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문제 정의
- 또한 일반적으로 세정제에 사용되는 계면활성제들을 저자극성으로 선택하더라도 완벽하게 자극을 없애는 것은 불가능하다. 본 연구에서는 이러한 물질들이 유발하는 자극을 다른 자극완화제를 첨가함으로서 극복할 수 있을 것이라 가정하고, 자극완화제로서는 여러가지 종류의 천연물 성분이나 보습성분들 가운데 자극완화 및 보습 능력이 우수하다고 알려진 마치현 추출물[7, 8]과 프럭탄[9-14]을 각각 사용하여 세정제의 잔존하는 자극을 제거 하고자 시도하였다.
- 상기 조성물의 체계적인 선별을 통한 저자극성 액체 세정제 개발을 위하여 단백질 변성 실험, 폐첩포 실험 및 단층 배양, 진피 배양(dermal equivalent), 3차원 생인공 피부(skin equivalent)를 이용한 MTT assay 그리고 염증 인자인 인터루킨Ta의 분비량 측정과 같은 다탐색법을 이용하여 실제 피부에서의 자극성을 확인하였고 연구결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 사람 섬유아세포(human normal fibroblast, ATCC, CRL-2703)를 1 x-105 cell/mL로 24li"bl&te에 소태아 혈청 (Gibco) 이 10% 함유된 DMEM (dulbecco's modified eagles media, Gibco)을 이용하여 접종한다. 1일 후 혈청이 2% 첨가된 새 DMEM 배지로 갈아주면서 시료를 농 도별로 처리한다.
- 14개의 계면활성제와 13종의 기존 액체 세정제 상품을 단층 배양을 통한 MTT assay로 세포 독성을 측정하였다(데이타 없음). 그 결과 독성이 작은 5개의 계면활성제와 2종의 액체 세정제 상품을 선택하였으며, 선택된 계면 활성제는 소듐 라우릴 설페이트(음이온), 소듐 코코일이 세티오네 이트(음이온), 소듐 라우로암포아세 테이트(양쪽성 이온), 코코아미도프로필 베타인(양쪽성이온), 그리고 알 킬 폴리글리코시드(비이온)였다.
- 첩포 제거 후 피부를 흐르는 물에 씻은 후 30 min 경과 후 나타나는 홍반을 평가 기준에 의하여 판정하고 평균 자극값을 나타낸다. 20명의 피시험자에 대한 점수를 매긴 뒤, 아래와 같이 평균피부자극범위 (average skin irritation range) 를 계산하여 피부 자극 정도를 판단한다.
- 계 면활성 제 4종, 알킬에테르설페이트와 알킬아미노프로필베타인, 알킬폴리글리코시드, 지방산 알카놀아마이드를 기본으로 제조된 제형 5번은 세포 독성과 염증 유발 인자인 IL-la의 분비량 측정 비교 실험에서 다른 제형들보다 자극이 낮게 나왔으며, 13종의 기존 세정제 제품들 중에서 선택된 두 종의 저자극 세정제와 비슷한 결과를 보였다. 그리고 저자극의 계면활성제를 선택했다 하더라도 그 자체가 자극원이기 때문에 자극완화 능력과 보습효과가 뛰어난 마치현 추출물과 프럭탄을 첨가하여 세정제에 의한 자극을 낮추는 실험을 실시하여, 마치현 추출물과 프럭탄을 각각 5% 첨가한 제형에서 계면활성제에 의한 자극을 완화시켰다. 이와 같이, 다탐색법을 이용하여 저자극성을 가짐과 동시에 건조한 피부를 개선하고 가려움 및 염증을 완화 또는 예방할 수 있는 액체 세정제의 조성물을 개발하였다.
- 항염과 보습 효과가 뛰어난 마치현 추출물과 프럭탄을 첨가한 제형 5는 Figure 7에서와 같이 마 치현 추출물 5%와 프럭탄 3% 또는 5%를 첨가했을 경우 세포독성이 완전히 없어지는 것을 확인하였다. 그리고 제형 5번에 메칠파라벤 0.1%와 마치현 5%, 프럭탄 3% 또는 메칠파라벤 0.1%와 마치현 5%, 프럭탄.5%를 첨가 한 제형을 실제 사람 피부와 매우 흡사한 조건에서의 세포 독성과 피부 자극 정도를 알아보기 위해 3차원 생인 공 피부 모델을 이용하여 세포 독성과 염증인자인 IL-la 의 분비량을 기존 제품 A 및 B사와 비교하였다. Figure 8에서와 같이, 세포의 독성은 A사와 비교시 약 10% 높으나, 염증인자인 ILTa 분비량의 경우, 마치현 추출물과프럭탄이 첨가된 제형 5가 비슷한 세포 독성을 보인 B사 보다 적게 분비되었으며, A사와 비슷한 수치를 보였다.
- 기존의 세정제 제품과 비교 실험하기 위해, 제형 5와 16에 대하여 진피 배양으로 세포 독성과 염증인자인 ILTa의 분비량을 측정하였다. 인터루킨Ta(interleukin-la, ILTa)는 전염증성조절인자(proinflammatory mediator)로 작용하는 세포간 신호물질(사이토카인)로, 피부가 자극성 물질에 노출되었을 때, 염증반응의 일환으로 대식세포, 단핵세포 등의 진입을 유도하기 위하여 골형성세포, 각질형 성 세포, 간세포, 섬유아세포 등이 일시적으로 증가 생산한다.
- 156%일 경우에 제형 5와 16이 가장 낮은 세포 독성을 보이고 있다. 따라서 이 두 제형을 다음 실험에 선택하여 기존의 제품과 비교 실험하기로 했다.
- 1 mL을 가하여 임의의 성인 남녀 20명의 팔 안측에 부착하고 약 24 h 경과 후 제거한다. 또한 피부 자극성이 있다고 알려진 알킬에테르설페이트 0.25%와 0.05%의 분산액을 보다 정확한 비교를 위해 같이 실험한다. 첩포 제거 후 피부를 흐르는 물에 씻은 후 30 min 경과 후 나타나는 홍반을 평가 기준에 의하여 판정하고 평균 자극값을 나타낸다.
- 메칠파라벤 0.05%가 첨가된 제형 5(농도는 0.117%)에 마치현 추출물과 프럭탄을 농도별로 첨가하여 세포 독성 실험을 하였다. 항염과 보습 효과가 뛰어난 마치현 추출물과 프럭탄을 첨가한 제형 5는 Figure 7에서와 같이 마 치현 추출물 5%와 프럭탄 3% 또는 5%를 첨가했을 경우 세포독성이 완전히 없어지는 것을 확인하였다.
- 그 후 인서트 내의 배지를 제거하여 표피 세포의 분화를 유도한다. 분화된 표피 세포는 각질을 형성하고 14 일 후 시료를 24 h 처리하여 시료에 의한 독성을 측정한다. 생인공 피부 배양 시에는 10% 소혈청이 첨가된 DMEM 배지와 K-SFM (keratinocyte-serum free medium, Gibco)을 1 : 1로 섞은 배지로 배양한다.
- 세포 독성과 피부 자극이 적게 나온 제형 5, 16, 18, 20과 비교제형 7을 세포 배양에 의해 구축된 진피 배양에 서의 세포 독성을 알아보기로 하였다. Figure 4의 결과에서 보듯이 희석 농도가 1.
- 세포독성이 낮은 제형 5, 16, 18, 20과 비교제형 7을 선택하여 실제 피부에서의 자극성을 알아보기 위해 폐첩포 테스트를 실시하였다. Table 4에서 나타난 바와 같이 제형 5, 16, 그리고 18이 모두 피부에 자극이 매우 적음을 알 수 있다.
- 위의 결과를 통해 여러가지 액상 조성물 중에서 단백질 변성율이 낮은 제형 8종과 비교제형 4종을 선택하여 좀더 피부에 근접한 결과를 얻기 위해 세포독성실험을 실시하였다. Figure 3에서 제형 농도 0.
- 그리고 저자극의 계면활성제를 선택했다 하더라도 그 자체가 자극원이기 때문에 자극완화 능력과 보습효과가 뛰어난 마치현 추출물과 프럭탄을 첨가하여 세정제에 의한 자극을 낮추는 실험을 실시하여, 마치현 추출물과 프럭탄을 각각 5% 첨가한 제형에서 계면활성제에 의한 자극을 완화시켰다. 이와 같이, 다탐색법을 이용하여 저자극성을 가짐과 동시에 건조한 피부를 개선하고 가려움 및 염증을 완화 또는 예방할 수 있는 액체 세정제의 조성물을 개발하였다.
- 05 N NaOH)을 7:2:1로 섞어 만든 용액과 사람 섬유 아세포를 1 X 104 cell/mL의 밀도로 혼합하여 12 well plate에 넣어 인공진피를 제조한다. 이틀마다 한번 씩 Vit- C (50 iig/mL, Sigma)가 들어간 배지로 갈아 주면서 7일째 시료를 농도별로 처리하였다. 3일 배양 후 배지를 버 리고 MTT (0.
대상 데이터
- 선택된 5개의 저자극성 계면활성제로 20종의 제형을 제조하였다. Table 1과 Table 2에 나타난 조성으로 각각 제 형 1 ~20 및 비교제형 1 ~7의 세 제 조성 물을 제조하였다. Table 1은 알킬에테르설페이트와 알킬아미노프로필 베타인, 알킬폴리글리코시드, 지방산 알칸올 아마이드를 기본으로 제조된 제형 1 ~ 9 및 비교제형 1 ~ 3을 나타내었다.
- 14개의 계면활성제와 13종의 기존 액체 세정제 상품을 단층 배양을 통한 MTT assay로 세포 독성을 측정하였다(데이타 없음). 그 결과 독성이 작은 5개의 계면활성제와 2종의 액체 세정제 상품을 선택하였으며, 선택된 계면 활성제는 소듐 라우릴 설페이트(음이온), 소듐 코코일이 세티오네 이트(음이온), 소듐 라우로암포아세 테이트(양쪽성 이온), 코코아미도프로필 베타인(양쪽성이온), 그리고 알 킬 폴리글리코시드(비이온)였다.
- MTT 시약을 처리하기 직전, 배지를 수거하여 인터루킨-la의 분비량 측정 실험에 사용한다. 사람 인터루킨Ta ELISA 키트(Endogen사)를 사용하였으며, 키트의 매뉴얼에 따라 동결 건조된 E. coli 유래의 재조합 사람 IL-la 를 표준물질로 사용하고, 상온에서 1 h 동안 사람 IL-lff 항체와 반응시킨 후 비오틴(biotin)이 결합된 2차 항체와 재반응시킨다. 그 후 Streptavidin-HRP (horse-radish per- oxidase)를 30 min 처리 후 TMB(trimethylbenzidine)용액으로 기질 반응을 시킨 후 ELISA reader로 450 nm에서 측정한다.
- 선택된 5개의 저자극성 계면활성제로 20종의 제형을 제조하였다. Table 1과 Table 2에 나타난 조성으로 각각 제 형 1 ~20 및 비교제형 1 ~7의 세 제 조성 물을 제조하였다.
성능/효과
- 또한 암포아세테이트를 다른 양쪽성 계면활성제인 알킬아미노프로필베타인으로 부분 대체할 경우 역시 제형 13, 14, 18, 19 및 20에서와 같이 낮은 단백질 변성율을 확인할 수 있다. 결과적으로 양쪽성 계면활성제인 암포아세테이트를 이용하였을 때 음이온 계면활성제와의 일정의 혼합비 영역에서 매우 낮은 피부 자극을 보여줌을 알 수 있다.
- 계 면활성 제 4종, 알킬에테르설페이트와 알킬아미노프로필베타인, 알킬폴리글리코시드, 지방산 알카놀아마이드를 기본으로 제조된 제형 5번은 세포 독성과 염증 유발 인자인 IL-la의 분비량 측정 비교 실험에서 다른 제형들보다 자극이 낮게 나왔으며, 13종의 기존 세정제 제품들 중에서 선택된 두 종의 저자극 세정제와 비슷한 결과를 보였다. 그리고 저자극의 계면활성제를 선택했다 하더라도 그 자체가 자극원이기 때문에 자극완화 능력과 보습효과가 뛰어난 마치현 추출물과 프럭탄을 첨가하여 세정제에 의한 자극을 낮추는 실험을 실시하여, 마치현 추출물과 프럭탄을 각각 5% 첨가한 제형에서 계면활성제에 의한 자극을 완화시켰다.
- 따라서 시험물질 처리 후에 IL-la 의 생성량을 측정하여 비교하면 염증 또는 자극의 정도를 간접적으로 측정하는 방법으로 사용될 수 있다. 실험 결과, 제형 5와 16은 기존 제품 A사 및 B사와 비교시 월등히 낮은 세포 독성을 보이고 있으며, 0.078%일 경우 제형 5는 거의 세포 독성을 보이지 않고 있다(Figure 5). 그리고 염증 유발 물질 분비 측정에서 대조구, 즉 아무것도 처리하지 않았을 경우의 농도가 3 pg/mL인 것을 감안한다면 제형 5의 경우는 상당히 저자극의 제형임을 알 수 있다(Figure 6).
후속연구
- 또한 IL-la는 상처의 재상피화(re-epithelialization)의 잠재적인 유도체로서 작용할 뿐만 아니라, 알러지 반응과 염증성 반응 조절인자로서 백혈구 운동을 촉진시키는 류코트리엔 B% 5-, 12-, 15-HETE (hydroxyeicosatetraenoic acid)같은 아라키돈산 리폭시게나제 대사 산물 생산을 증진시키는 것으로 알려져 있다[15, 16]. 따라서 시험물질 처리 후에 IL-la 의 생성량을 측정하여 비교하면 염증 또는 자극의 정도를 간접적으로 측정하는 방법으로 사용될 수 있다. 실험 결과, 제형 5와 16은 기존 제품 A사 및 B사와 비교시 월등히 낮은 세포 독성을 보이고 있으며, 0.
- 이와 같이, 보다 저자극성 액체 세정제를 만들기 위한 여러 종류의 계면활성제들이 알려져 있으나 소듐 코코일 이 세티오네 이 트(SDI), 디 소듐 라우릴 설포석 시 네 이 트(DLS), 아실-N-메틸타우레이트(AMT), 아실글루타메이트(AG) 계통의 저자극 음이온 계면활성제와 비이온 및 양쪽성 계 면활성제를 일정 비율의 조성 차이를 비교하여 피부자극 이 완화된 액체 세정제를 개발하려는 연구는 부족한 실정이다. 따라서 이러한 계면활성제들의 피부 자극에 대한 특성을 파악하고 조성물의 조합을 통하여 피부자극성이 낮은 세정제 조성물에 대한 연구가 더욱 필요하다.
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