염수 (34:40:26)에 가용화시켜 미셀을 제조한 후, 이 용액을 1g씩 취하여 Mcllvaine 완충 용액에 희석하여 50 m/로 하여 10 m/씩 바이알에 충진한 후, 40°C에 보관하면서 0, 24 및 48시간에 남아 있는 파클리탁셀의 양을 HPLC로 측정하였다.
- 파클리탁셀을 포함하는 glycofurol과 Solutol® HS 15의 비율을 고정시킨 후 수상을 첨가하면서 안정한 미셀이 형성되는 영역을 관찰하였으며, 1*3)형성된 미셀을 생리식염수에 io배 희석하였을 때 24시간 동안 침전이 일어나지 않는 영역을 선택하여 상평형도를 작성하였다.
- 미셀 시스템과 같았다. 파클리탁셀을 포함하는 올레인산과 glycofurol의 혼합액(18:82)과 Solutol® HS 15의 비율을 고정시킨 후 수상을 첨가하면서 안정한 마이크로에멀젼이 형성되며 또한 희석 후에도 안정한 영역을 관찰하였다.
- 현재 시판되는 파클리탁셀 주사제보다 우수한 제제를 개발하기 위하여 glycofurol, Solutol® HS 15 및 올레인산로 싱평형도를 작성하여 이를 바탕으로 열역학적点 안정한 파클리탁셀 나노입자 수송체를 제조하였다. 제조된 나노입자수송체의 입자크기 , 장기 안정성 및 약물의 체내 동태를 조사하여 주사제로서의 가능성을 평가하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 수컷 Sprague Dawley계 흰쥐(230~260 g)를 대한 실험동물센터에서 구입하여 1주일간 순화기간을 거친 후, 건강한 동물만을 시험 대상으로 선정하여 12시간 동안 절식하여 사용하였다.
- 시약으로 파클리탁셀(Eclitaxel)은 삼양 제넥스(대전, 한국)로부터, glycofurol(tetrahydrofurfuryl alcohol polyethyleneglycol ether, Tetraglycol), D(+) trehalose, sodium bisulfite 및 ethylenediaminetetraacetic acid(이하 EDTA, disodium salt) 는 Sigma(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, Solutol® HS 15(Polyethylene glycol 660 hydroxystearate)는 BASF(Ludwig- shafen, Germany), 디아제팜은 대원제약(서울, 한국) 그리고 D- a-토코페롤은 상현화학서울, 한국)에서 각각 공급받아 사용하였다. Tertiary butyl methyl ether, 메탄올 및 아세토니트릴 (HPLC grade) 등의 용매와 그 외의 시약은 특급 또는 일급을 사용하였다.
성능/효과
- 2. 파크리탁셀은 pH 5에서 가장 안정하였으며 pH 7 이상에서는 현저히 불안정하였다.
- 3. 입도분포는 A-l, A-2 및 B-1 제제에서 0시간과 24시간 후각각 10-25, 10-27 및 9~56nm 그리고 9~36, 10-33 및 10~50nm으로 물리적으로 안정하였으나 올레인산과 트레할로오즈를 같이 사용한 B-2 제제에서는 24시간 이후 입자의 크기가 증가하였다. 또한 안정화제가 첨가된 C-1 과 C-2도 물리적으로 안정하였다.
- 4. 나노입자의 안정성 실험 결과 제제 간에 큰 차이 없이 상온과 40°C에서 매우 안정하였다.
- 5. 파클리탁셀의 혈장 중 농도곡선은 2-compartment model의 양상을 보였으며 A-l, A-2 및 B-1 제제의 AUC와 Clt 값에서는 큰 차이가 없었으나 Tv2(느 각각 36, 37 및 57 min 으로 미셀제제보다 마이크로에멀젼제제에서 상대적으로 길었다. 또한 Vss는 116, 110 및 185 ml으로 B-1 에서 상대적으로 큰 값을 나티내었다.
- 2에 나타내었다. 넓은 영역에 걸쳐 안정한 마이크로에멀젼이 형성되었으나 올레인산/glycofurol (18:82), Solutol® HS 15 및 물의 비가 전체 증량비로서 20~ 35 : 40~50 :15~40인 마이크로에멀젼 영역만이 생리식염수로 희석 후 24시간 방치하였을 때 투명한 상으로 그 계를 유지하였다.
- 입자증가의 원인은 유상인 올레인산과 수상에 첨가된 트레할로오즈의 영향으로 파크리탁셀의 용해도가 감소되어입자크기가 커진 것으로 사료되며 수상에 트레할로오즈를 첨가하지 않고 제제화한 경우(A-l, B-1)에는 입자크기에 큰 영향을 미치지 않았다. 또한 미셀제제가 마이크로에멀젼 제제보다 입자크기가 작음을 확인할 수 있었다.
- 1 m//min이었다. 또한 조직으로의 약물분포정도를 알 수 있는 Vss는 A-l, A-2 및 B-2 제제에서 각각 116, 110 및 185 m/로서 마이크로에멀젼 제제가 상대적으로 큰 값을 나타내었다.
- 마이크로에멀젼 제제의 입도분포는 B-1 제제의 경우 희석 후 시간이 경과하여도 입도 분포에 큰 변화가 없었지만 유상인 올레인산과 수상에 첨가된 트레할로오즈를 같이 사용한 B-2 제제는 24시간이 경과하였을 때 6251-11850 nm로 입자크기가 크게 증가하였다. 입자증가의 원인은 유상인 올레인산과 수상에 첨가된 트레할로오즈의 영향으로 파크리탁셀의 용해도가 감소되어입자크기가 커진 것으로 사료되며 수상에 트레할로오즈를 첨가하지 않고 제제화한 경우(A-l, B-1)에는 입자크기에 큰 영향을 미치지 않았다.
- 미셀 시스템에서 용해보조제인 glycofurol과 계면활성제로서 Solutol® HS 15를 사용하여 작성한 상평형도는 Fig. 1에서와 같이 넓은 영역에 형성되었으나 glycofurol, Solutol® HS 15 및 물의 비가 전체 중량비로서 20〜50 :30~50 :20〜30인 미셀만이생리식염수에 희석 후 24시간이 경과하였을 때 약물이 침전되지 않고 투명한 상태로 안정하게 유지되었다.
- 미셀제제의 입도 분포의 경우 A-1 제제는 0과 24시간에서 각각 10-25 및 9~36 nm, A-2 제제는 0과 24시간에서 각각 10- 27 및 10-33 nm의 분포를 나타내어 입도 분포에서 큰 변화가 없었으므로 주사제로 적용할 때 희석하여 일정 시간이 지나도 물리적으로 안정하게 분산될 수 있음을 예상할 수 있었다.
- 즉 미셀과 마이크로에멀젼 제제는 상온과 40°C에서 각 제제 간의 큰 차이가 없이 97% 이상의 잔존율을 나타내며 매우안정하였다.
- 파클리탁셀의 양5] 5mg/kg가 되도록 미셀과 마이크로에멀젼 제제를 정맥주사한 후 각 시간별로 혈장 중의 약물농도 분포를 나타낸 결과 혈장중약물농도곡선은 모두 비슷한 양상으로 전형적인 2-compartment model을 나타내었다(Fig. 5).
후속연구
- 이상의 결과로부터 , 나노입자시스템으로서의 미셀과 마이크로에멀젼 제제는 물리화학적으로 안정하며 기존제제보다 우수한 파클리탁셀 주사제로 활용될 수 있으리라 기대된다.
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